İfade Klonlama tarafından Grb2 Sinyal Kompleksi Eğitim için bir Yüksek içerik Görüntüleme İş Akışı

Özet

Yetkili transmembran reseptörleri sinyal romanın tanımlanması için yüksek içerik tarama yöntemi açıklanmıştır. Bu yöntem büyük ölçekli otomasyon mükellef olup tanır hakkında öngörülerde In vivo Protein bağlama ve memeli hücrelerinde protein komplekslerinin alt-hücre lokalizasyonu.

Özet

Büyüme faktörü reseptörleri tarafından sinyal iletimi proliferasyon ve farklılaşma korumak için hücreleri için gerekli olan ve sıkı kontrol gerektirir. Sinyal transdüksiyonu bir transmembran reseptörü ve alt sinyalleme kaskadını aktivasyonu için harici bir ligand bağlayıcı tarafından başlatılır. Mitojenik sinyalizasyon bir anahtar regülatör Grb2, enzimatik aktivite yoksun iki SH3 etki ile çevrili bir iç SH2 (Src homoloji 2) etki oluşan modüler bir proteindir. Grb2 bir bileşeni olarak N-terminal SH3 etki yoluyla GTPaz son-of-Sevenless (SOS) ile ilişkilidir. Grb2 ve SH2 etki dolayısıyla SOS-Ras-MAP kinaz sinyal kaskad reseptör aktivasyonu kaplin fosforile tirozin kalıntılar büyüme faktörü reseptörlerine bağlanır. Buna ek olarak, sinyalleme ve reseptör endositoz bir pozitif ya da negatif bir düzenleyici olarak Grb2 için başka roller tarif edilmiştir. Grb2 ve modüler bu bileşimin özelliği, reseptör ve iletimine çeşitli dayayabilirsiniz düşündürmektedirE ^1-3 farklı yollar bir sürü boyunca sinyalleri.

Burada açıklanan plazma membranına Grb2 alımı izler basit bir mikroskop testtir. Bu yeşil floresan protein alt hücresel lokalizasyonu (GFP) etiketli bir uyarıcı ^4-6 yanıt Grb2 değişiklikleri ölçen bir test uyarlanmıştır. Böyle aktive Epidermal Büyüme Faktörü Reseptör olarak Grb2 bağlamak Plazma membran reseptörleri (EGFR) plazma cDNA ifadesi üzerine membran ve daha sonra hücreye endozomal bölmelere taşınmaya işe GFP-Grb2. Grb2 in vivo protein kompleksleri tespit etmek için bu teknik, Grb2 alt-hücre lokalizasyonu değişikliklere göre bir genom yüksek içeriğine ekran gerçekleştirmek için kullanılabilir. CDNA ifade klonlar, transfeksiyon ve görüntü elde etme hazırlanması aşağıda ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. , Maya-iki-hy olarak protein etkileşim ortakları belirlemek için kullanılan diğer genomik yöntemleri ile karşılaştırıldığında,Yapışıklıklara, bu yöntem, bir basit-tabanlı tahlil mikroskobu ile etkileşim alt-hücresel yerinde, memeli hücrelerinde protein komplekslerinin görüntülenmesine izin verir. Dolayısıyla böyle bir yerelleştirme şekilleri gibi nitel özellikleri, hem de etkileşim nicel gücü gibi değerlendirilebilir.

Protokol

1. CDNA İfade Klonlar Toplama

1. CDNA kütüphanesi, bir 96-gözlü formata gliserol stokları tek bir bakteriyel klonlar olarak sağlanır. Norgen CP7200 ve seçici menüsünden Rearray komutunu kullanarak, bir 96-derin kuyu (1 ml de) plaka 1.5 ml LB / amp içine kaynak plaka ve inokülasyon bakteriyel klon almak.
2. Bir gaz-geçirgen keçe ile derin kuyu plakaları ve bir çalkalama kabında 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.

2. CDNA İfade Kütüphanesi hazırlanması

1. Bir masa üstü santrifüj plaka adaptör kullanarak 20 dakika 2.000 rpm'de bakteri içeren derin kuyucuklu plakalar Spin.
2. Bakteriyel pelet zedelemeden, kuyulardan medya aspire.
3. Şekil 2'de gösterildiği gibi Lab otomasyon iş istasyonunun güverte yapılandırır. Plazmid hazırlama için çözümler 1-5 olukları içine dağıtılır ve derin kuyu plakası güverte üzerine yerleştirilir. Elüsyon çözeltisi ile bir oluk multiwellderin kuyucuklu plakaya bitişik yerleştirilir. İpuçları ucu rafları yüklenir.
4. Vakum manifoldunun birleştirin. Plazmid bağlayıcı levha manifoldu içine yerleştirildi ve plazmid filtre plakası manifold üstüne yerleştirilir.
5. Aşağı yukarı pipetleme ve tarafından 250 ul Çözüm 1 (Tekrar Süspansiyonu tamponu) pelet yeniden süspanse edin.
6. 250 ul Çözelti 2 (lizis tamponu) ilave bakterilerin bir parçalayıcı. Plaka mühürlü ve tam karıştırma sağlamak için ters çevrilir.
7. 2 dakika zamanlayıcı başlatın.
8. 350 ul Çözüm 3 (Nötralizasyon tamponu) ekleyin. Plaka Seal ve 3 kez ters.
9. Plazmid filtre plakalarına bakteri lizatları aktarın.
10. 5 dakika süreyle vakum uygulayın.
11. Filtre plakasını çıkarın ve manifold üstünde bağlayıcı plaka yerleştirin. 1 dakika için vakum uygulayın.
12. Ilave yıkama (AW) tampon 500 ul ekleyin.
13. 2 dakika süreyle vakum uygulayın.
14. Yıkama tamponu Çözüm 4 900 ul ekleyin. 2 dakika süreyle vakum uygulayın.
15. Tekrar s2.14 tep. Ek bir 15 dakika boyunca vakum uygula.
16. Manifoldundaki DNA toplama plakası yerleştirin. Bağlayıcı levha ile elüsyon tampon 100 ul ilave edin ve 2 dakika süreyle inkübe edilir.
17. 10 dakika için vakum.
18. Nanodrop 8000 kullanarak toplama plakası ve ölçü DNA konsantrasyonu çıkarın. Tipik olarak ~ bir verimle 100 ng / ml 'den bu yöntem ile tahmin edilebilir.

3. Hücre Seeding

1. HEK293 hücreleri tripsinize ve sayılır.
2. 2 x 10 ⁴ hücre ThermoFisher 96-multidrop kullanarak bir Perkin Elmer Viewplate her oyuğuna dağıtılır.
3. Hücreler gece boyunca 37 ° C'de inkübe edilir ve% 5 _CO2.

4. Transfeksiyon

1. 25 ul serum içermeyen aracı madde içinde başına da 96-kuyulu yuvarlak dipli bir levha içinde 100 ng cDNA ile 100 ng GFP-Grb2 plazmid DNA bir karışım hazırlayın.
2. Kuyu başına 0.5 ul Transfectin içeren 25 ul serum serbest medya ekleyin.
3. Mix ve zamanlayıcı fo başlarr 30 dk.
4. Hafif bir dağıtma yöntemi kullanılarak hücrelere Transfectin / cDNA karışımı 50 ul aktarın. Alternatif olarak, transfeksiyon karışımı levhaları içine ilk olarak dağıtılır ve daha sonra hücreler üzerine ilave edilebilir (ters transfeksiyon).
5. 37 hücreleri gece boyunca inkübe ° C ve% 5 _CO2.

5. Image Acquisition

1. Opera yazılımını başlatın. Deney bir düzeneğin ekran görüntüsünü, Şekil 3'te gösterilmiştir. "Yapılandırma" sekmesini seçin ve 20x objektif ve doğru plaka tipini seçin. "Yaka" olun farklı plaka tipleri ile odaklama sağlamak için objektif üzerinde doğru değere ayarlanır.
2. "Mikroskop" sekmesini seçin. Olarak FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak maruz tanımlama 1 UV (365 lazer). Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin.
3. "Mikroskop" sekmesini seçin. E tanımlayınUV (365 lazer) gibi FITC (488 lazer) ve pozlama 2 olarak Xposure 1. Hem riskler üzerine UV filtresini etkinleştirin ve kamera 1 ve kamera 2 maruziyeti 2 maruziyeti 1 atayın. Pozlama 1 ve pozlama 2 için 40 msn, 800 msn maruz kalma süreleri belirleyin.
4. Pozlama 1 seçin. Yüksekliği 0 mikron odağı ayarlayın. "Odaklama" öğesini seçin. Bir kez odaklı, kamera 1. açığa. Pozlama düzlemi optimize etmek ve "Al yükseklik" üzerine tıklayın odağı yüksekliğini ayarlayın. ~ 3.000 maksimum piksel yoğunluğu vermek pozlama süreleri ve lazer güç değiştirin. Pozlama parametreleri kaydediniz. Pozlama 2 için tekrarlayın.
5. "Experiment Definition" sekmesini seçin. Düzen ve sublayout oluşturun. Sürükle ve ilgili düzeni, pozlama, referans görüntü, skewcrop dosya ve sublayout bırakın. Deney kaydedin.
6. "Otomatik Experiment" sekmesini seçin ve görüntüleri elde.

6. (ImageJ 1.46h sürümü dayanarak.) Görüntü Analizi

1. Kullanarak özel PerkinElmer dönüştürün. Esnek dosyaları Tagged Image Format. Tif dosyasıFlex2Volocity Acapella komut.
2. 1. Bir yığın sonuçlanan bir görüntü dizisi gibi ImageJ görüntüleri aktarın.
   2. Hyperstack menü öğesi Resim / Hyperstack / Stack seçerek 2 kanal hyperstack içine yığın dönüştürün. Dilim sayısı alınan yığının yarısı ile ayarlanmalıdır.
   3. Resim / Duplicate komutunu kullanarak GFP kanalı çoğaltın: Yinelenen hyperstack onay kutusunu işaretleyin ve Kanallar belirtin: 1-1. Ahiret çoğaltılamaz yığın kullanın.
3. İşlem Seçin / 0.01% doymuş piksel Kontrast Geliştir, yığın histogram kullanılarak ve Image/Type/8-bit ile 8 bit dönüştürmek.
4. Kontrast eşiği (Parametre 1) q = 30 ile Bernsen algoritması kullanılarak 15 piksel yarıçapı yerel uyarlamalı segmentasyon tanımlayın. Görüntü ayarla / / Otomatik Yerel Eşik menüsünde siyah arka plan onay kutusunu Beyaz nesneleri işaretleyin.
5. Segmentasyon kalite kontrol: orijinal görüntüler üzerinde segmante nesnenin kontur bindirme oluşturur.
6. Fonksiyonlarıparçacıklar analiz ederek ekstraksiyon re: Ölçüm alanı, demek ve her organel toplam yoğunluğu. Sonuç dosyaları kaydedin.
7. R özellikleri sonucu dosya açın ve bir histogram oluşturur.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Normal şartlar altında Grb2 tüm hücre boyunca lokalizedir. Bir büyüme faktörü reseptörünün uyarılması üzerine bunun plazma membranı ile tercüme ediyor ve Şekil 4 'de gösterildiği gibi daha sonra endozomlar içine içsellestirildi. Bağlayıcı Grb2 yeteneğine sahip bir hücre yüzey reseptörü ifade translokasyon uyarmak için yeterlidir. Tipik bir tarama deneyinde, GFP-Grb2 yerelleştirme herhangi bir değişiklik gözlenmiştir. Ancak, bir protein ifade edildiği zaman, bir alt-hücresel siteye askerler Grb2, floresan mikroskobu ile kolaylıkla görülebilmektedir olabilir lokalizasyon bir değişiklik olduğunu. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında relokalizasyon içinde EGFR sonuçları örneği, ifade için (Şekil4). Bu nedenle, bir genom kitaplığı uygulanırken, bu yeni Grb2-bağlayıcı hücre yüzey proteinleri ile tespit edilebilir olması beklenebilir.

Bu yöntem, hücre yüzey proteinlerinin tespiti ile sınırlı değildir. Örneğin, Dynamin2 GFP-Grb2 endosome gibi işe (Şekil 5) görüntüleme alt-hücre lokalizasyonu bir değişim olmaktadır. Dynamin2 Grb2 ve C-terminal domain SH3 bağlanır ve bu kompleks ^9,10 endositoz yer almaktadır. Dolayısıyla, bu yaklaşım, genel protein bağlayıcı komplekslerin belirlenmesine olanak tanır ve SH2 etki için etkileşim ortak tanımlanması ile sınırlı değildir.

Translokasyon birkaç farklı türde başka sitoplazmik veziküler yapı veya çekirdek için, endozomlar için, bu tür plazma membranına yerelleştirme olarak beklenebilir. Bu nedenle, tüm görüntüleri de göz tarafından kontrol edilmesi tavsiye edilir. Bununla birlikte, büyük kümeler tarama sırasında otomatik bir cDNAgörüntü analizi algoritması daha pratiktir. Bu durumda, algoritmalannın birleşiminin bu tür hücresel şekil değişiklikleri belirlemek için mekik nükleer ve genel morfolojik algoritmaları belirlemek için endozomlar, sitoplazma / çekirdek tespit belirlemek için nokta algılama gibi arzu edilen bir durumdur. Bu farklı fenotipik algılama yöntemlerinin kullanılması başka ¹¹ daha ayrıntılı olarak ele alınmıştır.

Şekil 1. Deney Genel düzeni. Deneme ayrıntılarının cDNA kütüphanesinin amplifikasyon ve hazırlık, ücretsiz açık yazılım ImageJ kullanılarak cDNA vektörler artı muhabiri yapıları, görüntü elde etme ve görüntü analizi transfeksiyon ile başlayan tam bir yüksek içerik tarama iş akışı.

FTecan Deck ŞEKIL 2. Yapılandırma. (1) sol tarafında, beş 100 ml olukları tamponları 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) ve A4 (100 mi) ile doldurulması gerekmektedir. Yalak A4 prosedürü sırasında bir kez yeniden doldurulması gerekir. (2) vakum manifoldu, bu örnekte pozisyon 14 üzerinde yer alır. (3) Bakteri peletleri ile derin kuyu plakası 25 ml Seyreltme Tampon maddesi ile elüsyon tampon teknesine sonraki pozisyonu, 30 üzerinde yer alır. (4) 8-kanal baş Disposable ipuçları pozisyonu 40 doldurulması gerekir kanallı kafa için sol tarafta ve ipuçları üzerinde ucu raflara yüklenmesi gerekiyor. Bu deneyde kullanılan Tecan FreedomEvo sıvı işleyici 500 ul şırınga ile donatılmıştır. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

ŞekilOpera LX görüntü elde etme 3. Otomasyon. A) Yapılandırma sekmesini seçin (1). Deneme (2) için gerekli lazer çizgileri etkinleştirin. Görüntü elde etme (3) kameraları seçin. Deneme (4) plaka tipi ve objektif lens seçin. B) mikroskop sekmesini seçin (1). Işık kaynağı ve pozlama 1 (2,3) için pozlama süresini tanımlayın. Iyi birine odaklanın ve yükseklik (4) alabilir. C) Deney Tanım sekmesini seçin (1). Sürükle ve pozlama, skewcrop, referans, düzen ve sublayout dosyaları (2) bırakın. Sürükle ve deney dosya (3) bırakın. D) Otomatik Deneyi (1) seçin. Sürükle ve deneme dosyası (2) bırakın. Uygun barkod (3) ayırın. Start düğmesine (4) tıklayarak görüntü yakalama başlayın. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 4. GFP-Grb2 translokasyon. GFP-Grb2 bir transmembran büyüme faktörü reseptör ekspresyonu üzerine endosome benzeri yapılara baskın bir sitoplazmik yerleşim bölgesine yerleştirir ve akabinde endozomlar için içselleştirir. Sol tarafta, COS M6 hücrelerin mikroskop görüntüleri geçici GFP-Grb2 (üst) veya GFP-Grb2 artı EGFR (alt) ile transfekte olduğu gösterilmiştir. Endosome benzeri yapılara GFP-Grb2 arasında tehcir EGFR sonuçlarının Co-ifadesi.

Şekil 5. GFP-Grb2 cDNA indüklenen translokasyon örneği. Grb2-aracılı endositoz katılır GTPaz Dynamin2, endosome benzeri yapılar (daire) için GFP-Grb2 yerleştirir. Bu deneyde, GFP-Grb2 HEK293T hücreleri içine DNM2 ile birlikte transfekte edildi. 24 saat ve görüntüleri ope yakalanmaları sonrasında Hücreler Hoechst 33342 ile boyandıra LX. Bir yeşil (GFP) kanal görüş alanı ve UV (mavi; Hoechst 33342) görüntülenir.

Tartışmalar

İfade klonlama gibi virüs reseptörleri ve kan hücre antijenleri ¹² gibi yeni hücresel bileşenleri tanımlamak için geçmişte kullanılan bir güçlü bir araçtır. Burada, Grb2 bağlanan yeni varsayımsal sinyal iletim reseptörlerin belirlenmesini kolaylaştırmak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Protokolü bir kaç kritik adımlar vardır.

1. Otomatik plazmid hazırlanması için bu bakteriyel pelet tam olarak yeniden süspanse olması kesinlikle gereklidir. Bazı durumlarda, katı bir sallama adım ya da pipet ile daha ileri karıştırma dahil etmek için gereklidir.
2. Çözelti, 2 ve 3 eklendikten sonra, karışım tamamlanması önemlidir ve el ile ters mühürlü bir otomatik plaka çalkalayıcısı kullanımı çok daha etkili olduğunu bulduk. Bu DNA kesme yol açacak gibi pipetleme bu aşamada kaçınılmalıdır.
3. Bütün vakum adımda, bir sıvı tamamen boşaltılır sağlamak zorundadırplaka. Aksi takdirde, düşük verimler beklenmez.
4. Elüsyon sonra, o arındırıldı ve plazmid bağlayıcı plaka alt kısmında, su damlalarının oldukça yaygındır. Bu damlalar elüsyon plakasında toplanırken edilmesi gerekir, bu yüzden plazmid bağlayıcı levha dikkatli bir şekilde kaldırılır ve alt kısmında herhangi bir kalıntı dikkatli bir şekilde damla elüsyon için levha transfer edilmesi tavsiye edilir.
5. Transfeksiyondan sırasında kompleks oluşumunun zaman çok önemlidir. Biz genellikle 20-30 dk uymak. Daha kısa sürelerde tavsiye edilmez ise 1 saat kadar uzun kat, verimde bir azalma olmadan gayet iyi.
6. Mikroskopi için, büyütme seçimi önemlidir. Burada kullanılan Opera LX sisteminde, 20x çözünürlük yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yeterlidir. Yüksek çözünürlüklü görüntüler gerekiyorsa, nesnel hücrelerin istatistiksel olarak anlamlı numaralarını almak için değişti, ama olabilir, alanlar ve yüksek satın alma kez daha yüksek bir sayı gereklidir. Genel olarak, bu amaçkuyu başına yansıması en az 100 hücre elde etmek.

Grb2 translokasyon tahlil EGFR kinaz aktivasyonu ⁶ küçük molekül inhibitörleri tanımlamak için diğer gruplar tarafından kullanılmıştır. Bu durumda, EGFR, özellikle ligand plazma membranına Grb2 alımına yol ile aktive edilir. Bu etkileşimin bozulması sonra küçük molekül bileşikleri kullanılarak incelenebilir. Benzer bir şekilde, siRNA ekranlar EGFR-Grb2 sinyal ya da c-Kit veya eritropoietin reseptörü gibi diğer Grb2-bağlayıcı büyüme faktörü reseptörleri ile ilgili endojen genlerin tanımlanması için kullanılabilir, ki öngörülebilir. Bu nedenle, bu yöntem için birden fazla potansiyel uygulamalar vardır. Benzer bir yaklaşım, SHC, Gab veya IRS gibi diğer adaptör moleküller için GFP etiketli muhabiri sistemlere uygulanabilir.

Memeli hücrelerinde bu hücre-tabanlı tahlil kullanarak bir büyük avantajı, fizyolojik rel kimlik olanak tanımasıdırTemiz su ve etkileşimleri. Tahlil protein kompleksi oluşumu için bir gösterge olduğunu, ancak daha da önemlisi, ilgili etkileşimler doğru alt hücresel yerinde takip edilmektedir. Bu bağlamda, bu yöntem bu tür maya iki-hibrid ya da in vitro tahlillerin gibi diğer protein-protein etkileşimi yöntemler kalıntıların üstesinden gelir. Bu dolaylı etkileşimleri aynı zamanda Grb2 alım neden olabilir ki, ancak dikkate alınmalıdır. Benzer şekilde, bağlayıcı ortakların transkripsiyonel up-regülasyonu cDNA ifadesi neden olabilir. Bu olasılıklar arasında ayrım için, doğrudan ve dolaylı bağlayıcı etkileri ayırt etmek için uygun ikincil deneyleri gerçekleştirmek için gereklidir.

Sonuç olarak, GFP-adaptör molekül translokasyon tahlil genom taraması ve ilaç keşif uygulamaları için yüksek bir potansiyele sahiptir.

Malzemeler

Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
cDNA kütüphanesi	Origene
LB + amp
Gaz geçirgen keçe	ThermoScientific	AB-0718
NucleoSpin 96 Plazmid Takımı	Macherey-Nagel	740625.4
Transfectin	BioRad	170-3351
Hoechst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	Perkin Elmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Özgürlük Evo	Tecan		Vakum manifoldu ile
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	Perkin Elmer