Yanal-flow teknolojisi kullanılarak Hematolojik Malignite Hastalarda invaziv pulmoner aspergillozis Algılama

Özet

Invaziv pulmoner aspergillozis için hızlı ve hassas noktası bakım testi sunulmaktadır. Bir bağlanan bir monoklonal antikor kullanılarak yanal-akış teknolojisi yararlanır Aspergillus Antijen akciğer enfeksiyonları sırasında salgılanan. Testi serum ve brochoalveolar lavaj ile uyumlu ve hastalık tanısı için yeni bir ek testi temsil eder.

Özet

İnvazif pulmoner aspergilloz (İPA) morbidite ve hematolojik malignite hasta ve hematopoetik kök hücre nakli, ¹ ölüm önde gelen nedenidir. IPA Algılama zorlu bir tanısal zorluk temsil eder ve bir 'altın standart' yokluğunda, klinik verileri ve mikrobiyoloji ve histopatoloji makul bir arada dayanmaktadır. IPA Tanı Araştırma ve Tedavi Kanser ve, "kanıtlanmış", "olası", ve "mümkün" invaziv fungal hastalıklar ² tanımlayan Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Mikoloji Çalışma Grubu (EORTC / MSG) uzlaşma Ulusal Enstitüsü için Avrupa Organizasyonu uygun olmalıdır . Günümüzde, nükleik asit bazlı testler dışarıdan IPA algılama ve böylece polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için onaylanmıştır mevcut EORTC / MSG tanı kriterleri dahil değildir.

Histolojik kesitlerde Aspergillus belirlenmesi nedeniyle simi sorunlu olduğunudiğer invaziv fungal patojenlere ^3, ve kanıtlanmış tanımlama ile hifal morfolojileri kolay değildir saf kültür etyolojik ajan izolasyonu gerektirir. Kültür-temelli yaklaşımlar biyopsi örneklerinin durumu güveniyor, ancak bu her zaman hasta hasta erişilebilir değildir ve elde edilen her zaman kültür için geçerli propagules verim yok.

Aspergillus patogenezinde önemli bir özelliği, anjiyo-işgali, serum ve bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında karakteristik antijenik imzalar molekülleri tespit testleri kullanılarak immünolojik mantar izlemek için olanak sağlayan bir özelliktir. Bu, Aspergillus galaktomannan ve korunmuş mantar hücre duvarı bileşeni algılar (1 → 3)-β-D-a 'Pan-fungal' deneyi (Fungitell testi) algılar Platelia enzim immunoassay geliştirilmesi (GM-EIA) neden olmuştur glukan, ancak kendi hücre duvarlarını ^1,4 Bu bileşenin eksikliği mucorales içinde. Mınesil monoklonal antikor son gelişme (mAb) bazlı enfeksiyonu ^1,5 taşıyıcı belirteç tespit deneyleri yol açmıştır, bu testler ^1,4-6 doğruluğunu çevreleyen Sues.

Thornton ⁵ son zamanlarda IPA noktası bakımı (POC) tanısı için immuno-kromatografik yanal akış cihazı (LFD) geliştirmek için hibridoma teknolojisi ve kullanımı kullanarak bir Aspergillus spesifik MAb (JF5) üretimi nitelendirdi. LFD önemli bir avantajı MAb JF5 mantar sadece ⁵ aktif büyümenin sırasında salgılanan ekstraselüler glikoprotein antijenine bağlanır yana aktivitesini tespit yeteneğidir. Böyle Aspergillus sporları solunan havanın ortak bir bileşen olduğundan IPA tanısı için akciğer BAL gibi sıvıları kullanarak bu önemli bir husustur. IPA teşhisinde cihazın yardımcı LFD geliştirilmiş duyarlılık ve Spec gösterilmiştir enfeksiyon bir hayvan modeli kullanılarak kanıtlanmıştırificity Platelia GM ve Fungitell (1 → 3)-β-D-glukan deneyleri ⁷ ile karşılaştırıldığında.

Burada, insan serum ve BAL sıvılarında Aspergillus antijeni tespit etmek için basit bir LFD prosedürü sunuyoruz. Onun hız ve doğruluk hematolojik malignite hastalarında İPA tanısı için yeni bir ek noktası bakım test sağlar.

Protokol

1. Toplama, Depolama ve Serum ve Bronkoalveoler Lavaj Akışkanlar hazırlanması

1. 4 pıhtılaşmasına kullanmak ° C, ve -20 azından alikotları olarak deposu serum ° C'ye önceden kan izin vererek tedavi edilmemiş kan örneklerinden serum Collect. Bronkoalveoler lavaj sıvıları (BAL) de -20 ° C'de alikotları olarak saklanmalıdır Not: Depolama serum ve alikotları tekrar test sırasında numunelerin donma-çözülme tekrarlanan tarafından hedef antijen bozulması için potansiyel sınırlar olarak BAL.
2. Çözülme örnekler ve 14,000 rpm'de 1 dakika vorteks ve santrifüj ile iyice serum ve BAL örnekleri karıştırın.
3. Insan serum numuneleri rutin testi için, doku kültürü ortamı (TCM) ile serum 01:01 (v / v) seyreltik. TCM RPMI-1640 ortamı, 10% (v / v) fetal buzağı serumu, 200mm L-glutamin solüsyonu 1% (v / v) ve koruyucu madde olarak, sodyum azid (% 0.02 w / v) oluşur. Orta önceden hazırlanmış ve birkaç ay süreyle 4 ° C'de saklanabilir. Dilut 100 ul uygulayınLFD için ed serum.
4. Insan BAL sıvılarında, ve hayvan modelleri BAL sıvılarında için, hiçbir tedavi öncesi ile, LFD için düzgün numune 100 ul geçerlidir.
5. Hayvan modellerinde serum için, fosfat EDTA, kaynar su banyosunda, 14.000 rpm'de 5 dakika boyunca santrifüj 3dk için ısı% 4 (w / v) içeren tamponlu salin ile serum 01:02 (v / v) seyreltilmiş ve 100 uygulamak LFD cihaza düzgün süpernatan ul.

2. Yanal akış Aygıt serum ve BAL Uygulama

1. Oda sıcaklığında (23 ° C) yanal akış cihazlar depolamak. Bu sıcaklıkta, cihazlar 12 ay stabildir. Bir yüzey üzerinde kendi keseleri ve yerden aygıtları kaldırın.
2. Steril bir pipet ucu kullanarak, cihazının açıklaması portuna önişlemli serum veya neat BAL Örnek 100 ul uygulanır.
3. Assay testlerin sonuçları kaydedilmiş hangi bir zamanda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca çalışmasına izin verir. Not: saniye içinde sıvı se olacaktırtr gözlem penceresinde Nitroselüloz zar boyunca kılcal hareket ile geçirmek.

3. LFD Sonuçlar kaydedilmesi ve yorumlanması

1. LFD bir iç kontrol hattı (plastik gövde üzerinde C harfi ile gösterilir) ve bir test çizgisi (T harfi ile gösterilir) oluşur. Kontrol çizgisi her zaman serum veya BAL örneğinde bakılmaksızın Aspergillus antijeni görünmelidir. Bu tahlil doğru çalıştığını gösterir.
2. Aspergillus antijeni serum veya BAL örnek varsa, test çizgisi de örnek uygulama 15 dakika içinde görünür. Test çizgisi yoğunluğu örnek Aspergillus antijeni mevcut miktarı ile orantılı olduğundan, test çizgisi (+) zayıf pozitif olarak görünebilir, orta pozitif (+ +) veya gibi güçlü bir pozitif (+ + +) . Ancak, herhangi bir pozitif test çizgisi ne olursa olsun, şiddeti, örnek Aspergillus antijeni varlığı işaret eder. ThAspergillus antijeni e yokluğunda, hiçbir test çizgi görünür, ve sonuç negatif olarak kaydedilir (-).

4. Temsilcisi Sonuçlar

BAL ve serum numuneleri negatif, zayıf bir pozitif, orta pozitif ve güçlü bir pozitif LFD sonuçlar için temsili örnekler, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

(AML) hastalarda EORTC / MSG tanı kriterlerine göre tanı akut myeloid lösemi BAL sıvılarında kullanarak antijeni pozitif LFD testleri (güçlü ve zayıf) veya negatif LFD testlerin sonuçları Tablo 1'de verilmiştir. Ilgili klinik ve mikolojik (galaktomannan ve kültür) verileri ve her hasta için St Bartholomews Hastanesi'nde ⁸ de geliştirilen bir Aspergillus spesifik PCR testinin sonuçları bu tabloya eklenmiştir. Hastalığın tanısı ana faktörler (nötropeni, kortikosteroidlerin uzun süreli kullanımı, diğer tanınan T-hücre immunos ile tedavi dayanmaktadıruppressants), klinik kriterler ve BAL için GM pozitifliği (burada bir GM endeks değeri> 0.8 olarak tanımlanır). 2002 EORTC / MSG kılavuzlar ^10, hastalar 12, 13 ve 16 altında konak faktörleri ve klinik kriterleri ya da GM pozitifliği temelinde 'mümkün' IA tanısı konuldu. Sırasıyla klinik veriler ve mikoloji gelen destekleyici kanıt eşliğinde sürece gözden geçirilmiş (2008) EORTC / MSG kurallarına ^2, konak faktörleri ve GM pozitifliği tek başına veya konak faktörleri ve sadece klinik kriterlerine göre 'olası' invaziv fungal enfeksiyon belirtisi değildir. Hasta 6 çünkü ana faktörler, majör ve minör klinik özellikleri ve GM pozitifliği hem de 2002 ve 2008 kuralları uyarınca "muhtemel" IA tanısı kondu. Not, bu LFD ya PCR ne de henüz EORTC / MSG kılavuzlar dahil edilir ise, örnek olarak BAL Aspergillus antijen ve nükleik asit varlığında gösteren iki deneyleri ve ticari galaktomannan test arasında güçlü bir uyum olduğu Hastaların 6 ve 12 ile s. IPA tanısında LFD ve PCR etkinliğini ortaya koyan çalışmaların Ek sonuçların Johnson ve ark ⁸ bulunabilir.

Şekil 1. Serum ve BAL kullanarak LFD testlerin sonuçları (kontrol ve test çizgisi) Negatif (sadece kontrol hattı) ve pozitif. Test hattı reaksiyon yoğunlukları ve serum numuneleri BAL hedef antijene konsantrasyonları ile orantılıdır. Reaksiyonlar tipik olarak aralıktan zayıf bir (+) orta yoluyla (+) kuvvetli (+ + +). Ne olursa olsun test hattı yoğunluğu, her üç serum pozitif reaksiyon kan Aspergillus antijeni dolaşan varlığı nedeniyle invaziv pulmoner aspergillozis hastalığı işaret eder. Pozitif BAL reaksiyonlar (zayıf, orta veya güçlü) sporlar ve akciğerlerde potansiyel patojen hif gelişme çimlenme işaret eder.

"pdflinebreak>

Hasta hayır.	Patient bilgi	Klinik kriterler 1	BAL kültürü 2	GM ÇED endeksi 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR sonucu	LFD sonucu
6	-	Binbaşı CT bulguları (nodül ve halo) ve küçük bir	Negatif	0.9 (pozitif)	Muhtemel	Muhtemel	Pozitif	(+) Pozitif Zayıf
12	Presumed önceki mantar enfeksiyonu	Minör majör bir	Candida glabrata	6.43 (kuvvetli pozitif)	Mümkün	Hiçbiri	Pozitif	Güçlü pozitif (+ + +)
13	Koagülaz-negatif Staphylococcus ve E. Kanda coli	Hayır majör, iki minör	Negatif	0,25 (negatif)	Mümkün	Hiçbiri	Negatif	Negatif (-)
16	Akciğer enfeksiyonu	Yeni sızmak artı çoğul efüzyon dahil 3 minör kriterin	Negatif	0,16 (negatif)	Mümkün	Hiçbiri	Negatif	Negatif (-)

Bilgisayarlı tomografi ¹ Nodüller veya haleler mantar enfeksiyonu düşündürür
Bu normal insan florasının ⁹ parçası olarak izole ikinci en sık görülen maya olarak BAL sıvısında ² Candida glabrata bir kirletici olarak kabul edilir
BAL GM ÇED test> 0.8 ³ indeks Aspergillus enfeksiyonunun göstergesidir
⁴ 'yaklaşıma uygun olan 2002 EORTC / MSG tanı kriterlerine göree ',' olası 'veya' kanıtlanmış invaziv mantar hastalığıdır ^10
5 'olası' için gözden geçirilmiş (2008) EORTC / MSG tanı kriterleri, 'olası' veya 'kanıtlanmış' invaziv mantar hastalığıdır ² dayanarak

Tablo 1. LFD muhtemel IPA ile ve kontrol AML hastalarında (enfeksiyon bulgusu) akut myeloid lösemi hastalarının BAL örneklerinin testleri, ve enfeksiyon EORTC / MSG tanı sonuçları.

Tartışmalar

IPA tanımlanmasından sadece gerçekten biyopsi örnekleri etyolojik etkenin izolasyonu ile elde edilebilir, ancak uygun örneklerin kurtarma çok hasta hastalarda çoğu kez mümkün değildir ve Aspergillus kandan nadiren kurtarılabilir olabilir. Büyük gelişmeler IPA tanısında göğüs tarama bilgisayarlı tomografi kullanımı konusunda yapılmış iken, bu "halo" ya da "hava-hilal" işaretleri olarak pulmoner IPA düşündüren özellikler ya geçici ya da nefes eserler isnat edilebilir veya diğer mantar enfeksiyonları ^11,12. Bu veriler bu nedenle hastanın serum içinde dolaşan veya BAL sıvılarında, balgam ve idrar örnekleri ¹³ mevcut olduğunu mantarlardan imza moleküller (GM ve β-glukan) tanımlamak amacı serolojik teknikler ile takviye edilir. Bu testlerin tatmin edici hassasiyet gösterilecek, bunlar belirli koşullar altında ^1,6 yeterli özgüllük eksikliği veya parazit muzdarip .

IPA tespiti için LFD testi burada sunulan en meşhuru, virüsler, bakteriler, parazitler ve toksinler ^14-19 tespiti için testler güncel ve kullanılır olmuştur IPA ve istismarlara teknoloji 'nokta-bakım' tanı sağlar İlk 1988 yılında Unipath tarafından tanıtılan sınar ev gebelik için. Burada anlatılan Aspergillus LFD olarak, Aspergillus spesifik MAb JF5 gözenekli bir nitroselüloz membran üzerinde bir yakalama bölgesi (test çizgisi) için immobilize edilir. Ayrı bir bölgede zarı immobilize anti-fare immunglobulin bir iç kontrol (kontrol çizgisi) olarak görev yaptı. Serbest limana serum veya BAL sıvı ilavesi, serbest pad MAb JF5-koloidal altın konjugat hedef antijene bağlanır ve karmaşık sonra kapiler gözenekli zar boyunca geçer. Yakalama bölgesinde immobilize MAb JF5 kırmızı bir test hattı elde JF5-koloidal altın-antijen kompleksine bağlanır. Herhangi bir ilişkisiz JF5-koloidal altınkonjuge tahlil doğru çalıştığını gösteren iç kontrol bağlar. Kırmızı bir kontrol hattı ile sonuçlanır.

Testi gerçekleştirmek için yalnızca 15 dakika alarak, hızlı, GM ve β-glukan algılama dayalı serum ve BAL testleri ile karşılaştırıldığında ucuz ve pahalı cihazlar veya çalıştırmak için kapsamlı laboratuar olanakları gerektirmez. Ayrıca, MAb JF5 GM ve β-glukan testleri ^1,4,6 yanlış pozitif reaksiyona neden olduğu gösterilmiştir ilaçlar ya da kirletici ile çapraz reaksiyon vermez. Mevcut tanı testleri üzerinden ilave bir büyük avantajı Aspergillus türlerinin invaziv büyüme göstergesidir aktivitesini tespit LFDs yeteneğidir.

LFD prosedürü içinde kritik bir safha, cihaza serum veya BAL numunenin uygulama sonrası sonuç 15 dak okumak için ihtiyaç vardır. Bu testi mayıs önyargı sonucu interpretati gibi, sonuçları kaydetmeden önce uzun 15 dakika bırakılmamalıdırüzerinde. Bir zayıf reaksiyon inkübasyon periyodu uzatarak geliştirilmiş olmayacak. Enfeksiyon hayvan modellerinde serum ısıl işlemi testi duyarlılığını artırmak için tespit edilmiştir. Test bir sınırlaması niteliksel olması ve pozitifliği öznel bir değerlendirme yapmak için operatör dayanır. Test hattının yoğunluğu ve serum numuneleri BAL (Şekil 1) antijeni içeriğine göre değişir. Ancak, herhangi bir pozitif reaksiyon (bilinen negatifleri ile karşılaştırılarak belirlenir) Aspergillus antijeni ve bu nedenle enfeksiyon varlığını gösterir. LFD testlerin öznelliği sınırlamak için, el cihazları LFD test hattı yoğunluğu ölçümü izin ve antijen saptama ²⁰ için eşik değerlerin kurulmasını sağlamak hangi mevcuttur.

LFD gelecekteki gelişmeleri ticarileştirilmesi ve diğer invaziv fungal patojenlerin aynı anda saptanması sağlayan bir multipleks LFD gelişimi bulunmaktadırçok özel Mablar ³ kullanarak.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Aspergillus LFD	University of Exeter		Istek üzerine yazarın edinilebilir
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamine	Sigma	G7513
Fetal buzağı serumu	Biosera	S9100	Fetal dana serumu ve diğer kaynaklardan TCM hazırlanmasında kullanılabilirler
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1