Un alto contenuto di flusso di lavoro di imaging per studiare GRB2 Centri di segnalazione di espressione clonazione

Riepilogo

Un alto contenuto di metodo di screening per l'identificazione di nuovi recettori transmembrana competenti segnalazione è descritto. Questo metodo è suscettibile di larga scala di automazione e consente previsioni su In vivo Legame proteina e la localizzazione sub-cellulare di complessi di proteine ​​in cellule di mammifero.

Abstract

Trasduzione del segnale da recettori del fattore di crescita è essenziale per le cellule a mantenere la proliferazione e la differenziazione e richiede uno stretto controllo. Trasduzione del segnale è iniziata dal legame di un ligando per un recettore esterno transmembrana e attivazione di cascate di segnale a valle. Un regolatore chiave della mitogenica segnalazione è Grb2, una proteina modulare composto da un interno SH2 (Src omologia 2) dominio SH3 fiancheggiata da due domini che manca l'attività enzimatica. Grb2 è costitutivamente associato al GTPasi Son-Of-Sevenless (SOS) attraverso il suo N-terminale SH3 dominio. Il dominio SH2 di Grb2 si lega ai recettori del fattore di crescita a residui di tirosina fosforilati quindi giunto l'attivazione del recettore per l'SOS-Ras-MAP chinasi cascata di segnalazione. Inoltre, altri ruoli Grb2 come regolatore positivo o negativo di segnalamento e endocitosi sono state descritte. La composizione modulare di Grb2 suggerisce che può ancorare ad una varietà di recettori e trasduzionee segnali lungo una moltitudine di differenti vie ^1-3.

Qui descritto è un saggio microscopio semplice che monitora assunzione di Grb2 alla membrana plasmatica. Si è adattato da un metodo che misura variazioni di localizzazione sub-cellulare di green-proteina fluorescente (GFP)-etichetta Grb2 in risposta ad uno stimolo ^4-6. Recettori di membrana che si legano al plasma Grb2 come recettore attivato fattore di crescita epidermico (EGFR) GFP recluta-Grb2 alla membrana plasmatica sull'espressione cDNA e successivamente trasferirsi in compartimenti endosomal nella cella. Al fine di identificare in vivo di complessi proteici Grb2, questa tecnica può essere usata per eseguire un genoma ad alto contenuto dello schermo in base alle variazioni Grb2 localizzazione sub-cellulare. La preparazione di cloni di cDNA di espressione, trasfezione e acquisizione dell'immagine sono descritti in dettaglio di seguito. Rispetto ad altri metodi genomici utilizzati per individuare partner di interazione della proteina, come lievito-due-HYbrid, questa tecnica permette la visualizzazione di complessi di proteine ​​in cellule di mammifero in sub-cellulare sito di interazione con un semplice saggio basato microscopia. Quindi entrambi caratteristiche qualitative, come modelli di localizzazione può essere valutata, così come la forza quantitativa dell'interazione.

Protocollo

1. Picking cloni di espressione di cDNA

1. La libreria di cDNA è fornito come singoli cloni batterici in stock glicerolo in un formato a 96 pozzetti. Utilizzando il comando Rearray nel menu del selettore del CP7200 Norgen, scegliere cloni batterici dal piatto di origine e inoculare in 1,5 ml LB / amp in un 96-Deepwell (1 ml bene) piastra.
2. Sigillare le piastre Deepwell con un gas-permeabile tenuta e incubare una notte a 37 ° C in un agitatore.

2. Preparazione di cDNA library espressioni

1. Far girare le piastre Deepwell contenenti i batteri a 2000 rpm per 20 minuti usando adattatori piastra in una centrifuga da tavolo.
2. Aspirare supporti dai pozzi, lasciando intatto il pellet batterico.
3. Configurare il ponte della workstation automazione Lab come mostrato in Figura 2. Soluzioni per la preparazione plasmide sono distribuiti in trogoli 1-5 e la piastra Deepwell è posto sul ponte. Un trogolo multipozzetto con soluzione di eluizioneè posto adiacente alla piastra Deepwell. Suggerimenti sono caricati nei rack per puntali.
4. Montare il collettore del vuoto. La piastra plasmide legame è collocato all'interno del collettore e la piastra plasmide filtro è posto sulla parte superiore del collettore.
5. Risospendere pellet con 250 ul di soluzione 1 (tampone di risospensione) pipettando su e giù.
6. Lyse i batteri con l'aggiunta di 250 ul di soluzione 2 (tampone di lisi). La piastrina è sigillata e invertito per consentire una miscelazione completa.
7. Start 2 timer min.
8. Aggiungere 350 ul di soluzione 3 (tampone di neutralizzazione). Sigillare la piastra e capovolgere 3 volte.
9. Trasferire i lisati batterici alle piastre filtranti plasmide.
10. Applicare il vuoto per 5 min.
11. Rimuovere la piastra filtrante e posizionare la piastra di attacco sulla sommità del collettore. Applicare il vuoto per 1 min.
12. Aggiungere 500 ml di lavaggio supplementare (AW) buffer.
13. Applicare il vuoto per 2 min.
14. Aggiungere 900 ml di soluzione tampone di lavaggio 4. Applicare il vuoto per 2 min.
15. Ripetere step 2.14. Applicare il vuoto per altri 15 min.
16. Posizionare collezione di piatti del DNA all'interno del collettore. Aggiungere 100 pl di tampone di eluizione alla piastra di attacco e incubare per 2 min.
17. Vuoto per 10 min.
18. Rimuovere la piastra di raccolta e concentrazione di DNA misura utilizzando il Nanodrop 8000. Tipicamente una resa di ~ 100 ng / mL può essere previsto con questo metodo.

3. Semina cellulare

1. HEK293 cellule vengono tripsinizzate e contate.
2. 2 x 10 ⁴ cellule vengono erogate in ciascun pozzetto di una Viewplate PerkinElmer usando il ThermoFisher 96-well multidrop.
3. Le cellule sono incubate per una notte a 37 ° C e 5% di CO _2.

4. Transfection

1. Preparare una miscela di 100 ng GFP-Grb2 DNA plasmidico con 100 ng di cDNA in 25 pl terreno privo di siero per pozzetto a fondo rotondo a 96 pozzetti.
2. Aggiungere 25 pl senza siero supporti contenenti 0,5 Transfectin microlitri per pozzetto.
3. Mescolare e avviare il timer for 30 min.
4. Trasferire 50 microlitri di cDNA / Transfectin mix di cellule utilizzando un metodo delicato di erogazione. In alternativa, la miscela di trasfezione può essere erogato in piastre prima e poi le cellule aggiunto il top (trasfezione inverso).
5. Incubare le cellule notte a 37 ° C e 5% di CO _2.

5. Acquisizione di immagini

1. Avviare il software Opera. Un'istantanea schermata della procedura di configurazione è mostrata in Figura 3. Selezionare la scheda "Configurazione" e selezionare 20x obiettivo e il tipo di piastra corretto. Assicurarsi che "collare" è impostato al valore corretto per l'obiettivo di consentire la messa a fuoco con diversi tipi di lastre.
2. Selezionare la scheda "Microscopio". Definire l'esposizione 1 come FITC (488 laser) e l'esposizione ai raggi UV 2 come (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l'esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l'esposizione 1 e 40 msec per l'esposizione 2.
3. Selezionare la scheda "Microscopio". Definire eXposure 1 come FITC (488 laser) e 2 come esposizione UV (365 laser). Attivazione del filtro UV su entrambe le esposizioni e assegnare esposizione 1 alla telecamera 1 e 2 per l'esposizione della fotocamera 2. Impostare i tempi di esposizione a 800 msec per l'esposizione 1 e 40 msec per l'esposizione 2.
4. Selezionare l'esposizione 1. Impostare lo stato attivo altezza a 0 micron. Selezionare "Focus". Una volta concentrata, esporre la fotocamera 1. Regolare l'altezza di messa a fuoco per ottimizzare il piano di esposizione e clicca su "altezza Take". Modificare i tempi di esposizione e la potenza del laser per dare un'intensità massima di pixel di circa 3000. Salvare i parametri di esposizione. Ripetere l'operazione per l'esposizione 2.
5. Selezionare "Definizione Experiment" tab. Creare layout e sublayout. Trascinare e rilasciare il relativo schema, l'esposizione, immagine di riferimento, il file skewcrop e sublayout. Salva esperimento.
6. Selezionare "Automatico Experiment" scheda e acquisire immagini.

6. Image Analysis (Basato sulla versione ImageJ 1.46h.)

1. Convertire il PerkinElmer proprietario. File flessibile per Tagged Image. Tif file utilizzando ilFlex2Volocity Acapella script.
2. 1. Importare immagini in ImageJ come una sequenza di immagini, risultante in una pila.
   2. Convertire la pila in un canale 2 HyperStack selezionando l'immagine / HyperStack / stack di voce di menu HyperStack. Il numero di fette deve essere impostato a metà della pila importato.
   3. Duplicate il canale con il GFP Immagine / comando Duplica: selezionare la casella di controllo e specificare Duplica HyperStack Canali: 1-1. Appresso utilizzare lo stack duplicato.
3. Selezionare Processo / Migliora contrasto con 0,01% dei pixel saturi, con istogramma stack e convertire a 8 bit con Image/Type/8-bit.
4. Definire a 15 segmentazione raggio locale pixel utilizzando l'algoritmo adattivo Bernsen con soglia di contrasto (parametro 1) q = 30. Spunta gli oggetti bianchi su sfondo nero nella casella di controllo Immagine / Regola / Auto menù soglia locale.
5. Controllo di qualità Segmentazione: generare segmentato overlay contorno dell'oggetto sulle immagini originali.
6. Featuri di estrazione analizzando le particelle: area di misurazione, media e l'intensità totale di ogni organello. Salva file dei risultati.
7. Aprire il risultato caratteristiche file in R e generare un istogramma.

7. Risultati rappresentativi

In condizioni normali Grb2 è localizzato durante l'intera cella. Dopo stimolazione di un recettore del fattore di crescita si trasloca alla membrana plasmatica e viene successivamente internalizzato in endosomi come mostrato in Figura 4. L'espressione di un recettore di superficie cellulare capace di Grb2 legame è sufficiente per indurre questa traslocazione. In un esperimento tipico di screening, nessun cambiamento in GFP-Grb2 localizzazione viene osservata. Tuttavia, quando una proteina che è espressa Grb2 reclute ad un sub-cellulare sito, vi è un cambiamento di localizzazione che può essere facilmente visualizzato mediante microscopia a fluorescenza. Ad esempio, l'espressione dei risultati EGFR rilocalizzazione della GFP-Grb2 a endosome strutture simili (Figura4). Così, applicando un genoma biblioteca, si può prevedere che nuovi Grb2 proteine ​​leganti di superficie cellulare possono essere identificati.

Questo metodo non è limitata alla rilevazione di proteine ​​di superficie cellulare. Per esempio, Dynamin2 induce un cambiamento nella localizzazione sub-cellulare di GFP-Grb2 visualizzazione endosomi-like reclutamento (Figura 5). Dynamin2 lega al C-terminale del dominio SH3 Grb2 ed è coinvolto in endocitosi di questo complesso ^9,10. Pertanto, questo approccio consente l'identificazione di complessi proteici generali vincolanti e non è limitata alla individuazione di partner di interazione per il dominio SH2.

Diversi tipi di traslocazione può prevedere come la localizzazione alla membrana plasmatica, ad endosomi, altre strutture vescicolari citoplasmatiche o al nucleo. Pertanto, si raccomanda che tutte le immagini siano anche ispezionate dagli occhi. Tuttavia, quando lo screening di grandi insiemi di cDNA un sistema automatizzatoalgoritmo di analisi immagine è più pratico. In questo caso, una combinazione di algoritmi è desiderabile, come il rilevamento punto per identificare endosomi, citoplasma / nucleo rilevazione per identificare algoritmi morfologici nucleari spola e generale per identificare cambiamenti forma cellulari. L'uso di questi metodi di rilevazione differenti fenotipiche è stato discusso in dettaglio altrove ^11.

Figura 1. Schema generale della sperimentazione. L'esperimento i dettagli di un completo ad alto contenuto di flusso di lavoro di screening a partire con l'amplificazione e la preparazione della libreria di cDNA, trasfezione di vettori di cDNA più costrutti reporter, l'acquisizione di immagini e analisi di immagine utilizzando il software libero e open ImageJ.

Figura 2. Configurazione del ponte Tecan. (1) Sulla sinistra, cinque trogoli 100 ml devono essere riempiti con buffer 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) e A4 (100 ml). A4 Trough dovrà essere riempito volta durante la procedura. (2) Il collettore di vuoto si trova sulla posizione 14 in questo esempio. (3) La piastra Deepwell con pellet batterici si trova in posizione 30, vicino al trogolo tampone di eluizione con 25 ml di tampone di eluizione. (4) punte monouso per la 8 canali testa devono essere caricati nei rack punta sul lato sinistro e suggerimenti per la testa multicanale devono essere compilati sulla posizione 40. Il liquido Tecan FreedomEvo gestore che viene utilizzato in questo esperimento è equipaggiato con 500 siringhe pl. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura3. Automazione di acquisizione dell'immagine sulla LX Opera. A) Selezionare la scheda Configurazione (1). Attivare le linee laser necessari per l'esperimento (2). Selezionare le telecamere per l'acquisizione delle immagini (3). Selezionare il tipo di piastra e lente obiettivo dell'esperimento (4). B) Selezionare la scheda microscopio (1). Definire la sorgente di luce e il tempo di esposizione per esposizione 1 (2,3). Focus su un pozzetto e prendere altezza (4). C) Selezionare la scheda Definizione Experiment (1). Trascinare e rilasciare l'esposizione, skewcrop, di riferimento, il layout e file sublayout (2). Trascinare e rilasciare il file esperimento (3). D) Selezionare Esperimento automatico (1). Trascinare e rilasciare file di esperimento (2). Assegnare codice a barre del caso (3). Avviare l'acquisizione di immagini facendo clic sul pulsante di avvio (4). Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 4. GFP-Grb2 traslocazione di espressione di cDNA. GFP-GRB2 si trasferisce da una localizzazione citoplasmatica predominante di endosomi strutture simili su sovraespressione di un recettore del fattore di crescita transmembrana e interiorizza successivamente endosomi. A sinistra, le immagini di microscopia COS M6 cellule sono presenti che sono state trasfettate con GFP-Grb2 (in alto) o GFP-Grb2 più EGFR (in basso). La co-espressione dei risultati EGFR nel trasferimento di GFP-Grb2 di endosomi strutture simili.

Figura 5. Esempio di cDNA indotta traslocazione di GFP-Grb2. Il Dynamin2 GTPasi, che si occupa di Grb2 endocitosi mediata, trasferisce GFP-Grb2 di endosomi strutture simili (cerchio). In questo esperimento, GFP-Grb2 è stato co-transfettato in cellule con DNM2 HEK293T. Le cellule sono state colorate con Hoechst 33342 dopo 24 ore e le immagini sono state acquisite sul Opera LX. Un campo di vista del (GFP) e il canale verde UV (blu; Hoechst 33342) viene visualizzato.

Discussione

Espressione clonazione è un potente strumento che è stato utilizzato in passato per identificare nuovi componenti cellulari come recettori virali e antigeni cellule del sangue ^12. Qui, si descrive un metodo per facilitare l'identificazione di nuovi recettori putativi di trasduzione del segnale che si legano a Grb2.

Ci sono alcuni punti critici del protocollo.

1. Per la preparazione automatica plasmide è assolutamente essenziale avere completa risospensione del pellet batterico. Talvolta, è necessario includere una fase rigorosa agitazione o ulteriore miscelazione con pipette.
2. Dopo aggiunta di soluzione 2 e 3, la completa miscelazione è essenziale e abbiamo trovato che manualmente capovolgendo la piastra sigillata è più efficiente l'uso di un agitatore automatico. Pipettaggio deve essere evitato in questa fase in quanto porterebbe al taglio del DNA.
3. In tutte le fasi di vuoto, si deve garantire che il liquido viene scaricato completamentedalla piastra. In caso contrario, i rendimenti bassi sono da aspettarsi.
4. Su di eluizione, è abbastanza comune che scende eluato modulo in fondo della piastra plasmide vincolante. Queste gocce devono essere raccolti nella piastra di eluizione, quindi si raccomanda che la piastra plasmide associazione viene sollevata delicatamente ed eventuali gocce residue al fondo sono accuratamente trasferiti alla piastra eluato.
5. Durante la trasfezione, il tempo di formazione del complesso è critica. Di solito aderire a 20-30 min. Tempi più lunghi fino a 1 h vanno bene, senza diminuzione delle rese, mentre la riduzione dei tempi non sono raccomandati.
6. Per la microscopia, la scelta di ingrandimento è importante. Sul sistema Opera LX usato qui, risoluzione a 20x è sufficiente per ottenere immagini di alta qualità. Se immagini di risoluzione superiore sono richiesti, l'obiettivo può essere cambiato, ma al fine di ottenere numeri statisticamente significativi di cellule, un numero maggiore di campi e tempi di acquisizione più elevati sono richiesti. In generale, il nostro obiettivodi ottenere almeno 100 cellule per pozzetto impressi.

Il saggio di traslocazione Grb2 è stato utilizzato da altri gruppi di identificare piccole molecole inibitrici di attivazione EGFR chinasi ^6. In tal caso, l'EGFR è specificamente attivati ​​con ligando causando reclutamento di Grb2 alla membrana plasmatica. Turbativa di questa interazione può essere studiata utilizzando composti di piccole molecole. Analogamente, si può prevedere che gli schermi siRNA possono essere impiegati per identificare geni endogeni coinvolti nella EGFR-Grb2 segnalazione o altri leganti Grb2 recettori del fattore di crescita come c-KIT o il recettore dell'eritropoietina. Quindi, ci sono più applicazioni potenziali per questa tecnica. Un approccio analogo potrebbe essere applicato a GFP-tagged sistemi reporter per molecole adattatrici altri come Shc, Gab o IRS.

Uno dei principali vantaggi di utilizzare questo saggio basato su cellule in cellule di mammifero è che consente l'identificazione di fisiologicamente relinterazioni Evant. Il saggio è una lettura per la formazione di proteine ​​complesse, ma ancora più importante, le interazioni rilevanti vengono monitorati alla corretta subcellulare sito. A questo proposito, questa tecnica supera manufatti da altri proteina-proteina metodi di interazione come lievito-two-hybrid o in vitro. Occorre notare tuttavia che le interazioni indirette possono anche provocare reclutamento Grb2. Analogamente, l'up-regolazione trascrizionale dei partner di legame può essere indotta da cDNA di espressione. Per distinguere tra queste possibilità, è necessario eseguire i saggi secondaria appropriata per distinguere tra effetti vincolanti diretti e indiretti.

In conclusione, la GFP-adattatore saggio traslocazione molecola promette alto potenziale di genome-wide screening e applicazioni di scoperta della droga.

Materiali

Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
libreria di cDNA	Origene
LB + amp
Gas-permeabili guarnizioni	ThermoScientific	AB-0718
NucleoSpin 96 Kit Plasmid	Macherey-Nagel	740.625,4
Transfectin	BioRad	170-3351
Hoechst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		Con collettore di vuoto
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer