Nachweis des invasiven Pulmonale Aspergillose bei malignen hämatologischen Patienten mit Lateral-Flow-Technologie

Zusammenfassung

Eine schnelle und genaue Point-of-Care-Test für invasiver pulmonaler Aspergillose wird vorgestellt. Es nutzt die Vorteile der Lateral-Flow-Technologie unter Verwendung eines spezifischen monoklonalen Antikörper, der an ein bindet Aspergillus Antigen bei Infektionen der Lunge ausgeschieden. Der Assay ist kompatibel mit Serum und brochoalveolar Lavage und stellt einen neuartigen Zusatz-Test zur Diagnose von Krankheitsbildern.

Zusammenfassung

Invasive pulmonale Aspergillose (IPA) ist eine führende Ursache für Morbidität und Mortalität bei Patienten mit hämatologischen Malignomen und hämatopoetischen Stammzelltransplantation Empfänger ^ein. Erkennung von IPA stellt eine beeindruckende diagnostische Herausforderung und, in Ermangelung eines "Goldstandard", beruht auf einer Kombination von klinischen Daten und der Mikrobiologie und Histopathologie wo dies möglich ist. Die Diagnose der IPA sind an die Europäische Organisation für Forschung und Behandlung von Krebs und dem National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mykologie Study Group (EORTC / MSG) Konsens zur Definition der "bewährten", "wahrscheinlich" und "möglich", invasive Pilzkrankheiten ² entsprechen . Derzeit sind keine Nucleinsäure-basierten Tests wurden auf äußere IPA Detektion und so Polymerase-Kettenreaktion (PCR) validiert ist nicht im aktuellen EORTC / MSG diagnostischen Kriterien enthalten.

Identifizierung von Aspergillus in histologischen Schnitten ist wegen der problematischen Simimäßigkeiten in Hyphen Morphologien mit anderen invasiven Pilzerreger ³ und bewährte Identifikation erfordert die Isolierung der Erreger in Reinkultur. Kultur-basierte Ansätze beruhen auf der Verfügbarkeit von Biopsie-Proben, aber diese sind nicht immer zugänglich in kranken Patienten, und nicht immer nachgeben lebensfähig Vermehrungseinheiten für Kultur, wenn erhalten.

Ein wichtiges Merkmal in der Pathogenese von Aspergillus ist Angio-Invasion, eine Eigenschaft, die Chancen, den Pilz zu verfolgen immunologisch mittels Tests, die charakteristische Signaturen antigenen Moleküle nachzuweisen im Serum und in der bronchoalveolären Lavage (BAL) Flüssigkeiten bietet. Dies hat zu der Entwicklung der Platelia Enzymimmunoassay (GM-EIA), die Aspergillus Galactomannan und eine "pan-Pilz"-Assay (Fungitell Test), die den konservierten Zellwand-Komponente erkennt (1 → 3)-β-D-detektiert geführt Glucan, aber nicht in den Mucorales, die diese Komponente in ihren Zellwänden ^1,4 fehlt. Istverklagt rund um die Genauigkeit dieser Tests ^1,4-6 hat auf die jüngste Entwicklung der nächsten Generation monoklonaler Antikörper (MAK)-basierte Assays, die Surrogatmarker der Infektion erkennen ^1,5 geführt.

Thornton ⁵ Kürzlich beschrieb die Erzeugung eines Aspergillus-spezifischen mAb (JF5) unter Verwendung von Hybridom-Technologie und deren Verwendung, um eine Immun-chromatographisches Lateral-Flow-Gerät (LFD) für den Point-of-Care (POC) Diagnose von IPA zu entwickeln. Ein großer Vorteil des LFD ist seine Fähigkeit, die Aktivität zu erkennen, da MAb JF5 bindet an eine extrazelluläre Glykoprotein-Antigen, das während der aktiven Wachstum des Pilzes nur ⁵ sezerniert wird. Dies ist eine wichtige Überlegung bei der Verwendung von Flüssigkeiten, wie zB Lungen-BAL zur Diagnose IPA seit Aspergillus-Sporen ein gemeinsamer Bestandteil der Atemluft sind. Der Nutzen der Vorrichtung bei der Diagnose von IPA wurde gezeigt, mit einem Tiermodell der Infektion, wobei die LFD verbesserte Empfindlichkeit und Spezifikation angezeigtificity dem Platelia GM und Fungitell (1 → 3)-β-D-Glucan-Assays ⁷ verglichen.

Hier stellen wir ein einfaches Verfahren, um LFD Aspergillus-Antigen in humanem Serum und BAL-Flüssigkeiten zu erkennen. Seine Geschwindigkeit und Genauigkeit bietet eine neuartige Ergänzung Point-of-Care-Test zur Diagnose von IPA in malignen hämatologischen Patienten.

Protokoll

1. Sammlung, Lagerung und Vorbereitung von Serum-und bronchoalveolären Lavage

1. Serum, entnommen aus unbehandelten Blutproben, indem sie die Blutgerinnung bei 4 ° C, und speichern Serum als Aliquots bei -20 ° C erwärmen lassen. Bronchoalveolären Lavage (BAL) sollte auch als Aliquots bei -20 ° C gelagert werden Hinweis: Die Lagerung von Serum und BAL als Aliquots das Potenzial für den Abbau der Ziel-Antigen, das durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen der Proben während einer Wiederholung des Tests begrenzt.
2. Tauwetter Proben und mischen Sie die Serum und BAL-Proben gründlich durch Vortexen und Zentrifugation für 1 min bei 14.000 Umdrehungen pro Minute.
3. Für die Routineprüfung der menschlichen Serumproben, verdünnt das Serum 1:1 (v / v) mit Gewebekulturmedium (TCM). TCM besteht aus RPMI-1640-Medium, 10% (v / v) fötalem Kälberserum, 1% (v / v) von 200 mM L-Glutamin-Lösung, und Natriumazid (0,02% w / v) als Konservierungsmittel. Das Medium wird im Voraus vorbereitet und können bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden. Tragen Sie 100 ul der DILUTed Serum auf die LFD.
4. Für menschliche BAL-Flüssigkeiten, und für BAL-Flüssigkeiten aus Tiermodellen, gelten 100 ul Probe ordentlich auf die LFD, ohne Vorbehandlung.
5. Für Serum von Tiermodellen, verdünnte Serum 1:2 (v / v) mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, enthaltend 4% (w / v) EDTA, Wärme für 3 min in einem kochenden Wasserbad, Zentrifuge für 5 min bei 14.000 rpm und Einsatzes von 100 ul des reinen Überstands an die LFD-Gerät.

2. Anwendung von Serum und BAL auf die Lateral-Flow Geräte-

1. Lagern Sie die Lateral-Flow-Geräten bei Raumtemperatur (23 ° C). Bei dieser Temperatur sind Geräte für 12 Monate stabil. Entfernen Sie die Geräte aus den Beuteln und Ort auf einer ebenen Fläche.
2. Mit einer sterilen Pipettenspitze, gelten 100 ul vorbehandelten Serum oder ordentlich BAL-Probe zur Freisetzung Port des Geräts.
3. Lassen Sie die Assay für 15 Minuten bei Raumtemperatur, zu welchem ​​Zeitpunkt die Ergebnisse der Prüfungen aufzuzeichnen ausgeführt werden soll. Hinweis: Innerhalb von Sekunden wird die Flüssigkeit an sich seinde durch Kapillarwirkung entlang der Nitrocellulose-Membran im Beobachtungsfenster zu migrieren.

3. Aufnahme und Interpretation LFD Ergebnisse

1. Die LFD besteht aus einem internen Steuerleitung (angedeutet durch den Buchstaben C auf dem Kunststoff-Gehäuse) und eine Testlinie (gekennzeichnet mit dem Buchstaben T). Die Steuerung sollte in jedem Fall unabhängig von Aspergillus-Antigen werden im Serum oder BAL-Probe. Dies zeigt, dass der Test korrekt ausgeführt werden.
2. Wenn die Aspergillus-Antigen im Serum oder BAL-Probe, wird die Testlinie auch innerhalb 15 Minuten der Probe Anwendung angezeigt. Da die Intensität der Testlinie ist proportional zu der Menge von Aspergillus-Antigen in der Probe vorhanden, die Testlinie kann schwach positiv (+) angezeigt wird, eine moderate positiv (+ +) oder als stark positiv (+ + +) . Jedoch eine beliebige positive Testleitung, unabhängig von Intensität, deutet dies auf der Aspergillus-Antigen in der Probe. In the Abwesenheit von Aspergillus-Antigen, wird keine Testlinie erscheinen, und das Ergebnis wird als negativ aufgenommen (-).

4. Repräsentative Ergebnisse

Repräsentative Beispiele für negative, schwach positive, mäßig positive und stark positive Ergebnisse mit LFD BAL und Serum-Proben sind in Abbildung 1 dargestellt.

Ergebnisse der Antigen-positiven Tests LFD (schwache und starke) oder negativ LFD Tests mit BAL-Flüssigkeiten mit akuter myeloischer Leukämie (AML) nach Anspruch EORTC / MSG diagnostischen Kriterien diagnostiziert werden in Tabelle 1 gezeigt. In dieser Tabelle sind die entsprechenden klinischen und mykologischen (Galaktomannan und Kultur) Daten und Ergebnisse einer Aspergillus-spezifischen PCR-Test in St. Bartholomews Krankenhaus ⁸ entwickelt, für jeden Patienten. Die Diagnose der Krankheit wurde am Wirtsfaktoren (Neutropenie, verlängerter Einsatz von Kortikosteroiden, Behandlung mit anderen anerkannten T-Zell-immunos Basisuppressants), klinische Kriterien und GM Positivität für BAL (hier als GM-Index-Wert> 0,8 definiert). Unter den 2002 EORTC / MSG-Richtlinien ^10, Patienten, 12, 13 und 16 wurden mit "möglich" IA auf der Basis von Host-Faktoren und klinischen Kriterien oder GM Positivität diagnostiziert. Nach den revidierten (2008) EORTC / MSG-Richtlinien ^2, Wirtsfaktoren und GM Positivität allein oder Host-Faktoren und klinischen Kriterien allein würde nicht darauf hin, "möglich" invasiven Pilzinfektion, es sei denn durch Belege aus klinischen Daten und Mykologie bzw. begleitet. Patient 6 wurde mit "wahrscheinlich" IA unter beiden Richtlinien 2002 und 2008 wegen der Wirtsfaktoren, größere und kleinere klinische Merkmale und GM Positivität diagnostiziert. Beachten Sie, dass, während weder die LFD noch PCR-Assays zur Zeit in EORTC / MSG-Richtlinien enthalten sind, gibt es starke Übereinstimmung zwischen den beiden Assays und der kommerziellen Galaktomannan Test auf das Vorhandensein von Aspergillus-Antigen und Nukleinsäure in der BAL-Probe s der Patienten 6 und 12. Zusätzliche Ergebnisse von Studien, die die Wirksamkeit der LFD und PCR-Test bei der Diagnose von IPA kann in Johnson et al ⁸ zu finden.

Abbildung 1. Negativ (Steuerleitung nur) und positiven (Kontroll-und Testlinie) Ergebnisse der Tests mit LFD Serum und BAL. Die Intensitäten der Testlinie Reaktionen sind proportional zu den Konzentrationen der Ziel-Antigen im Serum und BAL-Proben. Reaktionen typischerweise im Bereich von schwach (+) durch moderate (+ +) bis stark (+ + +). Unabhängig von Testlinie Intensität würden alle drei Serum-positiven Reaktionen zeigen Lungenaspergillosen Krankheit aufgrund der Anwesenheit von zirkulierenden Aspergillus-Antigen im Blut. Positiv BAL Reaktionen (schwach, mittel oder stark) würde anzeigen, Keimen der Sporen und Entwicklung von potentiell pathogenen Hyphen in der Lunge.

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Patient nicht.	PatiHNO-Informationen	Klinische Kriterien 1	BAL Kultur 2	GM EIA Index 3	EORTC / MSG (2002) 4	EORTC / MSG (2008) 5	Aspergillus PCR-Ergebnis	LFD Ergebnis
6	-	Große CT Zeichen (Knötchen und Halo) und eine kleinere	Negativ	0,9 (positiv)	Wahrscheinlich	Wahrscheinlich	Positiv	Schwache positive (+)
12	Aus Mangel an früheren Pilzinfektion	Kein großer, ein minderjähriges	Candida glabrata	6,43 (stark positiv)	Möglich	Keiner	Positiv	Starke positive (+ + +)
13	Koagulase-negative Staphylokokkenylococcus und E. coli im Blut	Keine große, zwei kleinere	Negativ	0,25 (negativ)	Möglich	Keiner	Negativ	Negative (-)
16	Brust-Infektion	3 Minor Kriterien einschließlich neuer infiltrieren und Plural Erguss	Negativ	0,16 (negativ)	Möglich	Keiner	Negativ	Negative (-)

^Ein Knötchen oder Halos auf einer Computertomographie ist suggestive der Pilzinfektion
² Candida glabrata in der BAL würde als Verunreinigung angesehen werden, da es die zweithäufigste Hefe als Teil der normalen menschlichen Flora ⁹ isoliert ist
³ Ein Index von> 0,8 in der GM EIA Test der BAL ist bezeichnend für Aspergillus-Infektion
⁴ auf den 2002 EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für 'Basierend possible "," wahrscheinlich "oder" bewiesen "invasive Pilzerkrankung ^10
5 auf den überarbeiteten (2008) EORTC / MSG diagnostischen Kriterien für "möglich", "wahrscheinlich" oder "bewiesen" invasive Pilzerkrankung ² Basierend

Tabelle 1. Die Ergebnisse der Tests von LFD BAL-Proben von akuter myeloischer Leukämie Patienten mit wahrscheinlicher IPA und Kontrolle von AML-Patienten (keine Anzeichen einer Infektion) und EORTC / MSG Diagnose einer Infektion.

Diskussion

Definitive Identifizierung von IPA können nur dann wirklich durch Isolierung der Erreger aus Biopsie-Proben erreicht werden, sondern Wiederherstellung geeigneter Proben ist häufig nicht in sehr kranken Patienten möglich und Aspergillus ist selten wiederherstellbar aus dem Blut. Während die großen Fortschritte in der Anwendung von Computertomographie Abtasten der Brust in IPA Diagnose gemacht worden sind, sind Eigenschaften, die suggestive der pulmonalen IPA wie der "Halo" oder "Luft-Halbmond"-Schilder sind entweder flüchtig oder kann, um die Atmung Artefakten zugeschrieben werden oder andere Pilzinfektionen ^11,12. Solche Daten sind deshalb mit serologischen Techniken, die zur Unterzeichnung Moleküle (GM und β-Glucan) aus Pilzen, die im Serum des Patienten im Umlauf sind oder, die in BAL-Flüssigkeiten, Sputum oder Urin-Proben ermittelt werden, ¹³ sind ergänzt. Während diese Tests zufriedenstellend Empfindlichkeit zeigen, fehlt ihnen ausreichende Spezifität oder leiden an Störungen unter bestimmten Bedingungen ^1,6 .

Die LFD-Test für den IPA-Erkennung hier vorgestellten ermöglicht das "Point-of-Care" Diagnostik von IPA und Exploits Technologie, die verwendet wurde, um in Tests für den Nachweis von Viren, Bakterien, Parasiten und Giftstoffe ^14-19 Laufenden und, am bekanntesten, für die Schwangerschaftstests zuerst von Unipath 1988 eingeführt. In der hier beschriebenen Aspergillus LFD wird die Aspergillus-spezifischen MAb JF5 einer Einfangzone (die Testlinie) auf einer porösen Nitrozellulosemembran immobilisiert. Anti-Maus-Immunglobulin immobilisiert auf die Membran in einer gesonderten Zone diente als eine interne Kontrolle (control line). Bei Zugabe von Serum oder BAL-Flüssigkeit zu der Öffnung für die Freisetzung bindet MAb JF5-Gold-Komplexe in der Freigabestellung Kontaktstelle mit der Ziel-Antigen und der Komplex dann entlang der porösen Membran durch Kapillarwirkung. MAb JF5 in der Abfangzone immobilisiert bindet an die JF5-Gold-Antigen-Komplexes, was zu einer roten Testlinie. Nicht gebundenes JF5-GoldKonjugat bindet an die interne Kontrolle darauf hinweist, dass der Test korrekt ausgeführt werden. Dies führt zu einer rote Kontrolllinie.

Der Test ist schnell, wobei nur 15 Minuten zu führen, ist billig im Vergleich zu Serum und BAL Tests an GM und β-Glucan-Erkennung basiert und erfordert keine teure Ausrüstung oder umfangreiche Laboreinrichtungen zu laufen. Darüber hinaus bedeutet MAb JF5 nicht mit den Drogen oder Verunreinigungen, die gezeigt haben, um falsch-positive Reaktion in der GM-und β-Glucan-Tests ^1,4,6 verursachen kreuzreagieren. Ein weiterer großer Vorteil gegenüber aktuellen diagnostischen Tests ist die Fähigkeit, LFD Aktivität, die indikativ für invasive Wachstum von Aspergillus-Spezies ist zu erkennen.

Ein entscheidender Schritt bei der LFD Verfahren ist die Notwendigkeit zum Lesen der Ergebnisse von 15 min nach Anwendung des Serum oder BAL auf die Vorrichtung. Der Test sollte nicht länger als 15 min vor der Aufnahme die Ergebnisse gelassen werden, da dies zu Verzerrungen führen könnte interpretatiauf. Eine schwache Reaktion wird nicht durch die Verlängerung der Inkubationszeit verbessert werden. Wärmebehandlung von Serum aus Tiermodellen der Infektion wurde vor dem Test die Empfindlichkeit zu verbessern. Eine Einschränkung des Tests ist, dass es qualitative ist, und setzt auf die Betreiber, um eine subjektive Einschätzung der Positivität zu machen. Die Intensität der Testlinie variiert je nach den Antigen Inhalt Serum und BAL-Proben (1). Jedoch zeigt eine positive Reaktion (bestimmt durch Vergleich mit bekannten Negative) das Vorhandensein von Aspergillus Antigen und daher Infektion. Um die Subjektivität der LFD-Assays zu begrenzen, sind Handheld-Geräte verfügbar, die es erlauben die Quantifizierung der LFD Testlinie Intensitäten und ermöglichen die Festlegung von Schwellenwerten für Antigennachweis ^20.

Zukünftige Entwicklungen des LFD sind seine Kommerzialisierung und die Entwicklung eines Multiplex-LFD, die simultane Detektion von anderen invasiven Pilzerreger erlaubtmit hochspezifischen MAbs ^3.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Aspergillus LFD	University of Exeter		Frei ab dem entsprechenden Autor auf Anfrage
RPMI-1640	Sigma	R0883
L-Glutamin	Sigma	G7513
Fötales Kälberserum	Biosera	S9100	Andere Quellen von fötalem Kälberserum in der Herstellung von TCM verwendet werden
EDTA	Fisher Scientific	BPE120-1