Ein High-Content-Imaging Workflow Grb2 Signaling-Komplexe durch Expression Cloning Studie

Zusammenfassung

Ein High-Content-Screening-Verfahren zur Identifizierung von neuartigen Signalisierung zuständigen Transmembranrezeptoren beschrieben. Diese Methode ist zugänglich für großflächige Automatisierung und ermöglicht Vorhersagen über In vivo Proteinbindung und die sub-zelluläre Lokalisation von Protein-Komplexen in Säugetierzellen.

Zusammenfassung

Signaltransduktion durch Wachstumsfaktor-Rezeptoren ist wesentlich für Zellen zur Proliferation und Differenzierung zu halten und erfordert eine strenge Kontrolle. Signaltransduktion wird durch Bindung eines Liganden an einen externen Transmembranrezeptor und Aktivierung der nachgeschalteten Signalkaskaden initiiert. Ein wesentlicher Regulator von mitogener Signalgebung ist Grb2, eine modulare Protein eines internen SH2 (src-Homologie 2)-Domäne durch zwei SH3-Domänen, die enzymatische Aktivität fehlt flankiert zusammengesetzt. Grb2 konstitutiv mit der GTPase son-of-Sevenless (SOS) über seine N-terminale SH3-Domäne verbunden. Die SH2-Domäne von Grb2 bindet an Rezeptoren der Wachstumsfaktoren an phosphorylierte Tyrosinreste damit Kopplung Aktivierung des Rezeptors an die SOS-Ras-MAP-Kinase-Signalkaskade. Darüber hinaus haben weitere Rollen für Grb2 als positiver oder negativer Regulator der Signalisierung und Rezeptorendozytose beschrieben worden. Der modulare Aufbau der Grb2 legt nahe, dass es zu einer Vielzahl von Rezeptoren und Transduktion andockene signalisiert entlang einer Vielzahl verschiedener Wege ^1-3.

Beschrieben ist hier eine einfache Mikroskopie Assay, Rekrutierung von Grb2 überwacht an der Plasmamembran. Es ist aus einem Assay, der Änderungen in subzellulären Lokalisation von grün-fluoreszierende Protein (GFP)-tagged Grb2 in Reaktion auf einen Reiz ^4-6 misst angepasst. Plasmamembran-Rezeptoren, wie Grb2 aktiviert Epidermal Growth Factor Receptor binden (EGFR) Rekrutenschule GFP-Grb2 zur Plasmamembran auf cDNA-Expressions und anschließend endosomalen Kompartimenten in der Zelle zu verlagern. Um in vivo-Protein-Komplexe von Grb2 identifizieren, kann diese Technik verwendet, um eine genomweite High-Content-Bildschirm auf Veränderungen in Grb2 subzelluläre Lokalisation basierend auszuführen. Die Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek Klone, Transfektion und Bildaufnahme werden im Folgenden ausführlich beschrieben. Im Vergleich zu anderen Methoden verwendet werden, um genomische Protein Interaktionspartner zu identifizieren, wie zB Hefe-Zwei-hybrid erlaubt diese Technik die Visualisierung von Proteinkomplexen in Säugerzellen im subzelluläre Ort der Interaktion mittels Mikroskopie-basierten Assay. Daher beide qualitativen Merkmale wie Muster der Lokalisierung kann beurteilt, sowie die quantitative Stärke der Wechselwirkung werden.

Protokoll

Ein. Picking cDNA Expression Clones

1. Die cDNA-Bibliothek wird als einziges Bakterienklone in Glycerinstammkulturen in einer 96-Well-Format bereitgestellt. Verwendung des Rearray Befehl im Menü des Picker Norgen CP7200, Pick Bakterienklone von der Quelle Platte und Inokulat in 1,5 ml LB / amp in einer 96-Deepwell (1 ml well) Platte.
2. Verschließen Sie die Deepwell-Platten mit einer gasdurchlässigen Dichtung und über Nacht bei 37 ° C in einem Shaker.

2. Herstellung von cDNA-Expressionsbibliothek

1. Drehen Sie die Deepwell-Platten, die die Bakterien bei 2.000 rpm für 20 min mit Platte Adapter in einer Tischzentrifuge.
2. Absaugen Medien aus dem Brunnen, verlassen das Bakterienpellet intakt.
3. Konfigurieren des Deck des Laborautomatisierung Arbeitsstation wie in Abbildung 2 dargestellt. Lösungen für Plasmid Herstellung sind in Tröge 1-5 verteilt und die Deepwell Platte auf dem Deck angeordnet ist. Mehrgefässanordnung Trog mit Elutionslösungplatziert ist benachbart zum Deepwell Platte. Trinkgelder sind in den Spitzenracks geladen.
4. Montieren Sie die Vakuumkammer. Das Plasmid Bindungsplatte ist im Inneren des Verteilers angeordnet ist und das Plasmid Filterplatte wird auf der Oberseite des Verteilers angeordnet.
5. Resuspendieren Pellets mit 250 ul Lösung 1 (Resuspensionspuffer) durch Auf-und Abpipettieren.
6. Lyse der Bakterien durch Zugabe von 250 ul Lösung 2 (Lysepuffer). Die Platte ist abgedichtet und invertiert, um vollständiges Mischen zu ermöglichen.
7. Start 2 min Timer.
8. Fügen Sie 350 ul Lösung 3 (Neutralisation Puffer). Verschließen Sie die Platte und invertieren 3 mal.
9. Übertragen Sie die Bakterienlysate den Plasmid Filterplatten.
10. Bewerben Vakuum 5 min.
11. Filterscheibe entnehmen und platzieren Sie die Bindungsplatte auf dem Verteiler. Bewerben Vakuum für 1 min.
12. Fügen Sie 500 ul zusätzliche Wäsche (AW) Puffer.
13. Bewerben Vakuum für 2 min.
14. Fügen Sie 900 ul Waschpuffer Solution 4. Bewerben Vakuum für 2 min.
15. Wiederholen step 2,14. Anwenden Vakuum für weitere 15 min.
16. Zeigen DNA Klingelbeutel innerhalb des Verteilers. Fügen Sie 100 ul Elutionspuffer auf die Bindungs-und inkubieren für 2 min.
17. Vakuum für 10 min.
18. Entfernen Klingelbeutel und messen DNA-Konzentration mit dem Nanodrop 8000. Typischerweise wird eine Ausbeute von ~ 100 ng / ul können mit dieser Methode zu erwarten.

3. Zellaussaat

1. HEK293-Zellen werden trypsiniert und gezählt.
2. 2 x 10 ⁴ Zellen in jede Vertiefung einer PerkinElmer Viewplate mit dem ThermoFisher 96-well Multidrop verzichtet.
3. Die Zellen werden über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.

4. Transfektion

1. Vorbereiten einer Mischung aus 100 ng GFP-Grb2 Plasmid DNA mit 100 ng der cDNA in 25 ul serumfreiem Medium pro Vertiefung einer Rundboden-96-Well-Platte.
2. Fügen Sie 25 ul Serum-freie Medien mit 0,5 ul Transfectin pro Vertiefung.
3. Vermischen und Timer-for 30 min.
4. Übertragen 50 ul cDNA / Transfectin Mix, um Zellen mit einem sanften Dosierung. Alternativ kann die erste Transfektionsgemisch zu Platten verzichtet werden und dann Zellen zugegeben oben (umgekehrter Transfektion).
5. Inkubieren Zellen über Nacht bei 37 ° C und 5% CO _2.

5. Image Acquisition

1. Starten Sie Opera Software. Ein Bildschirm-Schnappschuss des Versuchsaufbaus ist in Abbildung 3 dargestellt. Wählen Sie die Registerkarte "Konfiguration" und wählen 20x-Objektiv und die richtige Plattentyp. Stellen Sie sicher, "Kragen" ist auf den korrekten Wert am Ziel gesetzt, für die Fokussierung mit verschiedenen Plattentypen ermöglichen.
2. Wählen Sie das "Microscope" tab. Definieren Exposition 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2.
3. Wählen Sie das "Microscope" tab. Definieren Sie exposure 1 als FITC (488 Laser) und Belichtung 2 als UV (365 Laser). Aktivieren Sie die UV-Filter auf beiden Belichtungen und weisen Exposition 1 auf die Kamera 1 und Exposition 2 zur Kamera 2. Set Belichtungszeiten bis 800 ms für die Exposition 1 und 40 ms für die Exposition 2.
4. Wählen Belichtung 1. Setzen Sie den Fokus Höhe auf 0 um. Wählen Sie "Focus". Sobald konzentriert, setzen Kamera 1. Stellen Sie den Fokus Höhe, um den Belichtungsebene optimieren und klicken Sie auf "Take Höhe". Ändern der Belichtungszeiten und Laserleistung auf einen maximalen Pixelintensität ~ 3.000 zu ergeben. Speichern Expositionsparameter. Wiederholen Sie für die Exposition 2.
5. Wählen Sie "Experiment Definition". Neues Layout und sublayout. Ziehen Sie die entsprechenden Layout, Belichtung, Referenzbild, skewcrop Datei und sublayout. Speichern Experiment.
6. Wählen Sie "Automatisch Experiment" Registerkarte und Bilder aufzunehmen.

6. Image Analysis (auf ImageJ 1.46h-Version.)

1. Konvertieren Sie die proprietären PerkinElmer. Flex Dateien Tagged Image Format. Tif-Datei mit demFlex2Volocity Acapella Skript.
2. 1. Importieren Bilder in ImageJ als Bildsequenz, was zu einem Stapel.
   2. Wandeln Sie den Stapel in einem 2-Kanal-HyperStack, indem Sie die Image / HyperStack / Stack zu HyperStack Menüpunkt. Die Anzahl der Scheiben müssen zur Hälfte des eingeführten Stapel eingestellt werden.
   3. Duplizieren Sie die GFP-Kanal mit dem Bild / Befehl Duplizieren: kreuzen Sie das Doppelte HyperStack Checkbox und geben Channels: 1-1. Jenseits verwenden vervielfältigt Stapel.
3. Wählen Sie Process / Enhance Contrast mit 0,01% gesättigte Pixel, mit Stapel-Histogramm und konvertieren zu 8 Bit mit Image/Type/8-bit.
4. Definieren Sie eine 15 Pixelradius lokale adaptive Segmentierung mit den Bernsen Algorithmus mit Kontrastschwelle (Parameter 1) q = 30. Kreuzen Sie die Weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund Checkbox in der Bild / Anpassen / Auto Local Threshold-Menü.
5. Segmentation Qualitätskontrolle: Erzeugung segmentierter Objektkontur Overlay auf den Originalbildern.
6. Feature Extraktion durch Analyse von Partikeln: Messbereich, Mittelwert und insgesamt Intensität jeder Organelle. Ergebnis speichern Dateien.
7. Öffnen Sie die Eigenschaften ergeben Datei in R und erzeugen ein Histogramm.

7. Repräsentative Ergebnisse

Unter normalen Bedingungen Grb2 wird während der gesamten Zelle lokalisiert. Bei Stimulierung eines Wachstumsfaktor-Rezeptors ist transloziert zur Plasmamembran und anschließend in Endosomen internalisierten wie in Abbildung 4 dargestellt. Die Expression eines Zelloberflächen-Rezeptor binden kann Grb2 ist ausreichend, um die Translokation zu induzieren. In einem typischen Experiment Screening, wird keine Änderung in GFP-Grb2 Körperregion beobachtet. Wenn jedoch ein Protein exprimiert wird, dass ein Grb2 Rekruten subzelluläre Ort, gibt es eine Änderung in der Lokalisierung, die leicht sichtbar gemacht werden kann durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Zum Beispiel werden die Expression der EGFR führt Relokalisation von GFP-Grb2 um Endosom Strukturen (Abbildung4). Wenn somit Anwenden einer Genom-weiten Bibliothek, kann erwartet werden, dass neuartige Grb2-bindende Zelloberflächenproteine ​​identifiziert werden kann.

Dieses Verfahren ist nicht auf die Detektion von Zelloberflächenproteinen begrenzt. Zum Beispiel induziert Dynamin2 eine Änderung in sub-zelluläre Lokalisation von GFP-Grb2 Anzeige Endosom-like Rekrutierung (Abbildung 5). Dynamin2 bindet an das C-terminale SH3-Domäne von Grb2 und in Endozytose dieses Komplexes ^9,10 beteiligt. Somit ermöglicht dieser Ansatz die allgemeine Identifizierung von Protein-bindenden Komplexe und ist nicht auf die Identifikation der Interaktionspartner für die SH2-Domäne begrenzt.

Mehrere verschiedene Typen von Translokation kann wie Lokalisierung zur Plasmamembran zu erwarten ist, um Endosomen anderen cytoplasmatischen vesikulären Strukturen oder den Zellkern. Daher ist es empfehlenswert, dass alle Bilder auch von Auge inspiziert. Allerdings, wenn Screening großer Mengen von cDNAs eine automatisierteBildanalyse-Algorithmus ist praktischer. In diesem Fall ist eine Kombination der Algorithmen wünschenswert, wie beispielsweise Winkel-Erkennung, um Endosomen Cytoplasma / Kern Detektion identifizieren nuklearen pendelt und allgemeinen morphologischen Algorithmen identifizieren, um zelluläre Formänderungen identifizieren. Die Verwendung dieser unterschiedlichen phänotypischen Nachweisverfahren hat an anderer Stelle ¹¹ diskutiert.

Abbildung 1. Insgesamt Schema des Experiments. Das Experiment Angaben eine komplette High-Content-Screening Workflow beginnend mit der Amplifikation und Präparation der cDNA-Bibliothek, die Transfektion von cDNA-Vektoren sowie Reporterkonstrukte, Bildaufnahme und Bildauswertung unter Verwendung des freien offenen Software imagej.

FBBILDUNG 2. Konfiguration der Tecan Deck. (1) Auf der linken Seite, müssen fünf 100 ml Tröge mit Puffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) und A4 (100 ml) gefüllt. Trough A4 müssen einmal während des Verfahrens wieder gefüllt. (2) Der Vakuumverteiler an Position 14 in diesem Beispiel befindet. (3) Der Deepwell Platte mit bakteriellen Pellets auf Position 30, neben dem Elutionspuffer Trog mit 25 ml Elutionspuffer befindet. (4) Einweg-Tips für den 8-Kanal-Kopf müssen in den Spitzenracks auf der linken Seite und Tipps für die Mehrkanal-Kopf geladen werden müssen, auf Position 40 gefüllt werden. Die Tecan FreedomEvo Liquid Handler, die in diesem Experiment verwendet wird, wird mit 500 ul Spritzen ausgestattet. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung3. Automatisierung der Bildaufnahme über die Opera LX. A) Wählen Sie die Registerkarte Konfiguration (1). Aktivieren die Laserlinien zum Versuch (2) erforderlich. Wählen Sie die Kameras zur Bildaufnahme (3). Wählen des plattenförmigen und die Objektivlinse für das Experiment (4). B) Wählen Sie das Mikroskop Registerkarte (1). Definieren Sie die Lichtquelle und die Belichtungszeit für die Exposition 1 (2,3). Konzentrieren Sie sich auf ein gut und nehmen Höhe (4). C) Wählen Sie das Experiment Registerkarte Definition (1). Drag & Drop Belichtung, skewcrop, Referenz, Layout und sublayout Dateien (2). Drag & Drop das Experiment Datei (3). D) Wählen Sie Automatische Experiment (1). Drag & Drop Experiment Datei (2). Bereitstellung angemessener Barcode (3). Starten Bildaufnahme, indem Sie auf die Start-Taste (4). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Abbildung 4. GFP-Grb2-Translokation durch cDNA Ausdruck. GFP-Grb2 zieht aus einem überwiegenden cytoplasmatische Lokalisation an Endosom-ähnliche Strukturen auf Überexpression eines Transmembran Wachstumsfaktor-Rezeptor internalisiert und anschließend um Endosomen. Auf der linken Seite sind Mikroskopie-Aufnahmen von COS M6 Zellen gezeigt, dass wurden transient mit GFP-Grb2 (oben) oder GFP-Grb2 und EGFR (unten) transfiziert. Co-Expression von EGFR den Ergebnissen bei der Verlagerung von GFP-Grb2 um Endosom-ähnlichen Strukturen.

Abbildung 5. Beispiel cDNA-induzierte Translokation von GFP-Grb2. Die GTPase Dynamin2, die in Grb2 Endocytose beteiligt ist, verlagert, um GFP-Grb2 Endosom Strukturen (eingekreist). In diesem Experiment wurde GFP-Grb2 mit DNM2 in HEK293T-Zellen co-transfiziert. Die Zellen wurden mit Hoechst 33342 gefärbt nach 24 h und Bilder auf dem Ope erworben wurdenra LX. Einem Sichtfeld des grünen (GFP) Kanal und der UV (blau; Hoechst 33342) angezeigt wird.

Diskussion

Expressionsklonierung ist ein leistungsstarkes Werkzeug, das in der Vergangenheit verwendet wurde, um neuartige zellulären Komponenten wie Viren Rezeptoren und Blutzellen-Antigene ¹² identifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um die Identifikation von neuartigen putativen Signaltransduktion Rezeptoren binden, die Grb2 erleichtern.

Es gibt ein paar wichtige Schritte im Protokoll.

1. Für die automatisierte Plasmidpräparation ist es unbedingt erforderlich, um eine vollständige Resuspension des Bakterienpellet haben. Manchmal ist es notwendig, eine rigorose Schüttelschritt oder weitere Vermischung mit Pipetten umfassen.
2. Bei der Zugabe der Lösung 2 und 3, vollständige Vermischung notwendig und wir haben herausgefunden, dass der versiegelte manuell invertierenden Platte effizienter ist als die Verwendung eines automatisierten Schüttler ist. Pipettiervorrichtung sollte in diesem Schritt vermieden werden, da sie auf Scherung der DNA führen würde.
3. In allen Vakuumöffnungen Schritte, muss man sicherstellen, dass die Flüssigkeit vollständig entwässertvon der Platte. Ansonsten niedrigen Renditen zu erwarten sind.
4. Bei der Elution, ist es durchaus üblich, dass Eluat Form an der Unterseite des Plasmids Bindungsplatte abfällt. Diese Tropfen müssen in der Elution Platte gesammelt werden, so empfiehlt es sich, dass das Plasmid Bindungsplatte sorgfältig und hob alle restlichen Tropfen an der Unterseite sorgfältig zu dem Eluat Platte übertragen.
5. Während der Transfektion, ist die Zeit der Komplexbildung kritisch. Wir gehen normalerweise in 20-30 min halten. Längere Zeiten bis zu 1 h sind ohne Verringerung der Ausbeute in Ordnung, während kürzere Zeiten nicht empfohlen.
6. Für die Mikroskopie, ist die Wahl der Vergrösserung wichtig. Auf der Opera LX hier verwendete System ist die Auflösung bei 20x ausreichen, um qualitativ hochwertige Bilder zu erhalten. Wenn Bilder mit höherer Auflösung erforderlich sind, das Ziel verändert werden kann, sondern um statistisch signifikante Anzahl von Zellen zu erhalten, werden eine größere Anzahl von Feldern und höheren Erfassungszeiten erforderlich. Im Allgemeinen streben wirauf mindestens 100 Zellen pro Vertiefung erhalten abgebildet.

Der Assay wurde Grb2 Translokation von anderen Gruppen verwendet worden, um kleine Moleküle als Inhibitoren von EGFR-Kinase-Aktivierung ⁶ identifizieren. In diesem Fall wird die EGFR spezifisch mit Ligand Bewirken Rekrutierung von Grb2 zur Plasmamembran aktiviert. Disruption dieser Interaktion kann dann untersucht mit kleinen Molekülverbindungen werden. Ebenso kann vorgesehen sein, dass siRNA Screens eingesetzt werden können, um endogene Gene EGFR-Signalgebung Grb2 oder andere Grb2-bindenden Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wie c-KIT oder Erythropoietin-Rezeptor beteiligt identifizieren. Somit gibt es mehrere mögliche Anwendungen für diese Technik. Ein analoger Ansatz könnte auf GFP-markierten Reporter für andere Adapter Moleküle wie Shc, Gab oder IRS angewendet werden.

Ein wesentlicher Vorteil der Verwendung dieser zellbasierten Assay in Säugetierzellen ist, dass sie die Identifizierung von physiologisch rel ermöglichtvanten Interaktionen. Der Test ist ein Messwert für Protein-Komplex Bildung, aber noch wichtiger ist, die relevanten Wechselwirkungen an der richtigen subzellulären Ort überwacht. Diesbezüglich überwindet diese Technik Artefakte aus anderen Protein-Protein-Wechselwirkung Methoden wie Hefe-Zwei-Hybrid-oder in vitro-Assays. Es sollte allerdings angemerkt werden, dass indirekte Wechselwirkungen könnten auch Grb2 Einstellung führen. Ebenso kann die transkriptionelle Hochregulation von Bindungspartnern von cDNA-Expression induziert werden. Um zwischen diesen Möglichkeiten zu unterscheiden, ist es erforderlich, die entsprechenden sekundären Assays durchzuführen, um zwischen direkter und indirekter Bindung Wirkungen unterscheiden.

Abschließend verspricht der GFP-Adaptormolekül Translokation Assay hohes Potenzial für genomweite Screening und Wirkstoffsuche Anwendungen.

Materialien

Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare (optional)
cDNA-Bibliothek	Origene
LB + Amp
Gasdurchlässigen Dichtungen	ThermoScientific	AB-0718
NucleoSpin 96 Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740625,4
Transfectin	BioRad	170-3351
Hoechst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		Mit Vakuum-Verteiler
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer