Gram-negatif bakterilerin izolasyonu ve Lipid A kimyasal karakterizasyonu

Özet

Gram-negatif bakterilerin lipopolisakarit (LPS) lipid A alanı izolasyonu ve karakterize edilmesi, hücre yüzeyi antibiyotik direnç mekanizmaları göre, bakterinin yaşamda kalması ve spor ve nasıl kimyasal olarak çeşitli lipit A moleküler türün farklı olarak ana doğal immün yanıtları modüle fikir verir.

Özet

Lipopolisakarid (LPS) dış zar iki tabakalı dış yaprakçıkta biriken gram-negatif bakterilerin en büyük hücre yüzey molekülüdür. LPS üç sahaya bölünebilir: distal O-polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve lipid, bir lipit içeren bir etki moleküler türleri ve 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic asit kalıntıları (Kdo). Lipid A etki bakteriyel hücre hayatta kalması için gerekli olan tek bileşendir. Sentezi takiben lipid A kimyasal olarak antibiyotik bileşiklere karşı direncini arttırma ve ana doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin aracılar tarafından tanınması kaçınmak için, bu tür pH ve sıcaklık gibi çevresel strese cevap olarak modifiye edilir. Aşağıdaki protokol, gram-negatif bakterilerin lipid A'nın küçük ve büyük ölçekli izolasyon detayı. İzole edilen malzeme, daha sonra, kimyasal, ince tabaka kromatografisi (TLC) veya kütle spektrometrisi (MS) ile karakterize edilir. Buna ek olarak, F lazer desorpsiyon / iyonizasyon süresi matris destekliışığı (MALDI-TOF) MS, aynı zamanda Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) bağlanmış elektrosprey iyonizasyon (ESI) ve yeni kullanılan ultraviyole Fotodissosiasyon (UVPD) yöntemleri kullanılarak lipid A moleküler türler analiz etmek için tandem MS protokolleri açıklanmıştır. Bizim MS protokolleri benzersiz veya yeni kimyasal modifikasyon içeren lipid A molekülleri karakterizasyonu için çok önemlidir, kimyasal yapının, şüphe götürmez belirlenmesi için izin verir. Ayrıca, TLC ile analiz için bakteriyel hücrelerden lipid A'nın radyoizotopik etiketleme, ve daha sonra izolasyon, tarif etmektedir. MS tabanlı protokol ile karşılaştırıldığında, TLC bir daha ekonomik ve hızlı bir karakterizasyonu yöntem sağlar, ancak açık bir şekilde bilinen bir kimyasal yapıya standartlarının kullanımı olmayan bir kimyasal yapıları lipid atamak için kullanılamaz. Son yirmi yılda lipid A izolasyonu ve karakterizasyonu gram-negatif bakteriler, antibiyotik direnci mekanizmalarının fizyolojisinin anlayışımızı geliştirdik ki çok heyecan verici keşiflere yol açmıştırmesafe, insan doğuştan gelen bağışıklık tepkisi ve antibakteriyel bileşiklerin geliştirilmesinde bir çok yeni hedefler sağlamıştır.

Giriş

Lipopolisakarid (LPS) neredeyse tüm gram-negatif bakterilerin en büyük dış yüzey molekülü olan ve üç molekül etki oluşmaktadır: merkezden uzak bir O-antijen polisakarit, çekirdek oligosakkarit ve zara bağlı lipid dış yaprakçıkta biriken bir etki dış zar iki tabakalı ^1,2. Lipid A ^alanı, lipid A yumuşak asit hidrolizi ¹ üzerine LPS'nin kloroform çözünür bölümü olarak tanımlanabilir 3-deoksi-D-manno-okt-2-ulosonic (Kdo) artıkları ve bir lipit A moleküler türün oluşmaktadır ^2. Model organizma Escherichia coli (E. coli), ^1,2 gözlenen büyük lipid A türleri ile tutarlıdır; standart lipid A molekül kimyasal heksa-asilatlanmış ve bis-fosforile edilmiş olan bir omurga diglucosamine olarak tanımlanabilir. Gram-negatif bakteriler boyunca muhafaza edilmiş dokuz kurucu olarak ifade edilen genler, lipid üretiminde bir alanı (Şekil 1), ^1,2 sorumludur. Bir çok bakteri lipid A ³ daha başka kimyasal modifikasyonu katılma filogenetik koruma derecesi değişebilir genlerin ek dizi vardır. Defosforilasyon, asil zincirleri çıkarılması ve amino şekerler (örneğin amino-arabinoz) ve / veya fosfoetanolamin gibi kimyasal kısımların ve buna ek olarak en sık gözlemlenen etkinlikleri ve (Şekil 1) bulunmaktadır. Lipid A modifikasyonu sorumlu enzimlerin çoğu doğrudan bu iki değerli katyonları gibi tabiata ait sinyallerle aktive edilir, ya da sentezleme, iki bileşenli tepki düzenleyici sistemler ³ düzenlenir.

Host doğuştan gelen bağışıklık sistemi tarafından lipid A türlerin tanınması Toll-benzeri reseptör 4/myeloid farklılaşma faktörü 2 (TLR4/MD2) co-reseptör ⁴ aracılık eder. MD2 ve lipid A asil zincirleri, aynı zamanda, TLR4 ve lipid A 1 ve 4 ', fosfat grupları dudağın güçlü bir ilişki teşvik arasında var olan hidrofobik kuvvetler^{TLR4/MD2, 4,5} ile kimliği bir. Asilasyon durum ya da lipid A negatif yük etki TLR4/MD2 göre lipid değiştirmek modifikasyonlar A tanıma ve doğal bağışıklık yanıtının uyarılması alt NF-KB ve örneğin TNFa ve ^{IL1-β, 6,7} enflamasyon medyatörleri harekete geçiriciler kullanılmaktadır. Lipid A'nın negatif şarjının maskelenmesini modifikasyonları da hücre yüzeyleri ^3,8 gram-negatif bakteri bağlanmasını katyonik antimikrobiyal peptitler engeller. Birçok lipid A modifikasyon örneğin, insan ev sahibi içinde veya ekolojik bir niş gibi özel çevre koşulları altında, bakteri sağlığını arttırmak için öne sürülmüştür. Bu nedenle birçok modifikasyon enzimleri antimikrobiyal bileşiklerin rasyonel gelişme çekici hedeflerdir. Lipid A yapılarının kimyasal çeşitliliği, organizma ve / veya çevreye ve bu çeşitli yapıların biyolojik etkileri ile ilgili olarak lipid A'nın yapısal karakterizasyonu t önemli bir çaba yapmakO gram-negatif bakterilerin çalışma.

Bütün bakterilerden lipid A molekülleri izolasyonu nihai saflaştırma prosedürü ^9-11 ardından bakteriyel hücre yüzeyinden LPS'nin çıkarma, lipit A serbest bırakmak için bir hidrolitik aşamasını içerir. En sık atıf LPS ekstraksiyon prosedürü ilk Westphal ve Jann ¹⁰ tarafından tanıtılan, sıcak-fenol su çıkarma işlemdir. Bütün kimyasal olarak ekstre LPS lipid A'nın uzak glukozamin şeker (Şekil 1) 6'-hidroksil KDO ayıran hafif asit hidrolize tabi sonra. Çok sayıda tuzaklar yüksek bir tehlike reaktifin kullanılması da dahil olmak üzere, sıcak-fenol su prosedürü için mevcut ko-ekstre edilmiş nükleik asitler ve proteinler, ve birkaç gün indirgeme için ihtiyaç protokolü ¹⁰ tamamlamak için gereklidir.

İlk Caroff ve Raetz ^12,13 tarafından geliştirilen Bizim laboratuvar ayrıca lipid A'nın çıkarma ve izole geliştirdi. Sıcak-fenol su işlemleri ile karşılaştırıldığında, burada sunulan yöntem daha hızlı ve daha verimli ve 5 ml birden litre kültür hacimleri geniş bir aralıkta. Ayrıca, sıcak fenol su ekstresini aksine, bizim yöntem lipit A türlerin optimal iyileşme sağlayan, LPS kaba veya pürüzsüz türleri için seçmez. Protokolde, bütün bir bakteri hücrelerinin kimyasal liziz LPS, santrifüjle topaklar haline edilebilir bir kloroform, metanol ve sudan oluşan bir karışımı kullanılarak gerçekleştirilir. Hafif asit hidrolize ve solvent ekstraksiyon (Bligh-Dyer) içinde bir arada kovalent bağlı polisakarit lipit A serbest bırakmak için kullanılır. Bligh ve Dyer bir yöntem ilk olarak ^14, dokular, hayvan ve bitki çeşitli lipid türlerin çıkarılması için uygulanan bu son adımda ayırma lipid A'dan hidrolize polisakarit ayırmak için burada modifiye edilmiş, kloroform çözünür lipidler seçici bir alt organik bir şekilde bölünmezler aşaması. Bundan başka, lipid A saflaştırılması için ters fazlı ya daAnyonik değiştirme kolon kromatografisi ¹² kullanılabilir.

Tüm hücrelerden lipid A türlerinin izole edildikten sonra, analitik bir dizi yöntem bu NMR ve TLC ve MS-esaslı analizi gibi izole edilmiş malzemenin kimyasal yapısını karakterize etmek için kullanılabilir. NMR tahribatsız yapısal açıklama için izin verir, ve glikosidik bağlantıları, asil zinciri pozisyonların kesin atama ve amino-arabinozun veya fosfoetanolamin ^15-17 gibi lipit A değişiklikler için ek siteler ödevle ilgili yapısal ayrıntı sağlar. Lipid A'nın NMR analizi eden protokol içinde ele değildir, fakat başka ^15,16 yeterince tarif edilmiştir. Hızlı analiz için TLC yöntemler sıkça kullanılır dayalı, ama ince kimyasal yapısına ilişkin doğrudan bilgi sağlamak için başarısız. MS temel protokoller lipid A yapıları ^18,19 karakterize etmek için en çok kullanılan bir yöntemdir. Matrix ilişkili lazer desorpsiyon iyonizasyon (MALDI)-MS genellikle başlangıçta sağlam lipit A türlerini araştırmak için kullanılır. Tek yüklü iyonların daha analit eden ekstraksiyon prosedürlere göre hazırlanmıştır oluşturulur. Daha ince yapısal analiz gerekli olduğu gibi, MS / MS tabanlı yöntemler MALDI-MS'den daha bilgilendirici kanıtlamak. Yapısal bilgi ürün iyonları ^18,20,21 oluşturmak için, (ESI) bir ön-madde iyonları Çarpışmanın neden olduğu ayırma (CID) ya da mor ötesi Fotodissosiasyon (UVPD) ile daha da parçalanmış olan, tek başına veya çok yüklü lipid iyonizasyon elektrosprey Akuple. Bir ön-madde iyonları lipid Nötr kaybı ürünler ayrıca sık sık yapısal bilgileri ve ek bir tabaka sağlayan ESI-MS sırasında oluşturulur.

Tandem kütle spektrometrisi (MS / MS) lipid A yapıların açıklanması için vazgeçilmez ve çok yönlü bir yöntem olduğu kanıtlanmıştır. MS / MS sırasında, ön-madde iyonları iyon yapısını aydınlatmak için kullanılabilecek bir tanı parçalanma desen vermek üzere aktive olur. En yaygın olarak available MS / MS metodu olup CID. Bu yöntem, ayrışma yol açar enerji birikimi ile sonuçlanır, bir atıl gaz ile, hedef seçilen haberci iyon çarpışmaları yolu ile parçası iyonlar üretir. CID bakteri türlerinin ^22-33 geniş bir yelpazesi için bir lipid yapının atama önemli bir araç olduğunu kanıtlamıştır.

CID en evrensel olarak uygulanan MS / MS metodu da, bu ürün, iyonların sınırlı dizisi oluşturur. 193 nm UVPD alternatif ve tamamlayıcı bir MS / MS yöntemi. Bu yöntem iyon ışın tedavisi için bir lazer kullanmaktadır ve fotonların emme iyonları ve sonraki ayrışma enerjilendirilmesi ile sonuçlanır. Bu yüksek enerji, MS / MS tekniği CID daha ürün iyonların daha çeşitli bir dizi üretir ve böylece daha bilgilendirici parçalanma desen sağlar. Özellikle, UVPD glukan, amin, asil ve CC bağlantılı tahviller ^18,21,34 de bölünmelere dayalı lipid A türlerde ince değişiklikler hakkında bilgi verir.

Protokol

Bütün çözeltiler, aşırı saf su ve HPLC dereceli metanol ve kloroform ile hazırlanmalıdır. , Metanol, kloroform, veya piridin ve konsantre asitler ya da bazlar gibi organik çözücüleri de ihtiva hazırlanan çözeltiler hazırlanmış ve kimyasal bir davlumbaz altında kullanılmalıdır. Bütün çözeltiler, oda sıcaklığında saklanabilir. Solventler kapaklar kaplı cam dereceli bir silindir ölçülür ve PTFE ile cam solvent şişelerde muhafaza edilmelidir. Uzun süreli saklama için kloroform içeren çözücüler fosgenin üretimi, yüksek ölçüde reaktif bir asit klorür önlemek için renkli amber cam şişeler içinde saklanmalıdır. PTFE santrifüj tüpleri ve döner buharlaştırıcı balona kullanımdan önce metanol ve kloroform ile durulanmalıdır. Çözücüler ve / veya radyoaktif atıkların atılmasının gerektiğinde federal, eyalet ve / veya kurumsal atık bertaraf düzenlemelere uyun.

1.. Büyük Ölçekli Lipid A özütleme (50 mi 1.5 L)

1. Bir tek fazlı Bligh-Dyer karışımı hazırlayın: kloroForm-metanol-1X fosfat tuzlu su (PBS), pH 7.4 tampon, 1:2:0.8 v / v). Kloroform ve 200 mi, 1 L şişe içinde solvent PBS 400 ml metanol ve 160 ml birleştirin. Cap şişe ve çevirerek karıştırın (> 30x). Havalandırma ve mühürlü saklamak için karıştırma sırasında periyodik kapağını gevşetin.
2. Bir ön-dengelenmiş olarak, iki fazlı karışım, Bligh-Dyer-kloroform hazırlayın: metanol: su (2:2:1.8 v / v). Kloroform 400 ml, 400 ml metanol ve 1 L çözücü şişede 180 ml su birleştirin. Cap şişe ve çevirerek karıştırın, havalandırma karıştırma sırasında periyodik kapağını gevşetmek için emin olun. O / N ve mağaza mühürlü muvazene edelim.
3. Zayıf asit hidrolizi tamponu hazırlayın (50 mM sodyum asetat, pH 4.5, 1% sodyum dodesil sülfat (SDS)). Zayıf asit hidrolizi tamponu 500 ml için, sodyum asetat, 2.05 g ağırlığında bir 500 ml'lik bir cam kaba transfer edilir. Daha sonra 50 ml% 10 SDS eklemek, ~ 350 ml ve karıştırmaya bir hacme kadar su ilave edilir. Karıştırın ve 4.5 pH ayarlamak için, dereceli bir silindire aktarın ve 500 ml su ilave edilir.
4. Hazırlamakkloroform: metanol (4:1, v / v): 100 ml kloroform ölçün ve şişe çözücü aktarın. Metanol 25 ml ölçün ve kloroform ile karıştırın. Amber cam şişede saklayın.
5. Tek bir bakteriyel koloniden ortam 5 ml (Luria brot ya da diğer) inoküle. 37 ° C'de O / N büyütün, ya da büyümesi için gerekli olan C. Ekstraksiyon işleminin bir şeması Şekil 2'de gösterilmiştir.
6. Ertesi gün, OD ₆₀₀ ölçmek ve 0.05 'lik bir başlangıç ​​OD ₆₀₀ kültür 200 ml aşılamak için 5 ml O / N kültür kullanın. 0,8-1,0 ₆₀₀ ulaşılana kadar bir OD hücreler büyür.
7. 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile hasat hücreleri. Daha uzun spin kötü pelet suşları için gerekli olabilir. Medya Süpernatantı dökün.
8. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS), 50 ml hücre pelletini yıkayın. Pelet hücreleri santrifüj tekrarlayın. -20 ° C'de süpernatant ve mağaza hücre pelet dökün ya da 1.9 adıma geçin.
9. 40 ml süspansiyon hücreleri1x PBS ve (hücre süspansiyonu / tüp 20 ml gr), iki 250 ml PTFE santrifüj tüpleri arasında bölmek. Tek faz Bligh-Dyer için, her tüpe 25 ml kloroform ve 50 ml metanol ekleyin (kloroform: metanol: su; 1:2:0.8 v / v) (Şekil 2). Ters çevirerek karıştırınız ve komple hücre lizizi sağlamak için> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
10. 20 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüje karışımı. Bununla birlikte, fosfolipid, izoprenil yağlar, ve küçük hidrofobik peptitler, süpernatan içinde kalır; LPS protein ve nükleik asit (Şekil 2) ile birlikte topak olacaktır. Süpernatant atın.
11. ~ 100 ml bir faz Bligh-Dyer karışımı ile LPS pelet yıkayın. 20 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj. Süpernatant atın. E lipit A izole zaman E. coli veya Salmonella, tek bir yıkama gereklidir, ancak ek bir yıkama adımları bir organizmalardan lipid izole edilerek zaman fosfolipid kirlenmeyi azaltmak için gerekli olabilir.
12. Mi 27 ml ekleyinld asit hidrolizi tampon LPS pelletine (50 mM sodyum asetat, pH 4.5,, 1% SDS adım 1.3) ve sadece küçük parçacıkların kalıncaya kadar aşağı yukarı pipetleme ile karıştırın. Sonikasyon homojen olarak% 50 çıkışında 20 saniye boyunca bir sabit görev döngüsü prob ucu sonikatör ile çözelti içinde tekrar süspansiyon LPS pelet. Örnek 2x (patlamaları arasında 20 sn / patlama, ~ 5 saniye) Sonikasyon tekrarlayın.
13. 30 dakika boyunca bir su banyosu içerisinde kaynatın örnekleri. Dikkat: kapaklar sıkı, ancak tam kapalı olmadığından emin olun. Vibrio cholerae (V. cholerae) gibi bazı organizmalar, su banyosundan çıkarın ve şişe örnek geçmeden önce oda sıcaklığına soğumaya bırakın lipid A'nın genel verimini artırmak için daha uzun bir bekleme süresi (1 saat) gerektirir.
14. , Hidrolizden sonra lipidlerin çıkarılmasına bir kloroform, kloroform ve 30 ml metanol ve 30 ml ilave etmek suretiyle, iki fazlı Bligh-Dyer (Şekil 2) kanşımı içine SDS çözeltisi dönüştürmek için: metanol: su (2:2:1.8, v / v) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Ters çevirerek karıştırın ve 2 'de, 10 dakika için örnek santrifüj,000 x g. Cam bir pipet kullanarak temiz bir PTFE santrifüj tüpü içine alt fazı ayıklayın.
15. Adım 1.14 gelen üst faz, bir ön-dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer karışım (adım 1.2) daha düşük fazın 30 ml ilave etmek suretiyle ikinci bir ekstraksiyon gerçekleştirin. Karışım, daha sonra 10 dakika boyunca 2000 x g'de santrifüj. Alt fazı ayıklayın ve adım 1.14 çıkarılan alt aşaması ile havuzu.
16. Metanol: önceden dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer üst faz iki fazlı bir Bligh-Dyer karışım (kloroform oluşturmak için (adım 1.2) 114 ml ilave etmek suretiyle toplanmış alt evrelerini (60 ml toplam), yıkama suyu, 02:02: 1.8, v / v). Karıştırın. 10 dakika boyunca 2.000 x g'de santrifüj.
17. Döner buharlaştırma (Şekil 2) kullanılarak temiz bir cam bir döner buharlaştırıcı kabına ve kuru numune için alt faz çıkarın.
18. Şişenin taraftan lipidin süspansiyon içinde yardımcı olmak üzere döner bir şişede metanol (4:1, v / v), ve banyo-ses dalgalarına maruz bırakın (> 30 saniye): 5 kloroform ml ilave edilir. Temiz bir lipidin aktarmak için bir aktarma cam pipet kullanıncam tüp (13 x 100 mm veya daha büyük) PTFE ile kaplı fenolik vidalı kapakları kaplı. , Bir nitrojen kurutucu kullanılarak bir nitrojen akışı altında Kuru örnek.
19. Kloroform içinde 1 ml kuru lipid süspanse: metanol (4:1, v / v). Küçük hacimlerde kullanarak daha fazla nicel süspansiyonu için konik bir üs (aletler / reaktiflerin tabloya bakınız) küçük cam numune şişesine (12 x 32 mm) aktarın. Bir azot makinesi kullanarak kurutun.
20. Kurutulmuş örnek daha sonra, TLC (Protokol 2) veya MS analizi (Protokol 3, 4, ya da 5) kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir. (Not: Malzeme izole ve sonraki protokollerde kullanılan miktarı çoğu organizmalar için yeterli ne dayalı önerilmektedir aynı lipid örnek Protokolleri 2-5 kullanılabilir kaldırıldı% malzemenin not alarak daha fazla bilgi için Tartışma bakın...).

2. İnce Tabaka Kromatografiyle Lipid A Türlerin görselleştirme

1. TLC, hareketli faz olarak çözücü sistemi hazırlayın (: piridin:% 88 formik asit: kloroform su; 50:50:16:5 v / v). Combinkloroform e 200 mi, 200 ml piridin içinde, bir 1 L şişe içinde solvent 64% 88 formik asit ml ve 20 ml su. Cap şişe, inversiyon birden çok kez karıştırın ve havalandırma.
2. 20 x 20 cm tabak barındıracak bir TLC tankı kullanın. ~ 40 cm kromatografi kağıdı ile hat TLC tankı.
3. Piridin:% 88 formik asit: su (50:50:16:5, v / v) kanşımı TLC tanka kloroform içinde 200 ml. Tank, genellikle O / N tercih edilir ve daha uygun,> 3 saat boyunca ön denge sağlaması için izin verin.
4. Dondurucu kurutulmuş lipid örnekleri çıkarın (1,20 adıma) ve RT ılıştırıldı.
5. Bir tıraş bıçağı ile bir silika jel 60 TLC levhası üst kenarından silis çıkarın. Sıkıcı bir kalem kullanarak, plakanın alt, alttan 2 cm paralel bir çizgi çizin. Bu hat örnekleri tespit için kökenlidir. Mark 1 cm arayla örnekleri nokta bu referans hattı boyunca artırır.
6. Kloroform 200 ul aşama 2.4 kurutuldu, lipid çözülür: metanol (4:1, v / v), girdap ve sonikasyon (3x, her biri ~ 15 saniye), verim ~ 100 -E çıkarılan 500 ng / ml lipid A ise coli.
7. Adım 2,5 işaretlenmiş bir microcapillary cam pipet kullanarak, TLC plakası üzerine hacminin (20 ul) onda birini nokta. 15 dakika için ~ TLC plakası üzerinde kurumaya örnekleri izin verin. (Not: küçük cam şişeler içinde Numuneler, bir nitrojen kurutucu kullanılarak kurutulur ve protokoller 3-5 daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de muhafaza edilebilir çıkarıldı% malzeme not edin.).
8. Önceden dengelenmiş tanka lekeli örneklerini içeren TLC plaka koyun. Çözücü ön TLC plakasına (~ 2.5-3 saat) üst ulaştığında, plaka ve hava kuru (> 60 dk) çıkarın. Soğuk hava gun tam kuruluğa sağlamak için kullanılabilir.
9. Plaka kururken, yanmaları için 250 ° C'de sıcak plaka açın.
10. , Havalandırmalı kimyasal bir davlumbaz olarak, silis TLC plakası üzerinde çözüldü lipitler yanmaları için% 10 sülfürik asit-etanol karışımı hazırlanması (konsantre edilmiş sülfürik asit:% 100 etanol; 01:09 v / v). Sülfürik asit 10 ml ölçün ve% 100 etanol içinde 90 ml kadar yavaş yavaş ekleyin. Bakımtamamen karıştırın ve bir cam kromatografik reaktif atomizöre transfer.
11. Duman başlığı içinde,% 10 sülfürik asit-etanol karışımı ile kurutuldu, TLC plaka sprey için bir cam kromatografik reaktif atomizer kullanın. Plaka üzerinde eşit bir karışım sprey.
12. Kömürleşmiş lipit örnekleri siyah / kahverengi lekeler (<1 dak) olarak görünür kadar 250 ° C sıcak plaka üzerine TLC plakası yerleştirin. Bu tüm plaka kahverengi açmak için neden ve lipid A türlerin görselleştirme zor yapacak, plaka overexpose etmeyin.

3. MALDI-TOF kütle spektrometresi yolu ile lipid A'nın yapısal Karakterizasyonu

1. Adım 1.20, (veya adım 2.7) kaynaktan dondurucudan lipid A örneği kaldırmak ve oda sıcaklığına ılıştırıldı. Kuru lipid ~ bir örnek tekrar 20 ul kloroform: metanol (4:1, v / v) ve E ekstrakte edilen bir ~ 1-5 mg / ml lipid A çözelti elde etmek için girdap coli. (Not:% 10 daha az yoğun, adım 2.7 den kullanılan malzeme).
2. ATT matris bileşenleri hazırlayın. Doymuş 6-aza% 50 asetonitril-2-tiyotimin: 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne su ve 500 ul asetonitril içindeki 500 ul ekleyin ve sonra eklemek> 10 mg 6-aza-2-tiyotimin% 50 asetonitril süper doymuş böylece. Doymuş tribazik amonyum sitrat çözeltisi: çökeltilmesi, 500 ul su ile> 1 mg ekleyin aşikar olmalıdır. Kullanmadan önce Vortex ve santrifüj çözümleri; sadece doymuş yüzer kullanılır.
3. ATT matris karışım hazırlayın:% 50 asetonitril, doymuş 6-aza-2-tiyotimin, tribazik, doymuş amonyum sitrat (20:1, v / v). MALDI plakasına uygulamadan önce 500 ul mikro santrifüj tüpüne, karıştırmak için girdap ve santrifüj tribazik amonyum sitrat çözeltisi, doymuş 1 ul ATT çözeltisinin 20 ul eklenmesi ile birlikte matris bileşenlerini karıştırın.
4. En doğru kütle / yük oranı belirlenmesini sağlamak için, numuneler, yatırılır yere yakın bir noktada MALDI plakaya 0.5 ul kalibrant karışımı ekleyerek MALDI plaka hazırlayın.
5. 0.5 ul Yatirmamlipid A numunesi yatırılır olacak her noktada MALDI tabağa ATT matrisi.
6. Plaka karıştırın ve en uygun iyon sinyalleri için tarama numunesi tarafından spektrumu (Şekil 3) elde etmek için ATT matrisin nokta üzerine Deposit örnek 0.5 ul (toplam numune% 2.5). Not: en uygun MS sinyali tutarlar organizma ile değişir ve ampirik olarak tespit edilmesi gerekiyor olabilir. Daha fazla malzeme eklemek için bir 0.5 ul lekeli karışım daha numunenin eklenmesinden arasında kurumasını sağlayan birden çok kez nokta olabilir. Örnek, aynı zamanda (a daha küçük bir hacim içinde tekrar süspansiyon ve kuru) konsantre edilmiş veya gerektiğinde seyreltilebilir. Daha başlangıç ​​malzemesi (hücre kültürü başlangıç ​​hacmi) da (tartışmaya bakınız) kullanılabilir.

4. Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometrisi ve Lipid A Çarpışmanın neden olduğu ayırma

1. Bir kloroform hazırlayın: metanol çözücü karışımı (1:1, v / v), bir cam sol içinde 200 ml HPLC dereceli kloroform ile HPLC dereceli bir metanol 200 ul stok karıştırılarakşişe delik.
2. (Adım 1.20, 2.7, 3 ya da Protokol sonra kurutuldu, ikinci gibi) lipid A ile şişeye metanol çözücü karışımı ve lipid 5 dakika için ya da tüm malzeme çözülünceye kadar bir çözelti sonikasyon: kloroform 200 ul aktarın.
3. Negatif mod elektrosprey iyonizasyon için kütle spektrometresi ayarlayın.
4. 250 ul şırınga ve bir şırınga pompası kullanılarak, doğrudan 2,0-3,5 ul / dk 'lık bir akış oranında seyreltilmiş lipid A örneği aşılamak.
5. Iyon optik tuning tarafından optimize etmek ve lipid A iyon sinyali geliştirmek. Tam Kütle spektrumu artık lipit A türlerinin (Şekil 4) toplanabilir.
6. Yalıtmak ve MS / MS yöntemi olarak CID seçerek hedef lipit A'yı etkinleştirmek.
7. Bir tür yüksek ürün iyonu ile karşılaştırıldığında yaklaşık% 10 nispi bolluk öncü lipid kadar CID gerilimi (veya normalize çarpışma enerjisi, NCE) artırın.
8. Sinyal-gürültü yeterli th için elde edilene kadar, elde edilmesi ve ortalama spektrumlarıe ürün iyonları. Gerekli tarama sayısı, orijinal ön sinyal yoğunluğuna bağlıdır ve 3-300 taramaları (Şekil 5A) arasında olabilir.

5. Ultraviyole Fotodissosiasyon tarafından Lipid A MS / MS

1. Adımlarda 4.1-4.5 gibi örnek ve kütle spektrometresi hazırlayın.
2. Kütle spektrometresine arabirim lazer açın. Kitle spektometre cihazı bir 193 nm excimer lazer ile donatılmış ve aletin HCD hücrede UV aktivasyonunu sağlamak için modifiye edildi. Fotodissosiasyon önce ³⁵ de tarif edilene benzer bir şekilde uygulanmıştır. Biz yüksek enerji C-trap ayrışma (HCD) hücre içine fotonlar iletmek için bir _CaF2'nin optik pencere ile modifiye vakum manifoldu kullanın. Lazer pulse / gecikme jeneratörü kütle spektrometresi bir transistör-transistör mantığı (TTL) sinyali ile MS / MS sırasında tetiklenir.
3. Lazer excimer lazer tetikleyecek böylece enstrüman yazılımı kurduğunuzdaiyonları HCD hücreye girin. Bu, yazılımın mütevazı bir değişiklik yapılmasını gerektirir.
4. Lazer her 2 msn (500 Hz) darbeli olduğu gibi darbe jeneratörü açın.
5. MS / MS yöntemi olarak HCD seçerek lipid A ön-madde izole iyonu ve% 1 NCE çarpışma enerjisi ayarlayın. Bu HCD hücre içinde ultraviyole ayrışması için ön-madde iyonları izolasyonunu sağlar. HCD hücre kullanılır, ancak yazılım bu aralıkta UVPD gerçekleştirmek için modifiye edilir.
6. Lazer enerjisini lazer artırmak ve pals sayısını ayarlayarak, izole edilmiş lipid A iyonu etkinleştirir. Tipik bir deney UVPD on 6 ml darbeleri kullanılarak gerçekleştirilir.
7. , Yeterli bir sinyal-gürültü UVPD ürün iyonları için elde edilene kadar aşama 4.8 'de olduğu gibi, elde etmek ve ortalama spektrumları. Gerekli tarama sayısı, orijinal ön sinyal yoğunluğuna bağlıdır ve 3-300 taramaları (Şekil 5B) arasında olabilir.

6.. ³² P-EtiketlemeLipid A ve sonraki İzolasyonu

1. Tek bir koloniden ortam (Luria suyu ya da diğer ortam) 5 ml inoküle. 37 ° C ya da gerekli sıcaklıkta O / N büyütün.
2. Ertesi gün, OD ₆₀₀ ölçmek ve standart bir 20 x 150 mm atılabilir cam tüp kültür yetiştirilir ~ 0.05 'lik bir başlangıç ​​OD _600, kültür 7 ml aşılamak için O / N kültür kullanın. İnorganik ³² P. 2.5 uCi / ml ekleyin 0,8-1,0 ₆₀₀ ulaşılana kadar bir OD hücreler büyür. Federal, eyalet ve / veya radyoaktif maddelerin güvenli ve uygun kullanımı için kurumsal yönergeleri takip edin.
3. PTFE ile 16 x 125 mm cam santrifüj tüplerine Hasat hücreleri 10 dakika için 1500 xg, sabit açılı bir klinik santrifüj kullanılarak kap dizildi. Uygun radyoaktif atık kabı içine süpernatant kaldırmak. Sonraki adımda üretilen tüm radyoaktif atıklar (örneğin sıvı, cam, biohazard) federal, eyalet uyarınca bertaraf ve / veya kurumsal gui olmalıdırdelines.
4. 1 x fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde 5 ml hücre pelletini yıkayın. 1500 x g 10 dakika boyunca santrifüj. Süpernatant atın.
5. Tek fazlı Bligh-Dyer karışımı, 5 ml kloroformdan oluşan (Şekil 2) içinde süspanse hücreleri: metanol: su (1:2:0.8, v / v). Vortex karıştırın ve tam hücre lizizi sağlamak için> 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe.
6. 20 dakika boyunca 1500 x g'de klinik santrifüjünde santrifüj. Yavaşça fosfolipidler ve izoprenil lipitleri içeren süpernatant, dökün.
7. 50 mM sodyum asetat, pH 4.5, 1.8 ml LPS pelletini, 1% SDS tampon girdaplanır. Pelet eşit dağılana kadar bir banyo sonikatörle sonicate örnek (~ 30 sn).
8. Kaynayan su banyosu, 30 dakika için örnek inkübe edin. Emin kapaklar sıkı ama mühürlü değildir olun.
9. Su banyosundan çıkarın ve örnek 5-10 dakika için oda sıcaklığında soğumaya bırakın.
10. 2 ml kloroform ve 2 ml ilave etmek suretiyle, iki fazlı Bligh-Dyer karışımına solüsyonu değiştirmekmetanol, bir kloroform elde edilmiştir: metanol: sulu (2:2:1.8 v / v) karışımı ile gerçekleştirilmektedir. Karıştırmak Vortex ve ayrı fazlar 1500 xg'de klinik santrifüj cihazında 10 dakika boyunca santrifüj.
11. Bir cam pipet (ilk ekstraksiyon) kullanarak temiz bir cam santrifüj tüpü içine alt fazı ayıklayın.
12. Adım 11 kalan üst faz (adım 1.2 'de olduğu gibi hazırlanmıştır) önceden dengelenmiş iki fazlı Bligh-Dyer alt faz 2 ml eklenerek numune üzerine bir ikinci çıkarma yapın. Vortex ve santrifüj 10 dk. Alt faz çıkarın ve birinci çıkartılmasından alt faz ile bir araya getirmektedir.
13. Metanol: toplanmış alt faz (~ 4 mL toplam hacim) için, iki fazlı bir Bligh-Dyer çözeltisi (kloroform, sonuçta önceden dengelenmiş üst faz (adım 1.2) içinde 7.6 ml su ekleyin, 2:2:1.8, v / v). 10 dakika boyunca vorteks ve santrifüj.
14. Temiz bir cam tüpe alt evresine çıkarın ve bir azot kurutma makinesi ile kurutun. Kurutulmuş numuneler sonraki kullanıma kadar -20 ° C'de muhafaza edilebilir.

7. Visualiİnce Tabaka Kromatografisi ile ³² P-etiketli Lipid A Türlerin yon

1. 2,1-2,8 adımları tarif edildiği gibi ³² P-etiketli lipid A örneği, TLC tankı ve TLC plakaları hazırlayın.
2. 04:01 kloroform-metanol (v / v) 500 ul ³² P-etiketli örnek çözülür. Vortex ve banyo sonicate tamamen lipid malzemeyi eritmek için. Sintilasyon kokteyli ihtiva eden 5 ml sintilasyon şişesine örnek 5 ul ekle. Sintilasyon sayacında sayısı ve numunenin toplam sayım / dak hesaplar.
3. Radyo-etiketli lipid türleri imgelerken, 10 x 20 cm veya 20 cm x 20 TLC plakaları kullanılabilir. Levhanın en uzun boyut (kökeni lekeli yani numuneler 10 cm kenarı üzerinde 2 cm işaretli) dikey şekilde 10x20 cm levhalar için, numuneler adım 2.5 işaretli kökenli birlikte tespit edilmelidir.
4. Microcapillary pipet kullanarak, plaka üzerinde 10,000-20,000 cpm / örnek nokta ve noktalar (> 15 dakika) kurumasını bekleyin. Örnekler altında kurutma ile konsantre edilmesi gerekebilirazot ve 10,000-20,000 sayım / dakika / nokta (<10 ul toplam için her seferinde 2 ul ya da 2 ul) elde etmek için, uygun bir hacimde yeniden süspansiyon haline getirilmiştir.
5. Önceden dengelenmiş tanka radyo-etiketli örneklerini içeren TLC plaka koyun. Çözücü ön TLC plakası (~ 3 saat) üst ulaştığında, plaka ve hava kuru (> 60 dk) çıkarın. Dikkat: piridinin eser miktarda fosforlu ekranlar zarar olarak piridin varlığında gerçekleştirilir TLC levhalar, kimyasal bir çeker ocak içinde iyice kurutulmalıdır. Soğuk hava gun tam kuruluğa sağlamak için kullanılabilir.
6. Plastik wrap plaka sarın ve bir otoradyografisidir kaset O / N. fosforimager ekrana maruz Ertesi sabah, görüntüyü (Şekil 6) elde etmek için ekrana tarar. Görüntü dansitometre analizi yazılımını kullanarak, bu yöntem, lipid A türlerin, doğru nispi ölçümü sağlar.

Sonuçlar

E. kanonik lipid A ve 4 '-pozisyonları - coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium bir heksa-asilatlanmış 1 de fosfat grupları ile glukozamin disakkarittir. Zengin ortam (örneğin, Luria Broth) büyüme sırasında lipid A kısmı, tris-fosforile türlerin ³⁶ (Şekil 1) elde 1-pozisyonunda bir pirofosfat grubu içerir. Kdo (3-deoksi-D-manno-oktuiosonik asit), bağlı olup 6'-hidroksil ve LPS kalan karbonhidrat etki (...

Tartışmalar

Bu protokolde, bakterilerin bütün hücrelerden lipid A türlerin izole ayrıntılı ve kimyasal olarak, bu izole edilmiş malzemenin karakterize etmek için TLC ya da MS-analitik yöntemler tarif etmişlerdir. Tandem kütle spektrometresi biyolojik bileşiklerin de novo yapısal karakterizasyonu için güçlü bir stratejidir, ve doğada gözlenen lipid A molekülleri yelpazesine kimyasal karakterizasyonu için paha biçilemez. CID ve UVPD lipid A molekülleri için anahtar parmak izi sağlayan ürün iyonlar...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1