세균성 접착 연구에 전단 응력을 소개합니다

요약

감염 과정에서 핵심적인 단계는 호스트 세포로 병원균의 접착합니다. 대부분의 경우에서는이 유착 단계는 액체를 흐르는 의해 생성된 기계적 응력의 존재에 발생합니다. 우리는 세균 유착의 연구에 중요한 매개 변수로 전단 응력을 소개하는 기술을 설명합니다.

초록

세균성 감염 동안 상호 작용의 순서는 병원체와 숙주 사이에 발생합니다. 숙주 세포의 표면에 세균 부착이 자주 pathogenesis의 초기 및 결정 단계입니다. 실험적으로 유착이 거의 정적 조건에서 공부 있지만 접착력은 실제로 액체를 흐르는 앞에서 열립니다. 세균과 호스트 간의 첫 번째 조우는 종종 점액은 상피 세포의 표면을 따라 흐르는 점막 레벨, 입, 폐, 뱃속, 눈, 등에서 발생합니다. 나중 감염에 병원균은 종종 같은 패혈증, 패혈증과 뇌막염과 같​​은 생명을 위협하는 질병의 원인이 혈액 순환을 액세스할 수 있습니다. 이러한 감염의 정의 기능은 혈액을 순환의 존재에있는 내피 세포와 상호 작용 이러한 병원균의 능력입니다. 그것은 병원체에 기계적 힘을 생성하기 때문에 액체, 점액 또는 인스턴스에 대한 혈액을 흐르는 존재는 접착력을 결정합니다. 액체를 흐르는 효과를 특징 짓는하기 위해서는 일반적으로 다인즈 / cm ^2의 표현 고정 벽 근처에 움직이는 유체에 의해 단위 면적 당 끼쳤다 접선 힘이 전단 응력의 ​​개념을 말합니다. 전단 응력의 ​​농도가 다른 선박의 종류에 따라 다양, 크기, 장기, 위치 등 (0-100 다인즈 / cm ^2). 모세 혈관의 순환은 매우 낮은 전단 응력 값에 도달 심지어 일시적으로 몇 분 ¹ 몇 초 사이에 이르는 기간 동안 중단할 수 있습니다. arterioles의 스펙트럼 전단 응력의 ​​다른 쪽 끝을에 100 다인즈 / cm ^{2 2에} 도달할 수 있습니다. 다른 생물 학적 과정에 대한 전단 응력의 ​​영향은 명확하게 내피 ³ leukocytes의 상호 작용하는 동안 인스턴스로 증명되었습니다. 계정에 세균 유착 과정에서이 기계 매개 변수를 이용하려면 우리는 일회용 흐름의 사용 챔버 ⁴ 기반의 실험 절차를 이용했다. 호스트 세포가 흐름 챔버 재배하고 형광 박테리아는 주사기 펌프에 의해 제어 흐름에서 소개하고 있습니다. 우리는 처음 세균성 병원체 Neisseria meningitidis, 패혈증과 뇌막염에 대한 책임 그람 음성 세균에 대한 조사를 하였다. 절차는 우리가 박테리아의 능력에 전단 응력의 ​​영향을 연구 허용 여기서 설명 : 세포 표면 ⁵ 분아 따위에 의해 번식하는 세포 ^1을 준수하고 새로운 사이트를 ⁶ (그림 1)을 식민지로 분리합니다. 보완 기술 정보 참조 7 찾을 수 있습니다. 여기에 제시 전단 응력 값은 문헌에서 찾을 값을 나타내는 우리의 이전 경험을 ^1에 따라 선정되었습니다. 프로토콜은 연구의 목표에 따라 구체적인 조정과 병원균의 광범위한 적용해야합니다.

프로토콜

1. 인간 숙주 세포 및 세균 문화

1. 통과 1 5 % (V / V) CO ₂ humidified 인큐베이터에서 37 ° 9 사이의 문화 HUVECs. 통로 세포들은 일회용 흐름 챔버 (μ - 슬라이드 VI)에서 75cm ^두 문화 flasks 및 실험 문화 정비 문화를 제공하는 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 80 % 합류 접근시.
2. passaged 수 flasks에서 매체를 철회, PBS의 10 ML로 세포를 씻어 철회하고 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1.5 ML로 바꾸십시오. 세포 ° C. 37 5 분 인큐베이터 세포 배양에서 분리하도록 허용
3. 15 ML 수집 튜브에 세포 배양 매체 10 ML있는 세포를 수집합니다. 상온에서 5 분 원심 분리와 펠렛은 전지 (200g에서). 10 % 보충 엔도 - SFM 4 ML에있는 세포를 일시 중지 (V / V) FBS와 제조 업체의 지시에 따라, Malassez 챔버 그들을 계산합니다.
4. 채널 (3x10 ⁴ 개)로 ML 정지 당 1x10 ⁶ HUVEC 세포의 30 μl를 소개하고 세포를 37에서 3 시간 준수 ° humidified 인큐베이터에 5 % (V / V) CO _2의 분위기 수 있습니다. 우물을 채우기 위해 엔도 - SFM 120 μl의 추가 볼륨을 추가합니다. 세포는 subconfluent monolayer (그림 2)을 형성한다.
5. N. 그로 켈로그의 보조제 37에서 5 μg / chloramphenicol의 ML ° 5 %를 포함한 습한 분위기에서 C (V /를 포함하는 GCB 한천 플레이트에 GFP를 (IPTG - inducible 프로 모터의 제어하에이 경우에는 스트레인 8,013 표현 GFP), 표현 meningitidis V) 16 시간 동안 CO _2.

2. 개인 박테리아의 초기 접착력은 세포를 호스트

1. 사전 예열 엔도 - SFM은 37 120분 10 % (V / V) FBS와 부화를 포함한 ° C를 5 % (V /를 포함한 습한 분위기와 0.05의 OD600에 GCB의 한천 플레이트에 성장 박테리아의 농도를 조절 V) 부드러운 흔들림 (130 RPM)에서 CO _2. 전체 배양 기간 동안 문화 매체에 1 ㎜의 IPTG를 추가하여 GFP 발현을 유도.
2. 37 샘플 온도를 유지하기 위해 가열 플랫폼 ° C. 갖춘 거꾸로 현미경의 무대에서 μ - 슬라이드 일회용을 플레이스
3. 멸균 유리 비커에 2%과 보완 사전 예열 엔도 - SFM (V / V) FBS를 붓고이 매체와 살균 50 ML의 주사기를 입력하십시오. 주사기로 "항목"튜브를 부착하고 매체를 도입하여 기입하십시오.
4. 챔버에 공기를 도입하지 않도록하기 위해,주의, μ - 슬라이드에있는 "항목"튜빙을 연결합니다. 그런 다음, 신중하게 접사 다른 끝에 "종료"튜브 및 챔버 '출구'에서 약 1cm 거리에 매체와 채널을 입력합니다.
5. 박테리아 OD600를 측정하고 엔도 - SFM 2 % (V / V) FBS를 포함하는으로 0.15을 조절할 수 있습니다. 개인 박테리아를 봐하기 위해서는 모든 집계는 세균 샘플의 활발한 vortexing에 의해 중단될 수 있어야합니다.
6. 엔도 - SFM 장소 100 μl의 저수지 2 개의 % (V / V) FBS 배지로 보충하고 나머지 박테리아 합산을 샘플링하지 않도록 vortexed 솔루션의 정상에서 찍은 세균성 솔루션을 100 μl를 추가합니다.
7. 챔버에 박테리아를 주입하기 위해 꼭지를 돌려하여 μ - 슬라이드에 200 μl 볼륨을 조심스럽게을 소개합니다.
8. 2 %가 포함된 엔도 - SFM (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 0.044 다인즈 / 15 분 cm ^2의 접착력과 호환 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에. 소개

동영상 1 또는 그림 3 예를 들어 참조하십시오. 이 단계 후에, 각 섹션 3, 4 또는 6로 이동합니다.

3. 호스트 세포 개별 박테리아의 초기 접착의 부량

1. 액체가 계속 순환되는 동안 15 분 동안 초기 접착 후, 무작위로 열 필드의 이미지를 획득.
2. 분야마다 adherant 박테리아의 수를 의미에 액세스하려면 ImageJ 소프트웨어 ^8, 사용하여 얻은 이미지를 분석합니다. 다음과 같이이 이루어집니다 : 우선, 각각의 이미지가 세포의 배경을 최소화하면서, 각각의 준수 형광 박테리아를 강조하는 '이미지'메뉴에있는 "임계값"창을 사용 thresholded 있습니다. 그런 다음, 모든 단일 세균이 플러그인 "셀 카운터"(사용하여 계산됩니다 http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html를 .) 각 이미지에 대한 데이터는 Excel 스프레드 시트에서보고 있으며, 분야마다 자기편 박테리아의 평균 개수를 정할 평균입니다.

4. 호스트 세포에 점착 성의 개별 박테리아의 흐름에 저항을 측정

1. 프로그램 주사기 펌프 3 백 다인즈 / 5 분 cm ^2까지 전단 응력을 생성 - 설정합니다.
2. 5 분 끝에, 단계 3.1에서 설명한대로 무작위로 선택한 열 필드를 취득하지만, 흐름과 PR을 중지인수 ior.
3. 로 단계 3.2에서 설명한 획득한 이미지를 분석하고 현장마다 남아있는 박테리아의 의미 번호를 계량.

5. microcolony에 절연 점착 성의 박테리아의 성장을 측정

1. 엔도 - SFM 10 % (V / V) 37 유지 FBS, 각하 온수 플랫폼과 C, 몇 시간 동안 선택한 전단 응력과 주사기 펌프를 사용하여 챔버에.를 포함하는 소개 한 프레임마다 5 분 실시간 비디오 현미경에 대한 기록 이미지.
2. 비디오 현미경 다음, 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력을 중단, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다. 박테리아 확산의 예제는 비디오 2 볼 수 있습니다.

6. 자기편 세균성 microcolonies의 흐름에 저항을 측정

1. 세포 표면에 큰 microcolonies의 형성 후 (step5.2) 흐름을 신청하기 전에 2-3 두 세포의 이미지 (상 대조적으로)와 박테리아를 (GFP - 형광에 의해) 취득. 실험의 나머지 부분은 인수 프로토콜은 형광을 모니터링합니다.
2. 한 프레임 5 초마다에서 5 분 (3-100 다인즈 / cm ²⁾ 및 기록 이미지에 대한 높은 전단 응력을 적용.
3. 주사기 펌프를 해제하여 전단 응력를 중지, 2-3 추가 영상을 얻은 후 소프트웨어에서 이미지 수집 순서를 중지합니다.
4. 다음 먼저 "종료"튜브를 제거하고 신중하게, 채널을 비우는 피하기 위해 다음 "항목"튜브를 제거하기 전에 우물을 채우기 위해 미리 예열 신선한 매체를 추가하십시오.
5. 양적 세균성 저항에 대한 전단 응력의 효과를 확인하려면, 도금 분석은 다음과 같이 수행할 수 있습니다 : 남아있는 매체를 수집하고 채널 (모두 세척이에서 남아있는 매체를 제거 PBS 120 μl와 두 번 μ - 슬라이드 씻어 또한 수집된).
6. 37 °에서 5 분간 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 50 μl를 추가로 감염된 세포를 분리하고 이전 단계에서 수집된 현탁액이 분리된 샘플을 섞는다.
7. PBS 및 플레이트 세중의에 GCB의 한천 플레이트에 10 μl 분수에서 시리얼 dilutions, 37에서 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU)를 결정하기 위해를 수행 ° 인큐베이터에서 C와 함께 5 % (V / V) CO _2.

비디오 3 4 pilV 돌연변과 야생 타입 응력을 비교합니다.

7. microcolonies에서 세균 분리

1. 2.8 단계 2.1 반복하여 흐름 챔버에 세포를 감염과 감염이 30 분 동안 진행하실 수 있습니다.
2. 2 분 동안 10 다인즈 / cm ² 흐름을 증가하여 언바운드 박테리아를 제거하고 감염이 2 시간을 위해 계속하실 수 있습니다.
3. 0.15 다인즈 / cm ² 흐름을 줄입니다.
4. 모든 시간의 흐름 챔버 나오는 매체의 드롭를 수집합니다.
5. GCB의 한천 플레이트에 샘플을 판 그들의 시리얼 dilutions을 수행합니다.
6. 37 접시의 부화 후 다음날 콜로니 형성 단위의 수 (CFU), 각하 인큐베이터에서 C 5 % (V / V) CO _2를 결정합니다.

8. 대표 결과

그림 1 : 관찰과 절차의 흐름의 면전에서 측정할 수있는 세포 monolayer의 다른 단계를 반복합니다.

그림 2 : 실험 (전단 응력의 ​​부재)의 시작 부분에 흐름 챔버에서 내피 세포 monolayer. 약 50 내피 세포는 서브 합류 monolayer로 구성됩니다.

그림 3 : 세포 표면에 박테리아의 초기 접착력의 그래픽 표현. 세 분야에 대한 값 (0044 다인즈 / cm ²⁾ 예상되는 분야 - 투 - 현장 변화의 아이디어를주는 표시됩니다.

비디오 1. 시간 함수 (0044 다인즈 / cm ^2)로 세포 monolayer에 대한 박테리아의 초기 접착력의 시각화. GFP - 표현 박테리아는 흐르는 매체의 방향을 따르고 있습니다. 이 영화는 60 배 가속은, 비디오의 실제 소요 시간은 10 분입니다.
비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 2. 초기 부착 세균 후는 7 시간의 기간 (1000 배 가속)에 대한 세포 표면에 세포 분열 따위에 의해 번식 수있게되었습니다.
비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

비디오 3. 확산 후 세포 표면에 기계공microcolonies의 알 저항이 있지만 야생 유형 microcolonies가 내성을 가속 60 배 아르 5 분 10 다인즈 / cm ^2로 전단 응력 수준을 증가하여 테스트되었습니다.
비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

pilV 돌연변이에 의해 형성 비디오 4. Microcolonies는 흐름 증가 (10 다인즈 / cm ^2)에 의해 방해하고 있습니다. 이 돌연변이가 microcolonies 아래 플라즈마 막의 리모델링을 유도하는 데 실패하고 증가 전단 응력 (동영상 60 배 가속입니다) ^{5함으로써} 더 높은 민감합니다.
비디오를 시청하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

전단 응력과 일반적으로 생물의 기계 부분의 중요성이 점차 인식되고있다. 예를 들어 lymphocytes 부착 및 혈관 벽에 압연 과정에서 단백질의 Selectin 가족의 고도의 적응 접착제 속성이 과정에서 전단 응력을 도입하여 인정되었습니다. 위에서 설명한 절차는 그람 음성 세균 Neisseria meningitidis의 적용했지만 병원균의 광범위한 적용해야합니다. 전단 응력의 중요성은 다른 병원균 및 기타 감염 사이트에도 게재되었습니다. 전단 응력에 의해 에어컨 세균 유착이 uropathogenic 대장균 (UPEC) ^9에있는 FimH adhesin의 연구에 의해 설명되었다. Selectins 마찬가지로, FimH 및 숙주 세포 수용체 간의 상호 작용이 전단 유도된 기계적 힘에 ⁹ enterotoxigenic E.coli의 CfaE adhesin에 의해 강화하는 게재된는 전단에 의존 통해 창자 상피 세포에 부착을 중재하는 것도보고되었습니다 메커니즘 ^10. 우리는 연쇄상 구균 agalactiae 필리는 유동 조건 하에서 상피 세포가 ^11이 병원체의 준수에 필수적인 것을이 장에서 설명한 층류 흐름 챔버 분석 프로토콜을 사용했다. 이러한 연구는 우리의 흐름 챔버 분석은 전단 응력의 조건 호스트 병원체 상호 작용 세포를 조사하는 유용한 도구입니다 있는지 확인합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호
μ - 슬라이드 VI 0.4 흐름 키트	IBIDI	80,606
주사기 Plastipak 50 ML Luer - 잠금	백톤 디킨슨	300865
Tygon 튜빙 R3603 3.2 X 4.8mm	피셔 - 과학	R3603
남성 luer 3 방향 꼭지, 2 여성 luer	바이오 래드	7,328,103
주사기 펌프	하버드 장치	PHD 2000
거꾸로 현미경, 니콘	니콘	이클립스 T I
CCD 카메라	하마 마츠	오르카 285 CCD 또는 오르카 3 - CCD
ImageJ 소프트웨어	NIH	프리웨어 ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )