Method Article
Enfeksiyon süreci boyunca, önemli bir adım patojenlerin konak hücrelerine yapışma. Çoğu durumda bu yapışma adım akan sıvı tarafından üretilen mekanik stres varlığında oluşur. Biz kayma gerilmesi bakteriyel yapışma çalışmada önemli bir parametre olarak tanıtan bir tekniktir açıklar.
Bakteriyel enfeksiyonlar sırasında patojen ve ev sahibi arasındaki etkileşimlerin bir dizi oluşur. Patogenezinde konak hücre yüzeyine bakteriyel yapışma genellikle ilk ve belirleyici bir adımdır. Deneysel yapışma çoğunlukla statik koşullarda eğitim olmasına rağmen yapışma aslında akan sıvı varlığında gerçekleşir. Bakteri ve ev sahibi arasında ilk karşılaştığında genellikle mukus epitel hücrelerinin yüzeyi boyunca akan mukozal düzeyde, ağız, akciğer, bağırsak, göz, vs meydana gelir. Daha sonra enfeksiyon, patojenlerin bazen hayatı tehdit eden septisemi, sepsis ve menenjit gibi hastalıklara neden kan dolaşımını erişmek. Bu enfeksiyonların bir belirleyici özelliği, bu patojenlerin kan dolaşan varlığı endotel hücreleri ile etkileşim yeteneği. Patojen mekanik bir güç üretir, çünkü, örneğin sıvı, mukus veya kan akan varlığı, yapışma belirler. Sıvı bir akan etkisi karakterize etmek için genellikle dynes / cm 2 olarak ifade sabit bir duvarına yakın hareket eden bir sıvı, birim alan başına sarf teğet güçtür kayma gerilmesi, kavramı ifade eder. Kayma gerilmesi Şiddetleri farklı damarları türüne göre büyük farklılıklar gösterir, boyut, organ, konumu vb (0-100 dynes / cm 2). Kılcal damarlarda kan dolaşımı çok düşük kayma gerilmesi değerlerine ulaşmak ve hatta geçici olarak birkaç dakika 1 birkaç saniye arasında değişen dönemlerde durdurabilirsiniz. Arteriollerde spektrum kayma gerilmesi Diğer taraftan 100 dynes / cm 2 2 ulaşabilirsiniz. Örneğin gibi farklı biyolojik süreçlerin kayma gerilmesi etkisi açıkça lökositlerin endotel 3 ile etkileşim sırasında kanıtlanmıştır. Bakteriyel yapışma sürecinde bu mekanik parametre dikkate almak için tek bir akış kullanımı odasının 4 dayalı deneysel bir prosedür avantaj aldı. Konak hücrelerine akış odasında yetiştirilen ve floresan bakterilerin bir şırınga pompası tarafından kontrol akış tanıtıldı. Biz başlangıçta bakteriyel patojen Neisseria meningitidis, septisemi ve menenjit sorumlu bir Gram-negatif bakteri soruşturma duruldu. Bize bakterilerin yeteneği üzerinde kayma stres üzerindeki etkilerini incelemek için izin prosedürü burada açıklanan hücre yüzeyinde 5 prolifere hücreler 1, uymak ve yeni siteler 6 (Şekil 1) kolonize ayırmak için. Tamamlayıcı teknik bilgiler referans 7 bulunabilir. Burada sunulan Kesme gerilmesi değerleri, literatürde bulunan değerleri temsil etmek için önceki deneyimi 1 ve dayalı seçildi . Protokol geniş bir yelpazede çalışma hedeflerine bağlı olarak belirli ayarlamalar ile patojenler için geçerli olmalıdır.
1. İnsan konak hücre ve bakteri kültürü
2. Bireysel bakteriler ilk yapışma hücreleri ev sahipliği yapacak
Video 1 veya 3 rakam örneği için Bkz. Bu adımdan sonra, bölüm 3, 4 veya 6 ya kadar hareket ettirin.
3. Konak hücreleri için bireysel bakterilerin ilk yapışma Niceleme
4. Konak hücreleri için yapışık bireysel bakterilerin akış direnci Ölçüm
5. Microcolony için izole bir yapışkan bakteri büyüme Ölçüm
6. Yapışık bakteriyel mikrokoloniler akış direnci ölçümü
Videolar 3 ve 4 pilV mutant vahşi tip suşu karşılaştırın.
7. Mikrokoloniler gelen Bakteriyel dekolmanı
8. Temsilcisi sonuçları
Şekil 1: Farklı adımları prosedürü akış varlığı gözlenen ve ölçülebilir bir hücresel tek tabaka.
Şekil 2: (kayma gerilmesi yokluğu) bir deney başında akışını odasında Endotel hücre tek tabaka. Hakkında 50 endotel hücreleri, bir alt-konfluent tek tabaka düzenlenmektedir.
Şekil 3: hücre yüzeyinde bakterilerin ilk yapışma grafik gösterimi. Üç alanlar için Değerler (0044 dynes / cm 2) bekleniyor alan-alan varyasyon bir fikir vermek için gösterilir.
Video 1 (0044 dynes / cm 2) zamanın bir fonksiyonu olarak hücresel tek tabaka bakterilerin ilk yapışma Görselleştirme. GFP-ifade bakteriler akan orta yönünü takip ediyoruz. Film 60 kat hızlanır, gerçek video süresi 10 dakikadır.
Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Video 2 ilk yapışma bakteri sonra 7 saatlik bir süre için (1000 kat hızlandırılmış) hücre yüzeyinde tomurcuklanmaya izin verildi .
Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Video 3 Silahların Yayılmasının Önlenmesi sonra hücresel yüzey mekanikmikrokoloniler al direnç ama vahşi tip mikrokoloniler dayanıklı hızlandırılmış 60 kat, 5 dakika 10 dynes / cm 2 kesme stres düzeyini artırarak tarafından test edildi .
Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
PilV mutant tarafından oluşturulan video 4 mikrokoloniler akışını artırmak (10 dynes / cm 2) tarafından bozulur. Bu mutant mikrokoloniler altında plazma zarı yeniden şekillenme ikna etmek için başarısız olur ve böylece daha artmış shear stresin (video 60 kat hızlanır) 5 son derece hassas.
Videoyu izlemek için buraya tıklayın.
Kayma gerilmesi ve genellikle biyoloji mekanik yönlerini önemi giderek kabul edilmektedir. Örneğin lenfositler yapışma ve damar duvarının üzerinde yuvarlanan süreci proteinlerin selektin ailesi son derece adapte yapıştırıcı özellikleri, bu süreç içinde kayma gerilmesi tanıtan kabul edilmiştir. Gram-negatif bakteriler Neisseria meningitidis yukarıda açıklanan prosedür uygulandı ancak geniş bir yelpazede patojenlerin uygulanabilir olmalıdır. Kayma gerilmesi önemi diğer patojenler ve diğer enfeksiyon siteleri için de gösterilmiştir. Bakteriyel yapışma kayma gerilmesi klimalı üropatojen Escherichia coli (UPEC) 9 bulundu FimH adhesin çalışma ile tarif edilmiştir. Selektinler benzer şekilde, FimH ve konak hücre reseptör arasındaki etkileşimi kesme bağlı mekanik kuvvetlerin 9 ve enterotoksijenik E.coli CfaE adhesin güçlendirilmelidir gösterildi bağımlı bir kayma ile bağırsak epitel hücrelerine yapışma aracılık etmek de bildirilmiştir mekanizması 10. Streptococcus agalactiae pili 11 akış koşulları altında epitel hücreleri bu patojen bağlılık için gerekli olduğunu bu bölümde açıklanan laminer akış odasına tahlil protokol kullanarak bildirdi. Bu çalışmalar bizim akışı odasına tahlil kayma gerilmesi koşulları altında konak hücre-patojen etkileşimleri araştırmak için faydalı bir araç olduğunu teyit etmektedir.
Çıkar çatışması ilan etti.
Yazarlar prosedürünün başlangıç ayarı için Emilie Mairey ve Emmanuel Donnadieu teşekkür etmek istiyorum.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
μ-Slide VI 0.4 akış kiti | IBIDI | 80606 | |
Şırınga Plastipak 50 ml Luer-Lock | Becton Dickinson | 300865 | |
Tygon Boru R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher-Bilimsel | R3603 | |
Erkek luer 3-yollu valfli, 2 dişi luer | Bio-Rad | 7328103 | |
Şırınga pompası | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
Ters mikroskop Nikon | Nikon | Eclipse T i | |
CCD kamera | Hamamatsu | ORCA 285 CCD veya ORCA 3-CCD | |
ImageJ yazılımı | NIH | SORULAR VE CEVAPLAR ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır