L'utilisation de chémostats dans microbienne biologie des systèmes

Résumé

taux de croissance cellulaire est un processus réglementé et un facteur déterminant de la physiologie cellulaire. Culture en continu en utilisant chémostats permet un contrôle extrinsèque du taux de croissance des cellules par limitation des nutriments faciliter l'étude des réseaux moléculaires qui contrôlent la croissance cellulaire et la façon dont ces réseaux évoluent pour optimiser la croissance des cellules.

Résumé

Les cellules régulent leur taux de croissance en réponse à des signaux provenant du monde extérieur. Comme la cellule se développe, divers processus cellulaires doivent être coordonnés y compris la synthèse macromoléculaire, le métabolisme et, finalement, de l'engagement avec le cycle de la division cellulaire. Le chemostat, une méthode de contrôle expérimentalement le taux de croissance de la cellule, fournit un puissant moyen d'étudier systématiquement la façon dont les impacts des taux de croissance les processus cellulaires - y compris l'expression des gènes et le métabolisme - et les réseaux de régulation qui contrôlent le taux de croissance des cellules. Lorsque maintenue pendant des centaines de générations chémostats peut être utilisé pour étudier l'évolution adaptative des microbes dans des conditions environnementales qui limitent la croissance des cellules. Nous décrivons le principe des cultures chémostat, démontrer leur fonctionnement et de fournir des exemples de leurs diverses applications. Après une période de désuétude après leur introduction dans le milieu du XXe siècle, la convergence des méthodologies échelle du génome d'un renouvellement enintérêt dans la régulation de la croissance cellulaire et la base moléculaire de l'évolution adaptative est de stimuler une renaissance de l'utilisation des chémostats dans la recherche biologique.

Introduction

La croissance des cellules est régulée par des réseaux complexes d'interaction des facteurs génétiques et environnementaux ^1,2. Le règlement multifactorielle de la croissance cellulaire nécessite une approche au niveau du système à son étude. Cependant, l'étude rigoureuse de la croissance cellulaire régulée est contestée par la difficulté de contrôler expérimentalement la vitesse à laquelle les cellules se développent. En outre, même dans les expériences les plus simples conditions extracellulaires sont souvent dynamique et complexe que les cellules modifient en permanence leur environnement comme ils prolifèrent. Une solution à ces problèmes est proposée par le chemostat: un procédé de culture de cellules qui permet un contrôle expérimental des taux de croissance de cellules dans des milieux définis, invariantes et contrôlées.

La méthode de culture en continu en utilisant un chemostat a été décrite de façon indépendante par Monod ³ et Novick et Szilard ⁴ en 1950. Conçu à l'origine, les cellules sont cultivées dans un volume fixe de médias qui est concontinuellement dilué par ajout de nouveaux médias et l'élimination simultanée des médias traditionnels et des cellules (Figure 1). Équations différentielles ordinaires couplées (figure 2) décrivent la vitesse de variation de la densité de cellules (x) et la concentration d'un nutriment (s) limitant la croissance dans le récipient chimiostatique. Surtout, ce système d'équations prédit un seul (non nul) stable à l'état d'équilibre (figure 3) avec l'implication remarquable à l'état d'équilibre, le taux de croissance spécifique des cellules (c'est à dire la constante de taux de croissance exponentiel) est égal au taux au cours de laquelle la culture est diluée (D). En faisant varier le taux de dilution, il est possible d'établir des populations à l'état stable de cellules à différents taux de croissance et dans différentes conditions de limitation en nutriments.

Le contrôle expérimental des taux de croissance à l'aide chémostats était essentielle pour le développement d'une compréhension de la façon dont les changements de la physiologie cellulaireavec des taux de croissance de ^5,6. Cependant, cet ancien pilier de méthodes microbiologiques est devenu de plus en plus obscure lors de l'explosion dans la recherche en biologie moléculaire au cours de la fin du XXe siècle. Aujourd'hui, un regain d'intérêt dans le contrôle de la croissance dans les deux microbes et les organismes multicellulaires et l'avènement de méthodes échelle du génome pour l'analyse au niveau des systèmes a renouvelé motivation pour l'utilisation de chémostats. Ici, nous décrivons trois applications qui tirent sur le contrôle précis des taux de croissance de cellules et l'environnement extérieur qui sont uniquement possible en utilisant chémostats. Tout d'abord, nous décrivons l'utilisation de chémostats d'étudier comment l'abondance de milliers de biomolécules - tels que les transcriptions et des métabolites - sont réglementés de manière coordonnée avec les taux de croissance. Deuxièmement, nous décrivons comment chémostats peuvent être utilisées pour obtenir des estimations précises des écarts de taux de croissance entre les différents génotypes dans des environnements peu fertiles en utilisant des expériences de compétition. Troisièmement, nous décrivons comment peut chémostatsêtre utilisé pour étudier l'évolution adaptative des cellules en croissance dans des environnements pauvres en éléments nutritifs constants. Ces exemples illustrent la façon dont les chémostats activez enquêtes au niveau des systèmes de régulation de la croissance cellulaire, génique par des interactions de l'environnement et l'évolution adaptative.

Protocole

Le principe de la culture en continu en utilisant un chemostat peut être réalisée dans une variété de mises en œuvre. Dans tous les chémostats il est essentiel d'avoir une) méthodes pour maintenir la stérilité de tous les composants, 2) une culture bien mélangé, 3) l'aération appropriée du récipient de culture et 4) un moyen fiable de plus de médias et l'élimination de la culture. Ici, nous décrivons l'utilisation d'un bioréacteur Sixfors (Infors Inc) en chemostat en utilisant des procédés qui peuvent être facilement adaptés à d'autres configurations.

Une. Assemblage des navires Chemostat

1. Allumez les Sixfors l'aide de l'interrupteur principal.
2. Bien rincer le récipient chimiostatique, Ensemble agitateur, et le tube attaché avec (DI) de l'eau déminéralisée. Vérifiez tous les tuyaux et les joints toriques et remplacer les pièces usées à la recherche.
3. Assurez-vous que la base de support d'arbre d'entraînement est tourné vers le haut dans le récipient en verre et que la partie supérieure de l'arbre d'entraînement est remis dans son logement sur l'ensemble de l'agitateur. Réglez le stirrer ensemble dans le récipient de verre assurant le bas de l'arbre d'entraînement est logé dans le support d'arbre d'entraînement. Utiliser la pince pour fixer l'ensemble de l'agitateur dans la cuve de verre.
4. Remplissez le réservoir avec environ 300 ml d'eau déminéralisée.
5. Retirez les bouchons d'un oxygène dissous (DO ₂₎ sonde et vérifier le niveau d'électrolyte en dévissant le boîtier en bas et en veillant à ce que le boîtier de fond est à moitié rempli avec une solution d'électrolyte. Replacer le boîtier en bas et l'insérer dans le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
6. Prenez une sonde de pH et la retirer de son tampon de stockage (3 M de KCl). Retirez le capuchon de la sonde de pH et le joindre à fermenteur 1. Utilisation de l'écran de contrôle Sixfors, accédez au menu des paramètres de fermentation et sélectionnez "calibrer pH". Placer la sonde de pH dans un tampon à pH 7 standard et fiche de lecture en tant que Haut Lire. Répéter l'opération avec tampon à pH 4 et enregistrer la lecture en bas Lire. Détacher la sonde de pH de fermentation, laver avec de l'eau DI et insérer la sonde into le port sur le récipient chimiostatique. Visser et serrer.
7. Placer le récipient chimiostatique dans le rack. Remarque sur le navire qui fermenteur (1-6) de la sonde de pH a été connecté et calibré. Placez la sonde de pH bouchon sur la sonde de pH. Utilisant une feuille couvre bien le haut de la sonde à oxygène _2.
8. Plier la feuille sur les extrémités de la tubulure attachée au récipient chimiostatique.
9. Répétez les étapes 1.2 à 1.8 pour tous les navires.
10. Stériliser les navires en leur autoclavage pendant 15 min sur un cycle liquide.

2. Préparation des supports

1. Établir la gamme de limitation des concentrations de nutriments par la croissance des cultures en lots de différentes concentrations d'éléments nutritifs. Le nutriment est limitant dans la plage où la densité cellulaire finale est une fonction linéaire de la concentration des éléments nutritifs initiale (figure 4). Sélectionnez une concentration des éléments nutritifs dans la fourchette de limitation. Des exemples de composition de médias standard pour les études avec Saccharomyces cerevisiae sont disponibles en ^11.7.
2. Autoclave une bonbonne vide qui est coiffé d'un bouchon de caoutchouc contenant une entrée d'air et une sortie de média après la première assurant que l'extrémité du tube de support est recouvert d'une feuille.
3. Dans un récipient séparé préparer 10 litres de médias.
4. Fixer un filtre de 500 ml tasse à une bouteille de 100 ml de médias. Retirez le filtre de coton avec des pinces stérilisées dans de l'éthanol et joindre immédiatement au port de filtration sur la bonbonne de médias.
5. Fixez la bonbonne de médias à une source de vide et filtre stériliser les médias en l'ajoutant à la coupe du filtre.
6. Lorsque la filtration des médias est terminée, fermer le port de filtration avec une pince métallique.

3. Calibrage faire ₂ sondes et Configuration Chemostat

1. Après les vaisseaux chémostat ont été autoclave et laisser refroidir endroit du navire dans son enveloppe de chaleur correspondant. Connectez la sonde de température, sonde de pH et DO ₂ sonde. Laissez lenavire s'asseoir avec le pouvoir pendant au moins 6 heures pour permettre aux DO ₂ sondes à polariser.
2. Placez l'extrémité de chaque tube effluents dans un récipient de collecte séparée. Connectez l'alimentation en air via un filtre autoclave et tourner sur la circulation d'air. L'eau dans chaque récipient doit s'écouler des tubes des effluents, ce qui indique que tous les joints sont correctement formés.
3. Ajuster la hauteur du tube d'effluent en fonction du volume de travail désirée (par exemple, 300 ml). Nous utilisons une règle qui est marqué avec des stages de tubes calibrés pour différents volumes de travail.
4. Connectez la bonbonne de médias dans le récipient de chemostat. Utiliser de l'éthanol afin de maintenir les extrémités des tubes aussi stérile que possible. Enfiler le tuyau de la pompe à travers la pompe et la pince ouverte. Appuyer manuellement sur la pompe jusqu'à ce que les médias commencent à s'écouler dans le récipient chimiostatique. Relâchez tube de la pompe, les médias doivent circuler librement dans le récipient chemostat. Lorsque le support atteint le tube effluent, rattacher tube à la pompe et serrer.
5. Lancer running le programme de base avec roue ensemble à 400 tours par minute et la température réglée à 30 ° C.
6. Pour calibrer faire ₂ sondes, couper l'arrivée d'air et passer au gaz d'azote. Attendez au moins une heure et enregistrer la valeur de mesure comme «faible en lecture". Revenez à alimentation d'air (c'est à dire contenant la concentration en oxygène ambiante), attendez au moins une heure supplémentaire et la mesure d'enregistrement comme "une grande lecture».
7. Lancer l'enregistrement de données en utilisant le logiciel Iris.

4. Inoculation

1. Utiliser 70% d'éthanol pour stériliser la partie supérieure de la cuve de culture.
2. Retirez la vis sur le dessus de la cuve et pipette 1 ml d'une culture de la nuit dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis.
3. Indiquer le moment de l'inoculation dans Iris.
4. Attendez environ 24 h pour les cultures d'atteindre la phase stationnaire précoce. Comme la culture se développe, l'oxygène dissous et le pH diminue. Dans le cas des milieux de glucose limitatif, l'oxygène dissous va revenir à ~ 100% en pha stationnairese. Pour les autres restrictions de nutriments oxygène dissous restera <100% en phase stationnaire.

5. Lancement de pompes et d'atteindre l'état d'équilibre

1. Le taux de dilution est calculé en divisant le débit (la quantité de support s'écoule dans la cuve par heure) par le volume de la culture. Par exemple, en utilisant un volume de 300 ml, un taux de dilution de 0,1 signifie que 30 ml de milieu est ajouté à la culture par heure. Parce que le système est sous pression positive le même volume est retirée de la cuve en sorte que la culture est diluée de manière continue. Une gamme de taux de dilution (D) peut être utilisé qui ne dépasse pas la vitesse maximale de croissance (μ _max) des cellules, les cellules ci-dessus, qui seront éliminés par lavage du chemostat.
2. Choisissez réglages de la pompe, qui précisent le nombre de secondes, la pompe est sur et en dehors, pour établir le débit souhaité. La pompe délivre médias à un taux d'environ 0,11 ml / sec.
3. Définir un programme utilisant l'int Sixforserface qui spécifie le calage de la pompe, la température et la vitesse de la turbine. Démarrez le programme.
4. Videz les récipients collecteurs de liquide et enregistrer le temps.
5. Après au moins deux heures, utiliser un cylindre gradué pour mesurer combien les médias a été retiré de la cuve. Ce sera égal au volume qui a été ajoutée au récipient de chemostat. Calculer le taux (D = V _effluents / V _culture / heure) dilution. Réglez les paramètres de la pompe si le taux de dilution calculé ne correspond pas à taux de dilution désiré.
6. A l'état d'équilibre, la densité des cellules dans le chemostat ne change pas au fil du temps. Ceci peut être mesuré sans perturber la culture en échantillonnant la sortie. Nous définissons opérationnel atteindre l'état d'équilibre que les mesures de densité de cellules identiques qui sont séparés par au moins un doublement de la population. Atteindre l'état d'équilibre prendra environ huit générations de la culture après le début de la culture dilution. A l'état d'équilibre, les cellules se développent de façon exponentielle (i.e. taux de croissance constant au cours du temps) dans des conditions nutritives limitée. Le temps de doublement de la population (temps de génération) est ln (2) / D.
7. Continuer à mesurer périodiquement le volume des effluents pour la durée de l'expérience pour s'assurer que le taux de dilution constant est maintenu.

6. Application 1: étude des cellules en croissance à des taux différents dans l'état d'équilibre

1. A l'état d'équilibre dans le chemostat, le taux de la population de cellules de croissance est égal au taux de dilution. En modifiant systématiquement le taux de dilution, il est possible de cultiver des cellules à des vitesses différentes. Ceci permet l'étude systématique des paramètres physiologiques qui varient avec le taux de croissance y compris le volume des cellules, l'étape du cycle cellulaire et de la résistance au stress. En outre, les profils état d'équilibre de l'ARNm mondiale, les protéines et les niveaux de métabolites peuvent être testés dans des cellules en croissance à des taux différents. Il ya deux façons d'acquérir des échantillons:
2. Petits échantillons peuvent être passivement obmaintenue en plaçant l'extrémité du tube d'effluent dans un tube de 1,5 ml ou de 15 ml. Un échantillon de 5.1 ml peuvent être obtenus en quelques minutes (en fonction de la vitesse d'écoulement). De nombreux paramètres physiologiques peuvent être mesurées à partir de ces échantillons.
3. expression des gènes, ou de métabolites analyses nécessitent des échantillons plus larges qui doivent être obtenus le plus rapidement possible. Placer l'extrémité du tube d'effluent dans un tube conique de 15 ml. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement. A ~ 10 ml d'échantillon remplira rapidement votre tube. Garder à l'esprit que le volume dans le récipient chimiostatique a changé. Si plusieurs échantillons consécutifs sont prises, il peut être nécessaire de réduire le débit pour maintenir un taux de dilution constant.

7. Application 2: la mesure précise des différences de taux de croissance entre les génotypes dans des environnements contrôlés en utilisant des analyses de la concurrence fondée sur cytométrie de flux

1. Chémostats peuvent être utilisés pour quantifier avec précision l'effet de la concentration en éléments nutritifssur les différences de taux de croissance (c'est à dire de remise en forme) entre différents fonds génétiques. Par des souches de co-culture marquées avec différentes protéines fluorescentes de la vitesse de variation de l'abondance relative pendant la croissance exponentielle est déterminée. Réalisation de ce test à différents taux de dilution (D) permet l'étude des effets de la concentration (s) nutriment sur ​​les différences de remise en forme.
2. Établir les cultures des deux souches dans les vaisseaux chémostat séparées avec des taux de dilution identiques et un volume de 300 ml état d'équilibre.
3. Passivement échantillon de 1 ml de chaque navire. Spin bas cellules, remettre en suspension dans un tampon phosphate salin (PBS) et le lieu à 4 ° C. Ces échantillons contiennent des échantillons de cellules homogènes, qui sont des commandes pour l'analyse de cytométrie de flux subséquente.
4. Placer le tube effluent d'un navire dans une éprouvette graduée autoclave. Relâchez la vis retenant le couvercle métallique du tube effluents et pousser doucement vers le bas pour expulser les cellules du chemostat. Quandle volume atteint 150 ml, retourner l'extrémité métallique du tube effluent à sa position initiale (300 ml). Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant une éprouvette graduée différente.
5. Utilisation éthanol à 70% pour maintenir la stérilité tout en enlevant les vis sur la partie supérieure du récipient chimiostatique. Placez l'entonnoir dans l'ouverture et versez 150 ml de l'autre culture dans le récipient chimiostatique. Resserrer la vis. Répéter l'opération avec le second navire, en utilisant le second entonnoir. Chaque récipient chimiostatique contient maintenant un mélange des deux souches.
6. Obtenir un échantillon de 1 ml de chaque navire par échantillonnage passif chaque 2-6 h. Isoler les cellules, remettre en suspension dans du PBS et conserver à 4 ° C. Continuez à prendre des échantillons pour l'enregistrement 2-3 jours soigneusement le temps de chaque échantillon a été prélevé.
7. A la fin de l'expérience, traitement par ultrasons et diluer les échantillons à ~ 2 x 10 ⁶ cellules / ml. En utilisant la cytométrie en flux, de mesurer la proportion des deux souches dans chaque échantillon. Comme les deux souches sont en croissance exponentielle, la différence de taux de croissance relative estdéterminé par régression linéaire de ln (strain1/strain2) en fonction du temps (mesuré dans les générations). La pente de la régression est proportionnelle à la différence dans le taux de croissance (c'est à dire l'avantage de gym) d'une souche par rapport à l'autre.
8. Comme la culture mixte peut prendre un certain temps pour atteindre un nouvel état d'équilibre, des points de temps au début peuvent s'adapter mal à la régression. Ce problème est résolu meilleur en permettant 2-3 générations s'écouler avant le début de l'échantillonnage ou de retirer début points qui sont aberrantes claires. Inversement, une fois une souche a surpassés l'autre, les données ne sont plus utiles et ces points doivent être exclus.

8. Application 3: Evolution expérimentale

1. Évolution expérimentale effectuée dans chémostats sélectionne des mutants qui augmentent dans la forme physique dans l'environnement des éléments nutritifs limités. La sélection est généralement effectuée sur des centaines de générations.
2. Établir une culture chimiostatique l'état d'équilibre en utilisant une souchegénotype connu (et la séquence du génome de préférence connu) et un nutriment limitation définie.
3. Pour maintenir un «fossiles» de la population d'adaptation passive échantillon chemostat tous les 2-3 jours et stocker l'échantillon dans 15% de glycérol à -80 ° C.
4. Surveiller le réservoir de médias et de reconstituer des milieux frais comme nécessaires.
5. Maintenir la culture en croissance exponentielle pour plusieurs centaines de générations.
6. Après l'achèvement de la plaque de sélection d'un échantillon de cellules sur des plaques de gélose solide. Après que les cellules ont grandi dans les colonies, choisir un échantillon biaisé de colonies à l'aide de cure-dents et inoculer clones dans les puits individuels d'une plaque de 96 puits contenant 100 pi de milieu. Permettre aux échantillons de clones de croître pendant la nuit, ajouter 100 ul de 30% de glycérol et en magasin -80 ° C.
7. Caractériser clones par séquençage du génome entier et effectuer des dosages phénotypiques y compris l'évaluation de la condition physique, en utilisant une souche de référence marqué par fluorescence commun, tel que décrit dans la demande 2.

Résultats

Un avantage majeur de chémostats est la capacité de contrôler le taux de croissance des cellules expérimentalement en faisant varier le taux de dilution. Chez la levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae, la morphologie d'une cellule est informative de la phase dans le cycle de la division cellulaire. Populations avec des taux de croissance plus élevés contiennent une proportion plus élevée de division active des cellules tel que déterminé par la mesure de la fraction de cellules unbudded (figu...

Discussion

Chémostats permettent la culture de microbes dans des conditions stables de croissance contrôlée. Les cellules se développent en continu à un débit constant résulte en un environnement externe invariant. Ceci est en contraste aux méthodes de culture du lot dans lequel l'environnement extérieur est en constante évolution et le taux de croissance des cellules est déterminé par l'interaction complexe de l'environnement et le génotype. Ainsi, un avantage majeur de la mise en culture des microbes dan...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents