Der Einsatz von Chemostate in Microbial Systems Biology

Zusammenfassung

Zellwachstumsrate ist ein regulierter Prozess und eine wesentliche Determinante für Zellphysiologie. Kontinuierliche Kultivierung mit Chemostate ermöglicht extrinsischen Kontrolle der Zellwachstumsrate von Nährstoffmangel erleichtert die Untersuchung der molekularen Netzwerke, die Zellwachstum und wie diese Netzwerke entwickeln, um das Zellwachstum zu optimieren steuern.

Zusammenfassung

Zellen regulieren ihre Wachstumsrate in Reaktion auf Signale von der Außenwelt. Als die Zelle wächst, müssen diverse zelluläre Prozesse koordiniert einschließlich makromolekulare Synthese, Stoffwechsel und letztlich Einsatz für die Zellteilungszyklus ist. Der Chemostat, eine Methode der experimentell Steuerung der Zellwachstumsrate, liefert ein leistungsfähiges Mittel, systematisch zu untersuchen, wie Wachstumsrate Auswirkungen zelluläre Prozesse - einschließlich der Genexpression und Stoffwechsel - und die regulatorischen Netzwerke, die die Geschwindigkeit von Zellwachstum steuern. Wenn für Hunderte von Generationen Chemostate beibehalten kann zur adaptiven Evolution der Mikroben in Umweltbedingungen, die das Zellwachstum zu begrenzen studieren. Wir beschreiben das Prinzip der Chemostatkulturen, zeigen deren Betrieb und liefern Beispiele für ihre verschiedenen Anwendungen. Nach einer Periode des Stillstands nach ihrer Einführung in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts, die Konvergenz der genomweiten Methoden mit einer erneutenInteresse an der Regulation von Zellwachstum und die molekularen Grundlagen der adaptiven Evolution ist anregend eine Renaissance in der Verwendung von Chemostate in der biologischen Forschung.

Einleitung

Das Wachstum der Zellen wird durch komplexe Netzwerke von zusammenwirkenden genetischen und Umweltfaktoren ^1,2 geregelt. Die multifaktorielle Regulation von Zellwachstum erfordert einen System-Level-Ansatz für ihre Studie. Jedoch ist die strenge Untersuchung regulierten Zellwachstum durch die Schwierigkeit der experimentell Steuern der Rate, mit der Zellen wachsen in Frage. Darüber hinaus wird in selbst die einfachsten Experimente extrazellulären Bedingungen sind häufig dynamisch und komplex wie Zellen zu verändern ständig ihre Umwelt, wie sie sich vermehren. Ein Verfahren zur Kultivierung von Zellen, die experimentelle Kontrolle der Zellwachstumsraten definiert, unveränderlich und kontrollierten Umgebungen ermöglicht: Eine Lösung für diese Probleme wird durch die Chemostat zur Verfügung gestellt.

Die Methode der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat wurde unabhängig von Monod ³ und Novick & Szilard ⁴ im Jahr 1950 beschrieben. Wie ursprünglich konzipiert, werden die Zellen in einem festen Volumen von Medien, die con ist gewachsenlaufend durch Zugabe von neuen Medien und gleichzeitiger Entfernung des alten Medien und Zellen (Fig. 1) verdünnt. Gekoppelten Differentialgleichungen (2) beschreiben die Änderungsrate der Zelldichte (x) und die Konzentration des Wachstums-limitierende Nährstoff (e) in dem Chemostatgefäß. Wichtig ist, dass dieses System von Gleichungen, sagt eine einzige (nicht Null) stabil stationären (Abbildung 3) mit der bemerkenswerten Implikation, dass im stationären Zustand, gleich der Rate ist die spezifische Wachstumsrate der Zellen (dh die exponentielle Wachstumsrate konstant) bei der die Kultur verdünnt wird (D). Durch Variation der Verdünnungsrate ist es möglich, stationäre Populationen von Zellen in unterschiedlichen Wachstumsraten und unter verschiedenen Bedingungen von Nährstoffmangel zu etablieren.

Die experimentelle Kontrolle der Wachstumsrate mit Chemostate war entscheidend für die Entwicklung des Verständnisses, wie Veränderungen der Zellphysiologiemit Wachstumsraten ^5,6. Das ehemalige Hauptstütze der mikrobiologischen Methoden wurde jedoch bei der Explosion in der molekularbiologischen Forschung während des späten zwanzigsten Jahrhunderts zunehmend unklar. Heute, erneutes Interesse in der Wachstumskontrolle in beiden Mikroben und vielzelligen Organismen und dem Aufkommen der genomweiten Methoden zur Analyse auf Systemebene hat die Motivation für den Einsatz von Chemostate erneuert. Hier beschreiben wir drei Anwendungen, die auf die präzise Steuerung von Zellwachstumsraten und der äußeren Umgebung, die eindeutig mit Chemostate möglich zu nutzen. Zunächst beschreiben wir die Verwendung von Chemostate zu untersuchen, wie die Fülle von Tausenden von Biomolekülen - wie Transkripte und Metaboliten - sind koordinativ mit Wachstumsrate geregelt. Zweitens beschreiben wir, wie Chemostate verwendet werden, um eine präzise Schätzung der Wachstumsrate Unterschiede zwischen den verschiedenen Genotypen in nährstoff beschränkt Umgebungen mit Konkurrenzversuchen zu erhalten. Drittens werden wir beschreiben, wie Chemostate kannverwendet werden, um adaptive Evolution der Zellen, die in konstanter nährstoffarmen Umgebungen zu untersuchen. Diese Beispiele veranschaulichen, in welcher Weise Chemostate ermöglichen es Systemebene Untersuchungen von Zellwachstumsregulierung, durch Gen-Umwelt-Interaktionen und adaptive Evolution.

Protokoll

Das Prinzip der kontinuierlichen Kultivierung mit einem Chemostat können in einer Vielzahl von Ausführungen realisiert werden. In allen Chemostate ist es wesentlich, 1) Verfahren zur Aufrechterhaltung der Sterilität aller Komponenten, 2) eine gut gemischte Kultur, 3) geeignete Belüftung des Kulturgefäßes und 4) einer zuverlässigen Medien Zugabe und Entnahme Kultur. Hier beschreiben wir die Verwendung eines Sixfors Bioreaktor (Infors Inc) als Chemostat mit Methoden, die leicht auf alternative Konfigurationen angepasst werden können.

1. Montage der Chemostat Schiffe

1. Schalten Sie die Sixfors über den Hauptschalter.
2. Die Chemostatgefäß, Rührer Montage, und die angeschlossenen Schläuche mit entsalztem (VE) Wasser gründlich abspülen. Überprüfen Sie alle Schläuche und O-Ringe und ersetzen Sie abgenutzte aussehende Stücke.
3. Sicherzustellen, dass die Antriebswellenstützbasis nach oben gerichtet in das Glasgefäß und die Oberseite der Antriebswelle in ihrem Gehäuse auf der Rühranordnung schnappt. Stellen Sie die stirrer Anordnung in das Glasgefäß Gewährleistung der Unterseite der Antriebswelle in dem Antriebswellenträger gelagert. Verwenden Sie den Haken, um den Rührer Anordnung an der Glasbehälter zu sichern.
4. Füllen Sie den Behälter mit etwa 300 ml DI-Wasser.
5. Entfernen Sie die Kappen von einem gelösten Sauerstoff (DO _2)-Sonde und überprüfen Sie den Elektrolytstand durch Abschrauben der unteren Gehäuse und dafür sorgen, dass der Boden Gehäuse ist zur Hälfte mit Elektrolytlösung gefüllt. Rescrew den unteren Mantel und stecken in den Anschluss auf der Chemostatgefäß. Schrauben handfest.
6. Nehmen Sie eine pH-Sonde und aus seiner Speicherpuffer (3 M KCl). Entfernen Sie den pH-Sonde Kappe und heften sich an ein Fermenter. Mit der Sixfors Steuerbildschirm zu den Fermenter Parametermenü und wählen Sie "Kalibrieren pH". Setzen Sie den pH-Sonde in eine Standard-pH-7-Puffer und Plattenlese als Hoch lesen. Wiederholen Sie mit pH 4-Puffer und Plattenlese als Low lesen. Nehmen Sie den pH-Sonde aus Fermenter, wäscht mit DI-Wasser und führen Sie die Sonde into der Port auf dem Chemostatgefäß. Schrauben handfest.
7. Legen Sie die Chemostatgefäß im Rack. Hinweis auf dem Schiff, die Fermenter (1-6) der pH-Sonde wurde angeschlossen und kalibriert. Setzen Sie die Kappe auf pH-Sonde der pH-Sonde. Mit Folie abdecken dicht die Spitze der DO _2-Sonde.
8. Einklappen Folie über die Enden des Schlauchs an den Chemostatgefäß befestigt.
9. Wiederholen Sie die Schritte 1,2-1,8 für alle Schiffe.
10. Sterilisieren der Gefäße durch Autoklavieren sie für 15 Minuten auf einem Flüssigkeitskreislauf.

2. Vorbereiten der Medien

1. Stellen Sie die Begrenzung Konzentrationsbereich für einen Nährstoff durch den Anbau von Batch-Kulturen in verschiedenen Nährstoffkonzentrationen. Der Nährstoff wird in dem Bereich, wo die Begrenzung der endgültige Zelldichte ist eine lineare Funktion des ursprünglichen Nährstoffkonzentration (Fig. 4). Wählen Sie einen Nährstoffkonzentration auch im Grenzbereich. Beispiele für Standardmedien Zusammensetzung für Studien mit Saccharomyces cerevisiae sind in ^7-11 zur Verfügung.
2. Autoklav eine leere Glasballon, der mit einem Gummistöpsel enthält einen Lufteinlass und Medienunter nach zunächst sicherzustellen, dass das Ende der Medien Schlauch wird in Folie abgedeckt gekappt wird.
3. In einem separaten Gefäß vorbereitet 10 l Medium.
4. Bringen Sie einen 500-ml-Filtertasse in einen 100 ml-Flasche Medien. Entfernen Sie die Baumwollfilter mit einer Pinzette in Ethanol sterilisiert und sofort an die Filtration Anschluss befestigen auf dem Medienglasballon.
5. Befestigen Sie den Medienglasballon mit einer Vakuumquelle und Filtermedien sterilisieren, indem es zu den Filtertopf.
6. Wenn Filtration von Medien abgeschlossen ist, schließen Sie den Filter Port mit einer Metallklemme.

3. Kalibrieren dO ₂ Sonden und Einrichten Chemostat

1. Nachdem die Chemostat Schiffe wurden autoklaviert und darf Ort das Schiff in die entsprechende Wärmejacke abkühlen. Schließen Sie den Temperaturfühler, pH-Sonde, und DO _2-Sonde. Lassen Sie dieSchiff sitzen mit der Macht für mindestens 6 Stunden, damit die DO _2-Sonden zu polarisieren.
2. Legen Sie das Ende jeder Abwasserrohr in einen separaten Auffangbehälter. Schließen Sie die Luftversorgung über ein Filter autoklaviert und schalten Sie Luftstrom. Das Wasser in jedes Schiff sollte aus den Abwasserrohren zu fließen, was bedeutet, dass alle Dichtungen korrekt gebildet werden.
3. Einstellen der Höhe des Abwasserrohres gemäß der gewünschten Arbeitsvolumen (z. B. 300 ml). Wir verwenden ein Herrscher, der mit Rohrplatzierungen an verschiedenen Arbeitsvolumen kalibriert gekennzeichnet ist.
4. Schließen Sie die Medien auf den Glasballon Chemostatgefäß. Verwenden Ethanol um Rohr zu halten endet so steril wie möglich. Fädeln Sie den Pumpenschlauch durch die Pumpe und offene Klemme. Manuell drücken Sie die Pumpe, bis die Medien beginnt, in der Chemostatgefäß fließen. Lassen Schlauch von der Pumpe, sollten Medien frei in Chemostatgefäß fließen. Wenn die Medien die Abwasserrohr erreicht, bringen Schlauch zu pumpen und zu klemmen.
5. Starten running das Basisprogramm mit Laufradsatz bis 400 Umdrehungen pro Minute und die Temperatur auf 30 ° C eingestellt
6. Um das zu tun _zwei Sonden kalibrieren, schalten Sie Luftversorgung und wechseln Sie zu Stickstoffgas. Warten Sie mindestens eine Stunde und Rekordmesswert als "Low read". Wechseln Sie wieder zu Luftversorgung (dh haltigen Umgebung Sauerstoffkonzentration), warten Sie mindestens eine weitere Stunde und Plattenmessung als "hohe Lese".
7. Starten Sie die Datenaufzeichnung mit Iris-Software.

4. Impfung

1. 70% Ethanol zu verwenden, um die Oberseite des Kulturgefäßes zu sterilisieren.
2. Schraube auf Behälterdecke und Pipette 1 ml einer Übernachtkultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube.
3. Geben Sie die Zeit der Impfung in Iris.
4. Warten Sie etwa 24 Stunden für Kulturen frühen stationären Phase zu erreichen. Wie die Kultur wächst, werden gelösten Sauerstoff und pH-Wert verringern. Im Falle von Glucose-Begrenzungsmittel, wird gelöster Sauerstoff auf ~ 100% im stationären pha zurückse. Für andere Nährstoff Einschränkungen gelöstem Sauerstoff wird in der stationären Phase bleiben <100%.

5. Initiierung von Pumpen und Erreichen Steady State

1. Das Verdünnungsverhältnis wird durch Dividieren der Flussrate durch die Kulturvolumen berechnet (wie viel Medien in den Behälter pro Stunde fließt). Beispielsweise mit einem Volumen von 300 ml einer Verdünnungsrate von 0,1 bedeutet, daß 30 ml Medium zu der Kultur pro Stunde aufgenommen. Da das System unter Überdruck das gleiche Volumen aus dem Behälter sichergestellt wird, dass die Kultur kontinuierlich verdünnt wird entfernt. Eine Reihe von Verdünnungsraten (D) verwendet, die die maximale Wachstumsrate (μ _max) der Zellen, über dem Zellen aus dem Chemostat gewaschen werden, nicht überschreiten werden.
2. Wählen Pumpeneinstellungen, die die Anzahl der Sekunden, die Pumpe an und aus angeben, um die gewünschte Durchflussmenge zu etablieren. Die Pumpe fördert Medien mit einer Geschwindigkeit von ~ 0,11 ml / sec.
3. Definieren Sie ein Programm mit dem Sixfors interface, die die Pumptakt, Temperatur und Geschwindigkeit Flügelrad angibt. Starten Sie das Programm.
4. Leeren Sie den Auffanggefäßen von Flüssigkeit und notieren Sie die Zeit.
5. Nach mindestens zwei Stunden, mit einem Messzylinder zu messen, wie viel Medien aus dem Gefäß entfernt. Dies wird das Volumen, das in die Chemostatgefäß hinzugefügt wurde gleich. Berechnen Sie die Verdünnungsrate (D = V _Abwasser / V _Kultur / Zeit). Stellen Pumpeneinstellungen, wenn berechnet Verdünnungsrate nicht gewünschten Verdünnungsrate entsprechen.
6. Im stationären Zustand ist die Zelldichte in der Chemostat nicht mit der Zeit ändern. Dies kann ohne Stören der Kultur durch Abtasten des Ausfluss gemessen werden. Wir Erreichen stationärer operativ definiert als identisch Zelldichtemessungen, die durch mindestens eine Verdopplung der Population abgetrennt werden. Erreichen stabilen Zustand wird etwa acht Kultur Generationen nach Beginn der Kultur Verdünnung zu nehmen. Im stationären Zustand Zellen wachsen exponentiell (dhE. konstante Wachstumsrate über die Zeit) in nährstofflimitierten Bedingungen. Die Verdopplungszeit der Population (Generationszeit) ist ln (2) / D.
7. Weiterhin periodisch messen Abwassermenge für die Dauer des Experiments, um sicherzustellen, daß ein konstanter Verdünnungsrate aufrechterhalten wird.

6. Anwendung 1: Studieren wachsenden Zellen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten in Steady-State-Bedingungen

1. Im stationären Zustand im Chemostat, ist die Wachstumsrate der Population von Zellen, die gleich der Verdünnungsrate. Durch die systematische Veränderung der Verdünnungsrate ist es möglich, Zellen mit unterschiedlichen Raten wachsen. Dies ermöglicht die systematische Untersuchung von physiologischen Parametern, die mit Wachstumsrate einschließlich Zellvolumen, Zellzyklus-Stadium und Stressresistenz variieren. Zusätzlich können stationäre Profile der globalen mRNA, Protein und Metabolitenspiegel in Zellen, die mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten getestet werden. Es gibt zwei Möglichkeiten, um Proben zu erwerben:
2. Kleine Proben kann passiv sein, obindem das Ende des Rohrs in einem Abwasser 1,5 ml oder 15 ml-Röhrchen enthaltene. Eine Probe von 1-5 ml in wenigen Minuten (in Abhängigkeit von der Durchflussmenge) erhalten werden. Viele physiologische Parameter aus diesen Proben gemessen werden.
3. Genexpression oder Metaboliten Analysen erfordern größere Proben, die so schnell wie möglich erreicht werden muss. Das Ende des Abwassers Rohr in ein 15 ml konischen Röhrchen. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken. A ~ 10 ml Probe rasch füllen Sie Ihre Röhre. Beachten Sie, dass das Volumen in der Chemostatgefäß geändert hat. Wenn viele aufeinander folgende Proben entnommen werden, kann es notwendig sein, um die Strömung zu verringern, um ein konstantes Verdünnungsverhältnis zu erhalten.

7. Anwendung 2: Präzise Messung der Unterschiede in den Wachstumsraten zwischen den Genotypen in Controlled Environments mittels Durchflusszytometrie-basierte Assays Wettbewerb

1. Chemostaten verwendet werden, um die Wirkung der Nährstoffkonzentration genau zu quantifizierenauf Unterschiede in den Wachstumsraten (dh Fitness) zwischen verschiedenen genetischen Hintergründen. Durch Co-Kultivieren Stämme mit verschiedenen fluoreszierenden Proteinen markiert die Änderungsrate der relativen Häufigkeit während des exponentiellen Wachstums bestimmt. Durchführung dieses Tests bei verschiedenen Verdünnungsraten (D) ermöglicht die Untersuchung der Auswirkungen der Nährstoffkonzentration (e) auf Fitness Unterschiede.
2. Stellen stationären Kulturen der beiden Stämme in separaten Chemostat Gefäße mit identischen Verdünnungsraten und einem Volumen von 300 ml.
3. Passiv Probe 1 ml aus jedem Gefäß. Spin down Zellen resuspendieren in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und bei 4 ° C Diese Proben enthalten homogenen Zellproben, die Steuerelemente für die nachfolgende Durchflusszytometrie sind.
4. Setzen Sie den Abwasserrohr von einem Behälter in einen Messzylinder autoklaviert. Lösen Sie die Schraube, mit der Metall Ende des Abwasserrohres und sanft nach unten drücken, um Zellen aus dem Chemostat zu vertreiben. Wanndas Volumen erreicht 150 ml, senden Sie das Metall Ende des Abwasserrohres in seine ursprüngliche Position (300 ml). Wiederholen, mit dem zweiten Behälter, mit einem anderen Messzylinder.
5. 70% Ethanol zu verwenden, um die Sterilität aufrecht zu erhalten, während das Entfernen Schraube an der Oberseite der Chemostatgefäß. Zeigen Trichter in Öffnung und gießen Sie 150 ml von der anderen Kultur in die Chemostatgefäß. Ziehen Sie die Schraube. Wiederholen, mit dem zweiten Behälter mit dem zweiten Trichter. Jede Chemostatgefäß enthält nun eine Mischung der beiden Stämme.
6. Besorgen Sie sich eine 1 ml Probe aus jedem Gefäß mit passiven Probenahme alle 2-6 Stunden. Spin down Zellen in PBS resuspendieren und bei 4 ° C Nimmt die Proben für 2-3 Tage sorgfältig Aufzeichnen der Zeit wurde jede Probe gemacht.
7. Am Ende des Experiments beschallen und verdünnte Proben auf ~ 2 × 10 ⁶ Zellen / ml. Verwendung der Durchflusszytometrie messen den Anteil der beiden Stämme in jeder Probe. Da beide Stämme sind exponentiell wächst, ist die relative Wachstumsrate Unterschieddurch lineare Regression ln (strain1/strain2) gegen die Zeit (in Generationen gemessen) bestimmt. Die Steigung der Regression ist die proportionale Differenz in der Wachstumsrate (dh die Eignung Vorteil) einer Belastung gegenüber dem anderen.
8. Da die Mischkultur kann einige Zeit, um einen neuen stationären Zustand zu erreichen nimmt, kann frühen Zeitpunkten schlecht auf der Regressions passen. Dieses Problem ist am besten, indem 2-3 Generationen vor Beginn Probenahme oder Entfernen von Punkten, die früh klar Ausreißer verstreichen gelöst. Umgekehrt, wenn ein Stamm dem anderen outcompeted die Daten nicht mehr sinnvoll und diese Punkte sollten ausgeschlossen werden.

8. Anwendung 3: Experimentelle Entwicklung

1. Experimentelle Entwicklung in Chemostate durchgeführt wählt für Mutanten, die in Fitness im nährstoff begrenzt Umwelt erhöht. Die Auswahl erfolgt in der Regel über Hunderte von Generationen durchgeführt.
2. Stellen Sie eine Steady-State-Chemostatkultur mit einem Stammvon bekannten Genotyp (und vorzugsweise bekannte Genomsequenz) und eine definierte Nährstoffbeschränkung.
3. Um ein "Fossilien" der Bevölkerung zu erhalten Anpassung passiv probieren Chemostat alle 2-3 Tage und speichern Sie die Probe in 15% Glycerin bei -80 ° C
4. Überwachen Sie den Medienspeicher wieder aufzufüllen und mit frischem Medium wie nötig.
5. Pflegen Sie die exponentiell wachsenden Kultur für mehrere hundert Generationen.
6. Nach Beendigung des Selektionsplatte eine Probe von Zellen auf festen Agar-Platten. Nach der Zellen zu Kolonien gewachsen, nehmen eine unvoreingenommene Stichprobe von Kolonien mit Zahnstochern und impfen Klone in einzelne Wells einer 96-Well-Platte mit 100 ul Medium. Lassen klonalen Proben über Nacht wachsen, werden 100 ul von 30% Glycerin und Speicher in -80 ° C
7. Charakterisieren Klone durch Sequenzierung ganzer Genome und die Durchführung phänotypische Tests einschließlich der Beurteilung von Eignung, mit einem gemeinsamen fluoreszenzmarkierten Referenzstamm, wie in Anwendungs ​​2 beschrieben.

Ergebnisse

Ein Hauptvorteil der Chemostate ist die Fähigkeit, das Wachstum von Zellen experimentell durch Variieren des Verdünnungsrate zu steuern. In der Bäckerhefe, Saccharomyces cerevisiae, die Morphologie einer Zelle ist informativ seiner Phase im Zellzyklus. Populationen mit höheren Wachstumsraten enthalten einen höheren Anteil von aktiv teilenden Zellen, wie durch Messung der Bruchteil unbudded Zellen (5A) bestimmt. Analysen der globalen mRNA-Expression in Chemostatkulturen hat gezeigt, daß die Express...

Diskussion

Chemostate ermöglichen den Anbau von Mikroben in Wachstumsgesteuerten stationären Bedingungen. Die Zellen wachsen kontinuierlich mit einer konstanten Geschwindigkeit, was zu einem unveränderlichen äußeren Umgebung. Dies steht im Gegensatz zur Batch-Kultur Methoden, bei denen das äußere Umfeld kontinuierlich verändert und die Rate des Zellwachstums wird durch die komplexe Wechselwirkung von Genotyp und Umgebung bestimmt. Somit ist ein Hauptvorteil der Kultivierung von Mikroben in Chemostaten über Batch-Kulturen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Infors-HT Sixfors Chemostat	Appropriate Technical Resources, Inc.
Glass Bottle 9.5 L	Fisher Scientific	02-887-1	For Media Vessel and Hosing
Pinchcock	Fisher Scientific	05-867	For Media Vessel and Hosing
Stopper, Size 12, Green Neoprene	Cole-Palmer	EW-62991-42	For Media Vessel and Hosing
Straight Connector	Cole-Palmer	EW-30703-02	For Media Vessel and Hosing
General purpose ties 4 in	Fisher Scientific	NC9557052	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone Rubber	Small Parts	B000FMWTDE	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 3/8 in OD	Fisher Scientific	02-587-1Q	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Silicone, 7/32 in OD	Fisher Scientific	02-587-1E	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/16 in OD	McMaster-Carr	6100K164	For Media Vessel and Hosing
Tubing, Stainless Steel, 3/8 in OD	McMaster-Carr	6100K161	For Media Vessel and Hosing
Hook Connectors	Fisher Scientific	14-66-18Q	For Media Vessel and Hosing
Ratchet Clamp	Cole-Palmer	EW-06403-11	For Media Vessel and Hosing
Luer, Female	Cole-Palmer	EW-45512-34	For Media Vessel and Hosing
Luer, Male	Cole-Palmer	EW-45513-04	For Media Vessel and Hosing
Millipore Aervent MTGR05010 62 mm Filter, 0.2 μm	Fisher Scientific	MTGR05010	For Media Vessel and Hosing
PTFE Acrodisc CR 13 mm filters, 0.2 μm	Fisher Scientific	NC9131037	For Media Vessel and Hosing
Direct-Reading Flowtube for Air	Cole-Palmer	EW-32047-77	For Nitrogen Gas Setup
Direct-Reading Flowtube for Nitrogen	Cole-Palmer	EW-32048-63	For Nitrogen Gas Setup
Gas Proportioner Multitube Frames	Cole-Palmer	EW-03218-50	For Nitrogen Gas Setup
Regulator, Two-Stage Analytical	Airgas	Y12-N145D580	For Nitrogen Gas Setup
Hose Adaptor, Stainless Steel	Airgas	Y99-26450	For Nitrogen Gas Setup
Hose Male Adaptor	Airgas	WES544	For Nitrogen Gas Setup
Norprene Tubing	US Plastics	57280	For Nitrogen Gas Setup
Tripod Base	Cole-Palmer	EW-03218-58	For Nitrogen Gas Setup
Valve Cartridges	Cole-Palmer	EW-03217-92	For Nitrogen Gas Setup
Carboy 10 L	Fisher Scientific	02-963-2A	For Media Preperation
Steritop Sterile Vacuum Bottle-Top Filters, 1,000 ml, PES membrane; for 45 mm neck size	Fisher Scientific	SCGP-T10-RE	For Media Preperation
Media Bottle 100 ml, 45 mm neck size	Fisher Scientific	FB-800-100	For Media Preperation
calcium chloride·2H2O	Fisher Scientific	C79-500	Media Reagents
sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1	Media Reagents
magnesium sulfate·7H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
potassium phosphate monobasic	Fisher Scientific	AC424205000	Media Reagents
ammonium sulfate	Fisher Scientific	AC423400010	Media Reagents
potassium chloride	Sigma Aldrich	P9541	Media Reagents
boric acid	Sigma Aldrich	B6768	Media Reagents
copper sulfate·5H2O	Sigma Aldrich	209198	Media Reagents
potassium iodide	Sigma Aldrich	60400	Media Reagents
ferric chloride·6H2O	Fisher Scientific	I88-100	Media Reagents
manganese sulfate·H2O	Sigma Aldrich	230391	Media Reagents
sodium molybdate·2H2O	Sigma Aldrich	M7634	Media Reagents
zinc sulfate·7H2O	Fisher Scientific	Z68-500	Media Reagents
biotin	Fisher Scientific	BP232-1	Media Reagents
calcium pantothenate	Fisher Scientific	AC24330-1000	Media Reagents
folic acid	Sigma Aldrich	F7876	Media Reagents
inositol (aka myo-inositol)	Fisher Scientific	AC12226-1000	Media Reagents
niacin (aka nicotinic acid)	Sigma Aldrich	N4126	Media Reagents
p-aminobenzoic acid	Fisher Scientific	AC14621-2500	Media Reagents
pyridoxine HCl	Sigma Aldrich	P9755	Media Reagents
riboflavin	Sigma Aldrich	R4500-25G	Media Reagents
thiamine HCl	Fisher Scientific	BP892-100	Media Reagents
Leucine	Sigma Aldrich	L8000-100G	Media Reagents
Uracil	Sigma Aldrich	U0750	Media Reagents
Dextrose	Fisher Scientific	DF0155-08-5	Media Reagents