Mikrobiyal Systems Biyoloji Chemostats Kullanımı

Özet

Hücre büyüme oranı düzenlenmiş bir süreç ve hücre fizyolojisi temel belirleyicisidir. Chemostats kullanılarak sürekli kültürü, hücre büyümesini ve ne kadar bu ağlar hücre büyümesini optimize etmek için moleküler evrim kontrol ağların çalışma kolaylaştırmak besin kısıtlaması hücre büyüme hızının dışsal kontrol edilmesini sağlar.

Özet

Hücreler, dış dünyaya gelen sinyallerine yanıt olarak büyüme hızını düzenler. Hücre büyüdükçe, çeşitli hücresel işlemleri makromolekül sentezi, metabolizma ve hücre bölünmesi döngüsü sonunda, bağlılık içeren koordine edilmelidir. Kemostat, deneysel olarak hücre büyüme hızının kontrol edilmesi için bir yöntem olup, sistematik olarak okuyan bir araç sağlar ne kadar güçlü bir büyüme etkileri hücresel süreçleri - ve hücre büyüme hızını kontrol eden düzenleyici ağlar - gen ifadesi ve metabolizma da dahil olmak üzere. Kuşak chemostats yüzlerce muhafaza zaman, hücre büyümesini sınırlamaya çevre koşullarında mikropların uyarlanabilir evrimini incelemek için kullanılabilir. Biz, kemostat kültürlerin ilkesi tanımlamak çalışmalarını gösteren ve çeşitli uygulama örnekleri sağlar. Yirminci yüzyılın ortasında kendi girişten sonra kullanmama dönemi takiben, ile genom ölçekli metodolojileri yakınsama bir yenilenditerest hücre büyümesi ve adaptif evrim moleküler temelinin düzenlenmesinde biyolojik araştırma chemostats kullanımında bir rönesans uyarıcı olduğunu.

Giriş

Hücrelerin büyümesi, genetik ve çevresel faktörler ^1,2 etkileşen kompleks ağlarda düzenlenir. Hücre büyümesi çok faktörlü yönetmelik çalışmada bir sistem düzeyinde yaklaşımı gerektirmektedir. Bununla birlikte, düzenlenmiş hücre büyümesinin sıkı çalışma deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol zorluğu tarafından meydan. Ayrıca, hatta en basit deneylerde hücre-dışı koşullar, çoğaldıkları olarak hücreler sürekli olarak çevreyi değiştirmek sık olarak, dinamik ve karmaşıktır. , Tanımlanmış değişmez ve kontrollü ortamlarda hücre büyüme oranlarının deneysel kontrol edilmesini sağlar hücrelerin kültürlenmesi için bir yöntem: bu sorunlara bir çözüm, kemostat tarafından sağlanmaktadır.

Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ait yöntem, bağımsız bir şekilde, 1950'de Monod ³ ve Novick ve Szilard ⁴ tarafından tanımlanmıştır. Aslen tasarlandığı gibi, hücreler con medya sabit bir ses yetiştirilentinually yeni medya eski ve ortam ve hücre eşzamanlı çıkarılması (Şekil 1) eklenerek seyreltildi. Akuple diferansiyel denklemler (Şekil 2) hücre yoğunluğunda (x) ve bir kap içinde, kemostat büyüme sınırlayıcı besin (ler) konsantrasyonundaki değişim oranını tarif eder. Önemlisi, denklem bu sistem kararlı durumda, hücrelerin (yani üstel büyüme hızı sabit) spesifik büyüme oranı oranına eşit olduğu olağanüstü ima ile bir tek (sıfır olmayan) kararlı kararlı durum (Şekil 3) tahmin bu da kültür (D) seyreltilir. Seyreltme oranı değiştirilerek, farklı büyüme oranları ve de besin sınırlama farklı koşullar altında hücrelerin kararlı hal popülasyonları kurmak mümkündür.

Chemostats kullanarak büyüme hızı deneysel kontrolü nasıl hücre fizyolojisi değişiklikleri bir anlayışın geliştirilmesi için kritikbüyüme ^5,6 oranları ile. Ancak, mikrobiyolojik yöntemlerle bu eski dayanak yirminci yüzyılda moleküler biyoloji araştırma patlama sırasında giderek belirsiz hale geldi. Bugün, mikrop ve çok hücreli organizmalar ve sistemler düzeyinde analiz için genom ölçekli yöntemler gelişiyle hem de büyüme kontrolü ilgiyi chemostats kullanımı için motivasyon yeniledi. Burada, biz hücre büyüme oranlarının hassas kontrolü ve chemostats kullanarak benzersiz mümkündür dış ortama yararlanmak üç uygulamalarını tanımlamak. Transkript ve metabolitler olarak - - koordineli bir büyüme oranı ile düzenlenir İlk olarak, biyomoleküllerin binlerce bolluğu araştırmak için chemostats kullanılmasını tarif eder. İkinci olarak, chemostats rekabet deneyleri kullanılarak sınırlı besin ortamlarında, farklı genotipler arasında büyüme hızı farklılıkları hassas tahminleri elde etmek için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Üçüncü olarak, biz tarif nasıl chemostats yapabilirsinizSürekli besin-fakir ortamlarda büyüyen hücrelerin adaptif evrimini incelemek için kullanılabilir. Bu örnekler chemostats çevre etkileşimleri ve adaptif evrim tarafından hücre büyüme regülasyonu, gen sistemleri düzeyinde soruşturma sağlayan hangi bir şekilde sergilemiştir.

Protokol

Bir kemostat kullanarak sürekli kültür ilkesi uygulamaları çeşitli elde edilebilir. Bütün chemostats olarak tüm bileşenlerin steriliteyi korumaya 1) yöntemleri olması esastır, 2), iyi karıştırılmış, kültür, kültür kabı 3), uygun havalandırma ve ortam toplama ve kültür kaldırma 4) güvenilir bir araç. Burada, hali hazırda alternatif kurulumları için adapte edilebilir yöntemler kullanılarak, kemostat bir Sixfors biyoreaktör (Infors Inc) kullanımını tarif eder.

1.. Kemostat Gemiler Montaj

1. Ana düğmeyi kullanarak Sixfors açın.
2. Iyice kemostat gemi, karıştırıcı montaj, ve deiyonize (DI) su ile ekli boru durulayın. Tüm boru ve o-halkaları kontrol edin ve herhangi bir yıpranmış görünümlü parçaları değiştirin.
3. Tahrik mili destek tabanı cam kap içinde ve tahrik milinin üst karıştırma düzeneği üzerinde yuva içine geçerek olduğu yukarı baktığından emin olun. Stirre ayarlayınTahrik milinin alt sağlanması cam kabına r düzeneği tahrik mili destek oturduğundan. Cam kabına karıştırma tertibatını sağlamak için kelepçenin kullanın.
4. DI suyun yaklaşık 300 ml damar doldurun.
5. Prob ₍₂ dO) ve alt muhafazayı sökerek ve alt kılıf elektrolit solüsyonu ile yarım dolu olduğundan emin yaparak elektrolit seviyesini kontrol edin, bir çözünmüş oksijen kapaklarını çıkarın. Alt kasa Rescrew ve kemostat gemide noktasına takın. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın.
6. PH probu alın ve depolama tamponu (3 M KCl) çıkarın. PH probu kapağını çıkarın ve fermentörüne 1 ekleyin. Sixfors kontrol ekranını kullanarak, fermentörü parametre menüsüne gidin ve "pH kalibre" seçeneğini seçin. Standart bir pH 7 tampon ve Yüksek Okudum kayıt okuma içine pH probu yerleştirin. PH 4 tamponu ve Düşük okuyun gibi rekor okuma ile tekrarlayın. Fermantörden pH probu ayırın, DI su ile yıkayın ve prob int eklemeko kemostat gemide liman. Parmak Sımsıkı kadar vidalayın.
7. Rafa kemostat gemi yerleştirin. PH değeri sonda bağlanır ve kalibre edilmiştir fermantör (1-6) kabın hakkında not. PH probu üzerinde pH prob kapağı yerleştirin. Folyo kullanarak sıkıca dO ₂ prob üst kapağı.
8. , Kemostat kabına bağlı boru uçlarından folyo katlayın.
9. Tekrar tüm gemiler için 1,2-1,8 adımları.
10. Bir sıvı döngüsü 15 dakika boyunca, onları otoklav ile sterilize damarları.

2. Medya hazırlanması

1. Farklı besin konsantrasyonlarda toplu büyüme kültürleri ile bir gıda maddesi için konsantrasyonlarının sınırlayıcı aralığını oluşturulması. Nihai hücre yoğunluğu başlangıçtaki besin konsantrasyonunun doğrusal bir fonksiyonu (Şekil 4) olduğu besin aralığında sınırlamaktadır. De sınırlayan aralığında bir besleyici konsantrasyonu seçin. Saccharomyce birlikte çalışmaları için, standart ortam bileşimin örnekleris cerevisiae ^7-11 mevcuttur.
2. Önce medya hortumun ucu folyo kaplı emin olduktan sonra bir hava girişi ve medya çıkış içeren bir lastik tıpa ile kapatılmış boş damacana otoklavlayın.
3. Ayrı bir kap içinde 10 L ortam hazırlar.
4. 100 ml'lik bir şişe için bir ortam 500 ml filtre fincan takın. Etanol içinde sterilize forseps ile pamuk filtreyi kaldırmak ve hemen medya damacanaya filtrasyon noktasına takın.
5. Filtre fincan ekleyerek ortamı sterilize bir vakum kaynağına ve filtre medya damacana takın.
6. Ortam filtrasyon işlemi tamamlandığında, metal bir kelepçe ile filtrasyon noktasını kapatmaktadır.

3. DO ₂ Probları kalibre ve Kemostat ayarlama

1. Kemostat gemiler otoklava ve karşılık gelen ısı ceketi burası gemi soğumasına izin alındıktan sonra. Sıcaklık probu, pH probu ve dO ₂ probu bağlamak. Letdamar dO ₂ sondalar kutuplaşmaya izin vermek için en az 6 saat süreyle gücü ile otur.
2. Ayrı bir toplama deponun her bir çıkış borusunun ucunu. Otoklavlanmış filtre aracılığıyla hava kaynağını bağlayın ve hava akımı açın. Her bir kap içinde su her bir tıkaç oluşturduğu olduğunu gösterir, çıkış borularının üzerinden akmalıdır.
3. İstenilen çalışma hacminin (örneğin 300 ml) 'ye göre çıkış borusunun yüksekliği ayarlayın. Biz farklı çalışma hacimleri kalibre tüp yerleşimler ile işaretlenmiş bir cetvel kullanın.
4. , Kemostat kabına ortam damacana bağlayın. Tüpü tutmak için etanol kullanarak mümkün olduğu kadar steril sona erer. Pompa ve açık kelepçe ile pompa hortumu geçirin. Medya kemostat kabına akmaya başlayıncaya kadar elle pompayı basın. Pompadan boru bırakın, medya kemostat kabına serbestçe akmalıdır. Medya atık borusunu ulaştığında, pompa ve boru kelepçe takın.
5. Ru başlayınpervane 400 rpm seti ve 30 ° C'ye ayarlanmış sıcaklık ile temel programı nning
6. , DO ₂ sondaları kalibre hava beslemesini kapatın ve azot gazına geçmek için. "Düşük okuma" gibi en az bir saat ve kayıt ölçü değeri bekleyin. Geri (yani ortam oksijen konsantrasyonu içeren) hava kaynağına geçiş "yüksek okuma" gibi en az bir saat daha kayıt ve ölçüm bekleyin.
7. Iris yazılımı kullanarak veri kaydı başlatın.

4. Aşılama

1. Kültür kabın üst sterilize etmek için% 70 etanol kullanın.
2. , Kemostat kabına kap üst ve pipet bir gecelik kültürü için 1 ml ilgili vida çıkarın. Vidayı tekrar sıkın.
3. Iris aşılama zamanı gösterir.
4. Kültürler, erken durağan fazı ulaşmak için yaklaşık 24 saat bekleyin. Kültür büyüdükçe, çözünmüş oksijen ve pH azalır. Glikoz, sınırlayıcı ortam durumunda, çözünmüş oksijen sabit pha olarak ~% 100 geri dönecektirse. Diğer sınırlamalar besin için çözünmüş oksijen durağan faz olarak <% 100 kalır.

5. Pompalar başlatılıyor ve Steady State Kavuşturulması

1. Seyreltme oranı kültür hacmi ile (ne kadar ortam saatte tekneye döküldüğü) akış hızını bölünmesi ile hesaplanır. Örneğin, 300 ml 0.1 arasında bir seyreltme oranı, bir hacim kullanılarak ortam 30 ml kültüre her saat ilave edilir demektir. Sistem, aynı ses kültür sürekli olarak seyreltilmiştir sağlayarak kabın kaldırılır pozitif basınç altında olduğu için. Seyreltme oranları (D) ihtiva eden bir dizi hücre, kemostat yıkanarak olacak, yukarıda hücrelerin maksimum büyüme oranı (μ _max), aşmamak kullanılabilir.
2. İstenilen akış hızını kurmak için, pompa üzerinde ve kapalı saniye sayısını belirtmek pompa ayarlarını seçin. Pompa ~ 0.11 ml / sn 'lik bir oranda ortam sunar.
3. Sixfors int kullanarak bir program tanımlayınPompa zamanlama, sıcaklık ve kanatçıklı hızını belirtir Hiperface. Programını başlatın.
4. Sıvı toplanması kapları boşaltın ve saati kaydedin.
5. En az iki saat sonra, kabın kaldırılmıştır ne kadar ortam ölçmek için bir dereceli silindir kullanır. Bu, kemostat kabına ilave edilmiş ses eşit olacaktır. Seyreltme oranı (D = V _çıkış / V _kültür / saat) hesaplayın. Hesaplanan seyreltme oranı istenilen seyreltme oranına uygun değilse pompa ayarlarını yapın.
6. Kararlı durumda, Kemostat hücre yoğunluğu zamanla değişmez. Bu çıkış örnekleme ile kültür bozucu olmadan ölçülebilir. Biz operasyonel en az bir nüfus iki katına ayrılır özdeş hücre yoğunluğu ölçümleri gibi istikrarlı devlet ulaşılmasını tanımlar. Kararlı duruma ulaşma kültürü seyreltme başlandıktan sonra yaklaşık sekiz kültür nesiller alacaktır. Kararlı durumda, hücreler yani (katlanarak büyüyecekbesin sınırlı koşullar zamanla e. sabit büyüme oranı). Nüfusun (üretim süresi) katlama zamanı ln (2) / D.
7. Aralıklarla sabit bir seyreltme oranı muhafaza edilmesini sağlamak için deney süresince çıkış birimleri ölçmek için devam edin.

6. Uygulama 1: Kararlı durum Koşullarında Farklı fiyatlara Yetiştirme Eğitim Hücreleri

1. Kemostat istikrarlı halde, hücrelerin nüfus artış hızı seyreltme oranına eşittir. Sistematik seyreltme oranını değiştirerek farklı oranlarda hücre büyümesi mümkündür. Bu hücre hacmi, hücre döngüsü aşaması ve gerilme direnci dahil olmak üzere bir büyüme oranı ile değişir fizyolojik parametrelerin sistematik bir çalışma sağlar. Buna ek olarak, küresel mRNA, protein ve metabolit seviyelerinin kararlı durum profilleri farklı oranlarda büyüyen hücrelerde analiz edilebilir. Örnekleri elde etmek için iki yol vardır:
2. Küçük örnekler pasif ob olabilirBir 1.5 ml veya 15 ml tüp içine çıkış borusunun ucunu yerleştirerek saklanmaktadır. 1-5 ml'lik bir örneği (akış hızına bağlı olarak) birkaç dakika içinde elde edilebilir. Birçok fizyolojik parametreler, bu örneklerden ölçülebilir.
3. Gen ifadesi, ya da metaboliti analizler mümkün olduğunca çabuk elde edilmesi gereken daha büyük örnekleri gerektirir. 15 ml konik bir tüp içine çıkış borusunun ucunu. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça aşağı doğru itin. A ~ 10 ml numune hızla tüp dolduracaktır. Kemostat kapta hacmi değişti unutmayın. Birçok ardışık numuneler alınır eğer bir sabit seyreltme oranını korumak için akışını azaltmak için gerekli olabilir.

7. Uygulama 2: Sitometrisi-tabanlı Yarışması Tahliller kullanma Kontrollü Ortamlarda Genotiplerinin Arasındaki Artış Oranları Farklılıkların hassas ölçümü

1. Chemostats doğru besin konsantrasyonunun etkisini ölçmek için kullanılabilirfarklı genetik geçmişleri arasındaki büyüme oranları (yani spor) farklılıklar üzerine. Farklı floresan ile etiketlenmiş proteinleri ortak kültür suşları ile üstel büyüme sırasında rölatif çokluk içinde değişim oranı belirlenir. Farklı seyreltme oranı (D), bu deneyi gerçekleştirmek spor farkların besleyici madde konsantrasyonu (ler) etkileri çalışma sağlar.
2. Aynı seyreltme oranları ve 300 ml'lik bir hacme sahip ayrı kemostat damarlarda iki suşların sabit durum kültürleri oluşturulması.
3. Pasif her bir kabın 1 ml numune. Hücreleri aşağı Spin, fosfat tekrar süspansiyon 4 ° C'de tuzlu su (PBS) ve yer tamponlu Bu örnekler daha sonra akış sitometrisi analizi için kontroller homojen hücre örnekleri, içerir.
4. Bir otoklav dereceli bir silindir içine bir kabından çıkış tüpü yerleştirin. Atık borusunun metal ucunu tutarak vidayı bırakın ve yavaşça Kemostat hücreleri çıkarmak için aşağı doğru itin. Ne zamanhacmi, orijinal pozisyonuna (300 mi) ile çıkış borusunun metal ucunu döndürmek, 150 ml ulaşır. Farklı bir dereceli silindir kullanarak, ikinci kap ile tekrarlayın.
5. , Kemostat kabın üstüne vidayı kaldırılırken sterilliği korumak için,% 70 etanol kullanın. Açıklığında huni ve kemostat damar içine, diğer kültürden 150 ml dökün. Vidayı tekrar sıkın. İkinci hunisi kullanılarak, ikinci kap ile tekrarlayın. Her kemostat kap artık iki suş bir karışımını içerir.
6. Her 2-6 saatte pasif örnekleme kullanılarak her bir kap bir 1 ml bir örnek elde edilir. Hücreleri aşağı Spin, tekrar süspansiyon 4 ° C'de PBS ve mağaza 2-3 gün dikkatle her numune alındığı zaman kayıt için numune almaya devam.
7. Deney, sonikasyon sonunda ve örnekleri ~ 2 x 10 ⁶ hücre / ml 'ye seyreltilir. Akış sitometresi kullanılarak, her bir numune iki suşların oranını ölçer. Her iki suşları katlanarak büyüyor gibi, göreli büyüme oranı farkısüresi (nesiller olarak ölçülür) karşı ln lineer regresyon (strain1/strain2) ile belirlenmiştir. Regresyon eğimi diğer bir suş göreli (spor avantaj yani) büyüme oranında oransal fark olduğunu.
8. Karışık bir kültür, yeni bir kararlı duruma ulaşmak için biraz zaman alabilir, erken kez puan gerileme kötü uygun olabilir. Bu sorun, en iyi 2-3 nesiller örnekleme başlayan veya berrak aykırı değer olan erken noktaları çıkarmadan önce geçmesini sağlayarak çözülür. Bir suş diğer outcompeted kez tersine, veriler artık yararlıdır ve bu noktaları ekarte edilmelidir.

8. Uygulama 3: Deneysel Evrim

1. Chemostats gerçekleştirilen deneysel evrim besin sınırlı ortamda uygunluk artmıştır mutantlar için seçer. Seçim genellikle nesiller yüzlerce üzerinde gerçekleştirilir.
2. Bir gerginlik kullanarak istikrarlı bir devleti kemostat kültür kurmakbilinen genotip (ve tercihen, bilinen genom dizisi) ve belirli bir besin sınırlama.
3. Adapte nüfusun bir "fosil kayıtlarını" korumak için pasif 2-3 günde Kemostat örnek ve -80 ° C'de% 15 gliserol örneği saklamak
4. Medya rezervuar izlemek ve gerektiğinde taze medya ile doldurmak.
5. Birkaç yüz nesiller için katlanarak büyüyen kültürünü korumak.
6. Seçim levhası katı agar plakaları üzerinde bir hücre numunesi tamamlandıktan sonra. Hücreler koloniler haline sonra kürdanlar kullanılarak koloni ilgili bir örnek almak ve ortam ihtiva eden 100 ul, 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına ayrı klonlar inoküle. Klonal örnekleri, gece boyunca büyümeye -80 ° de% 30 gliserol ve deposunun 100 ul ekle izin ver
7. Tüm genom sekanslama ve uygulama 2'de tarif edildiği gibi, uygunluk değerlendirilmesi dahil olmak üzere fenotipik Analizleri yapan ortak bir flüoresan etiketli referans suşu kullanılarak klonlar karakterize eder. '/ Li>

Sonuçlar

Chemostats önemli bir avantajı seyreltme oranının değiştirilmesiyle deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol etme yeteneğidir. Tomurcuklanma Mayalarda Saccharomyces cerevisiae, bir hücre morfolojisi, hücre bölünme döngüsündeki kendi fazın bilgilendirici. Daha yüksek büyüme oranları ile Nüfus unbudded hücrelerin fraksiyonu (Şekil 5A) ölçülerek belirlenir aktif olarak bölünen hücreler daha yüksek bir oranda içerir. Kemostat kültürlerde küresel mRNA ifadesinin...

Tartışmalar

Chemostats büyüme kontrollü kararlı hal koşulları mikropların ekimi etkinleştirin. Hücreler, değişmeyen bir dış çevre ile sonuçlanan sabit bir oranda sürekli olarak büyür. Bu durum, dış çevre, sürekli değişen ve hücre büyüme oranı çevre ve genotip karmaşık etkileşimi ile belirlenen küme kültür yöntemlerin aksine bulunmaktadır. Bu nedenle, toplu kültürler üzerinde chemostats içinde mikropları kültür önemli bir avantajı, deneysel olarak hücrelerin büyüme hızını kontrol e...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents