Isolement et caractérisation chimique du lipide A de bactéries à Gram négatif

Résumé

Isolement et caractérisation des lipides Un domaine de lipopolysaccharide (LPS) des bactéries à Gram négatif donne un aperçu des mécanismes de surface cellulaire sur la base de la résistance aux antibiotiques, la survie des bactéries et de remise en forme, et comment chimiquement lipidique diversifié A espèces moléculaires moduler différemment les réponses immunitaires innées de l'hôte.

Résumé

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface cellulaire des bactéries gram-négatives, déposée sur le feuillet externe de la bicouche de la membrane externe. LPS peuvent être subdivisés en trois domaines: le O-polysaccharide distale, un oligosaccharide de noyau, et le lipide A domaine constitué d'un lipide A des espèces moléculaires et des résidus d'acide 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo). Le lipide A est le seul domaine composant essentiel pour la survie de la cellule bactérienne. Suite à la synthèse, le lipide A est chimiquement modifiée en réponse à des stress environnementaux tels que le pH ou la température, de favoriser la résistance aux composés antibiotiques, et d'échapper à la reconnaissance par les médiateurs de la réponse immunitaire innée hôte. Le protocole suivant détaille l'isolement à petite et grande échelle de lipide A partir de bactéries gram-négatives. Matériau isolé chimiquement est alors caractérisé par chromatographie sur couche mince (TLC) ou la spectrométrie de masse (MS). En plus de laser assistée par matrice de désorption / ionisation à temps de flumière (MALDI-TOF) MS, nous décrivons également les protocoles MS en tandem pour l'analyse des lipides Une espèce moléculaire en utilisant l'ionisation électrospray (ESI) couplée à dissociation induite par collision (CID) et nouvellement employés photodissociation ultraviolet (UVPD) des méthodes. Nos protocoles de MS permettent une détermination sans faille de la structure chimique, primordiale pour la caractérisation de molécules lipidiques A qui contiennent des modifications uniques ou de nouveaux produits chimiques. Nous décrivons également l'étiquetage radio-isotopique, et isolement subséquent, de lipide A partir de cellules bactériennes pour l'analyse par CCM. Par rapport à des protocoles MS, CCM fournit une méthode de caractérisation plus économique et plus rapide, mais ne peut pas être utilisé pour attribuer sans ambiguïté lipide A structures chimiques sans l'utilisation des normes de la structure chimique connue. Au cours des deux dernières décennies isolement et la caractérisation de lipide A a conduit à de nombreuses découvertes passionnantes qui ont amélioré notre compréhension de la physiologie des bactéries, des mécanismes de résistance aux antibiotiques à Gram négatiftance, la réponse immunitaire innée humaine, et ont fourni de nombreuses nouvelles cibles pour le développement de composés antibactériens.

Introduction

Le lipopolysaccharide (LPS) est la principale molécule de la surface extérieure de presque tous les organismes gram-négatif et est constituée de trois domaines moléculaires: un antigène O polysaccharidiques distale, un oligosaccharide de noyau et le lipide associé à la membrane Un domaine déposé sur le feuillet externe de la membrane bicouche externe ^1,2. Le lipide Un domaine se compose de 3-désoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) les résidus et un lipide une espèce moléculaire, où le lipide A peut être définie comme la fraction soluble dans le chloroforme de LPS lors de l'hydrolyse légère acide ^{1, 2.} Le lipide A de la molécule de type peut être défini chimiquement comme une épine dorsale qui est diglucosamine hexa-acylé et le bis-phosphorylé, en accord avec les principales espèces de lipide A observées dans l'organisme modèle Escherichia coli (E. coli) ^1,2. Neuf gènes exprimés de manière constitutive, conservés tout au long de bactéries gram-négatives, sont responsables de la production du domaine de lipide A (Figure 1) ^1,2. La plupart des bactéries ont un jeu supplémentaire de gènes, qui varient en degré de conservation phylogénétique, qui participent à une autre modification chimique du lipide A ^3. La déphosphorylation, l'élimination des chaînes acyle, et l'addition de groupements chimiques, tels que des amino-sucres (par exemple aminoarabinose) et / ou de la phosphoéthanolamine sont les activités les plus fréquemment observés (Figure 1). Beaucoup des enzymes responsables de lipides Une modification sont directement activés par des signaux environnementaux, tels que des cations bivalents ou leur expression est régulée par deux systèmes de réponse-régulateur composants ^3.

Reconnaissance d'espèces lipidiques A par le système immunitaire inné hôte est médiée par le récepteur de type Toll-like facteur de différenciation 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) co-récepteur ^4. Forces hydrophobes entre MD2 et le lipide A des chaînes acyle, ainsi qu'entre TLR4 et les 1 et 4 'groupes phosphates de lipide A promouvoir la forte association de la lèvreid avec TLR4/MD2 ^4,5. Les modifications qui modifient l'état d'acylation ou la charge négative du lipide A à base de lipide A TLR4/MD2 incidence reconnaissance et en aval de la stimulation de la réponse immunitaire innée activateurs de NF-kB et de médiateurs de l'inflammation tels que TNFa et IL1-β ^6,7. Modifications qui masquent la charge négative de lipide A éviter également des peptides antimicrobiens cationiques bactéricides de se lier à Gram négatif surfaces cellulaires ^3,8. De nombreuses modifications de lipide A sont émis l'hypothèse d'améliorer la condition physique des bactéries dans des conditions environnementales spécifiques, tels que l'intérieur de l'hôte humain ou dans une niche écologique. Pour cette raison, de nombreuses enzymes de modification sont des cibles intéressantes dans le développement rationnel de composés antimicrobiens. La diversité chimique des structures lipidiques A, par rapport à l'organisme et / ou de l'environnement, et les implications biologiques de ces diverses structures rendre la caractérisation structurale de lipide A un effort important dans de til étudier des bactéries gram-négatives.

L'isolement des molécules de lipide A de bactéries entières implique l'extraction de LPS à partir de la surface de la cellule bactérienne, une étape d'hydrolyse pour libérer le lipide A, suivie par une procédure de purification finale ^9-11. Le LPS procédure la plus fréquemment citée d'extraction est le chaud phénol procédure d'extraction de l'eau, d'abord introduit par Westphal et Jann ^10. Après extraction LPS ensemble est soumis à une hydrolyse douce-acide, qui sépare chimiquement Kdo de la 6'-hydroxy du sucre de glucosamine distale du lipide A (figure 1). De nombreux écueils existent pour la procédure de l'eau chaude-phénol y compris l'utilisation d'un réactif de risque élevé, la nécessité de dégrader les acides co-extraits nucléiques et des protéines, et plusieurs jours sont nécessaires pour compléter le protocole ^10.

Notre laboratoire a développé l'extraction et l'isolement du lipide A comme premier développé par Caroff et Raetz ^12,13. Par rapport aux procédés de l'eau chaude-phénol, le procédé présenté ici est plus rapide et efficace et s'adapte à une large gamme de volumes de culture de 5 ml à plusieurs litres. En outre, contrairement à l'extraction de l'eau chaude-phénol, notre méthode ne sélectionne pas pour rugueuses ou lisses-types de LPS, en fournissant une récupération optimale des espèces lipidiques A. Dans notre protocole, la lyse chimique des cellules bactériennes entières est effectuée en utilisant un mélange de chloroforme, de méthanol et d'eau, où LPS peuvent être rassemblées en un culot par centrifugation. Une combinaison d'une hydrolyse douce-acide et extractions par solvant (Bligh-Dyer) sont utilisés pour libérer le lipide A de polysaccharide lié de manière covalente. La méthode de Bligh et Dyer a été appliqué d'abord à l'extraction d'espèces lipidiques à partir d'une variété d'animaux et des végétaux tissus ^14, modifié ici pour séparer le polysaccharide hydrolysé de lipide A. Dans cette étape de séparation finale, le chloroforme lipides solubles partitionner de manière sélective dans la phase organique inférieure phase. Pour purifier davantage le lipide A, en phase inverse ouChromatographie sur colonne d'échange anionique peut être utilisé ^12.

Après isolement des espèces lipidiques A partir de cellules entières, un certain nombre de méthodes d'analyse peut être utilisée pour caractériser la structure chimique de la matière d'isolement telles que la RMN, chromatographie sur couche mince, et l'analyse MS. RMN permet élucidation de la structure non-destructive, et fournit des détails structurel lié à des liaisons glycosidiques, l'attribution sans équivoque des positions de la chaîne acyle, et cession de sites de fixation pour le lipide A modifications comme aminoarabinose ou phosphoethanolamine ^15-17. analyse par RMN du lipide A n'est pas discutée au sein de notre protocole, mais a été correctement décrit ailleurs ^15,16. Pour une analyse rapide TLC basées méthodes sont fréquemment utilisées, mais ne parviennent pas à fournir des informations directes sur la structure de la chimie fine. Protocoles MS sont la méthode la plus fréquemment utilisée pour caractériser les structures lipidiques A ^18,19. Matrice associée ionisation par désorption laser (MALDI)-MS est souvent utilisé pour sonder initialement espèce de lipide A intactes. Ions à charge sont générés à partir analyte préparée selon nos procédures d'extraction. Comme l'analyse structurale plus fine est nécessaire, des méthodes basées MS / MS s'avèrent plus informatif que MALDI-MS. Couplé à ionisation électrospray (ESI) de lipides seuls ou à plusieurs charges A ions précurseurs sont encore fragmenté par dissociation induite par collision (CID) ou photodissociation ultraviolet (UVPD), pour générer des ions structurellement information sur les produits ^18,20,21. Produits de perte de neutre lipide A ions précurseurs sont également fréquemment générés pendant ESI-MS à fournir une couche supplémentaire d'information structurale.

Spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) s'est avérée être une méthode indispensable et polyvalent pour l'élucidation des structures lipidiques A. Au cours de MS / MS, les ions sont activés pour obtenir un schéma de fragmentation de diagnostic qui peut être utilisée pour élucider la structure de l'ion précurseur. Le plus largement available méthode MS / MS est CID. Cette méthode produit des ions fragmentés par collision de l'ion précurseur choisi avec un gaz inerte cible, ce qui entraîne le dépôt d'énergie qui conduit à la dissociation. CID s'est avéré un outil essentiel dans l'attribution des lipides Une structure pour un large éventail d'espèces bactériennes ^22-33.

Bien que le procédé est CID MS / MS plus universellement mis en oeuvre, il génère un éventail limité d'ions sur les produits. 193 nm UVPD est une alternative et complémentaire méthode MS / MS. Cette méthode utilise un laser pour irradier des ions, et l'absorption de photons se traduit par excitation des ions et la dissociation subséquente. Cette énergie technique MS / MS plus élevée produit un éventail plus diversifié d'ions produits que CID et fournit des modèles de fragmentation plus informatifs ainsi. En particulier, UVPD donne des informations sur les changements subtils dans les espèces lipidiques A sur la base de clivages au glycosidique, amine, acyle et CC obligations indexées ^18,21,34.

Protocole

Toutes les solutions doivent être préparées avec de l'eau ultra pure et méthanol de qualité HPLC et le chloroforme. Solutions préparées contenant des solvants organiques tels que le méthanol, le chloroforme, ou la pyridine et les acides concentrés ou de bases doivent être préparés et utilisés sous une hotte chimique. Toutes les solutions peuvent être stockées à température ambiante. Les solvants doivent être mesurés dans un cylindre de verre gradué et stockés dans des bouteilles en verre de solvant avec PTFE bordée bouchons. Pour le stockage à long terme des solvants contenant du chloroforme doivent être stockés dans des flacons en verre ambré teinté afin d'éviter la production de phosgène, un chlorure d'acide hautement réactif. Tubes PTFE de centrifugeuses et des flacons de l'évaporateur rotatif doivent être rincés avec du méthanol et du chloroforme avant de l'utiliser. Respecter les règlements fédéraux, provinciaux et / ou d'élimination des déchets institutionnel nécessaires lors de l'élimination des solvants et / ou de déchets radioactifs.

Une. Large Scale lipide A Extraction (50 ml à 1,5 L)

1. Préparer une Bligh-Dyer mélange monophasé: chlorophosphate sous forme-méthanol-1X (PBS), pH 7,4 en tampon; 1:2:0.8 v / v). Mélanger 200 ml de chloroforme, 400 ml de méthanol et 160 ml de PBS dans une bouteille de solvant L. bouteille de Cap et mélanger par inversion (> 30x). Desserrer le bouchon périodiquement pendant le mélange pour évacuer et stocker fermé.
2. Préparer deux phases Bligh-Dyer mélange chloroforme pré-équilibrée: méthanol: eau (2:2:1.8 v / v). Combiner 400 ml de chloroforme, 400 ml de méthanol et 180 ml d'eau dans une bouteille de solvant L. Cap bouteille et mélanger par inversion, en veillant à desserrer bouchon périodiquement pendant le mélange se défouler. Laissez équilibrer O / N et magasin fermé.
3. Préparer le tampon d'hydrolyse acide douce (acétate de sodium 50 mM, pH 4,5 et 1% de dodécylsulfate de sodium (SDS)). Pour 500 ml de tampon d'hydrolyse acide douce, peser 2,05 g d'acétate de sodium et le transférer à un bêcher de 500 ml. Ajouter de l'eau à un volume d'environ 350 ml et mélanger, puis ajouter 50 ml de SDS à 10%. Mélanger et ajuster le pH à 4,5, transférer à une éprouvette graduée, et ajouter de l'eau à 500 ml.
4. Préparerchloroforme: methanol (4:1, v / v): Mesurer 100 ml de chloroforme et le transférer à la bouteille de solvant. Mesurer 25 ml de methanol et mélanger avec du chloroforme. Stocker dans de l'ambre bouteille en verre.
5. Inoculer 5 ml de milieu (bouillon Luria ou autres) à partir d'une seule colonie bactérienne. Cultiver O / N à 37 ° C, ou du nécessaire ° C pour la croissance. Un schéma de la procédure d'extraction est représentée sur la figure 2.
6. Le lendemain, mesurer la DO ₆₀₀ et utiliser la culture 5 ml O / N pour inoculer 200 ml de culture à un OD à partir _{de 600} de 0,05. Cultiver les cellules jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,8-1,0 est atteint.
7. récolte des cellules par centrifugation à 10 000 xg pendant 10 min. Tourne plus peut être nécessaire pour les souches qui Pellet mal. Verser le surnageant des médias.
8. Laver culot de cellules avec 50 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Répétez centrifugation pour sédimenter les cellules. Verser le surnageant et culot cellulaire de conserver à -20 ° C, ou passez à l'étape 1.9.
9. Resuspendre les cellules dans 40 mlde PBS 1x et fracture entre deux tubes PTFE 250 ml de centrifugeuses (rendement 20 ml de suspension de cellules / tube). Ajouter 25 ml de chloroforme et 50 ml de methanol à chaque tube, à une seule phase de Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau, 1:2:0.8 v / v) (Figure 2). Mélanger par inversion et incuber à température ambiante pendant> 20 minutes pour assurer une lyse complète des cellules.
10. Centrifuger le mélange à 2000 xg pendant 20 min. LPS se sédimenter en même temps que des protéines et des acides nucléiques (figure 2), cependant, des phospholipides, des lipides, et isoprényles petits peptides hydrophobes resteront dans le surnageant. Jeter le surnageant.
11. Laver le culot LPS avec un mélange ~ 100 ml monophasé Bligh-Dyer. Centrifuger à 2000 g pendant 20 min. Rejeter le surnageant. Lorsque isoler le lipide A de E. coli ou Salmonella, un seul lavage est nécessaire, mais les étapes de lavage supplémentaires peuvent être nécessaires pour réduire la contamination des phospholipides lors de l'isolation lipide A de certains organismes.
12. Ajouter 27 ml de kmtampon d'hydrolyse acide de ld (acétate de sodium 50 mM, pH 4,5 et 1% de SDS, voir étape 1.3) de pastille LPS, et mélanger par pipetage de haut en bas jusqu'à ce que de petites particules restent. Soniquer à remettre en suspension homogène LPS culot en solution avec la pointe de la sonde de traitement ultrasonique à un cycle de service constant pendant 20 secondes à la sortie de 50%. Répétez sonication de 2x de l'échantillon (20 sec / éclater, ~ 5 sec entre les salves).
13. Échantillons Faire bouillir dans un bain d'eau pendant 30 min. Attention: assurez-vous que les bouchons sont serrés, mais pas totalement étanche. Certains organismes, comme Vibrio cholerae (V. cholerae) nécessitent de plus longues durées d'incubation (1 h) pour augmenter le rendement global du lipide A. Retirez les bouteilles du bain d'eau et laisser l'échantillon refroidir à température ambiante avant de procéder.
14. Pour extraire les lipides après hydrolyse, la solution de SDS à convertir en une à deux phases Bligh-Dyer (figure 2) le mélange par addition de 30 ml de chloroforme et 30 ml de methanol, par un mélange chloroforme: méthanol: eau (2:2:1.8, v / v). Mélanger par inversion et centrifuger l'échantillon pendant 10 min à 2,000 x g. Extraire la phase inférieure dans un tube de centrifugeuse en PTFE propre à l'aide d'une pipette en verre.
15. Effectuer une seconde extraction en ajoutant 30 ml de phase inférieure d'un mélange de Bligh-Dyer pré-équilibré à deux phases (étape 1.2), de la phase supérieure de l'étape 1.14. Mix, puis centrifuger à 2000 g pendant 10 min. Extraire la phase inférieure, et en commun avec la phase inférieure extrait à l'étape 1.14.
16. Laver les phases inférieures communs (60 ml au total) en ajoutant 114 ml de pré-équilibrée à deux phases Bligh-Dyer phase supérieure (étape 1.2) pour créer un mélange à deux phases Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau; 02h02: 1,8, v / v). Mélanger. Centrifuger à 2000 g pendant 10 min.
17. Retirer la phase inférieure à un ballon d'évaporateur rotatif en verre propre et sèche l'échantillon en employant une evaporation rotative (figure 2).
18. Ajouter 5 ml de chloroforme: méthanol (4:1, v / v) dans le ballon rotatif, et un bain de sonication-(> 30 sec) pour aider à la suspension de lipides à partir des côtés du ballon. Utiliser une pipette de transfert en verre pour transférer des lipides à un nettoyagetube de verre (13 x 100 mm ou plus) coiffé d'PTFE phénoliques capsules à vis. Extrait sec sous un courant d'azote en utilisant un sécheur d'azote.
19. Remettre en suspension les lipides séchés dans 1 ml de chloroforme: methanol (4:1, v / v). Transfert à petite fiole à échantillons en verre (12 x 32 mm) avec une base conique pour la remise en suspension plus quantitative à l'aide de petits volumes (voir le tableau de l'équipement / Réactifs). Séchez à l'aide d'un sèche-azote.
20. Échantillon séché peut être conservé à -20 ° C jusqu'à ce qu'une CCM ultérieure (Protocole 2) ou MS analyse (protocole n ° 3, 4, ou 5). (Remarque: Montant de matériel isolé et utilisé dans des protocoles ultérieurs est suggéré basé sur ce qui est suffisant pour la plupart des organismes du même échantillon de lipides peut être utilisé dans les protocoles 2-5, prenant note de matériel% enlevé Voir discussion pour plus de détails...).

2. Visualisation des lipides Une espèce par chromatographie sur couche mince

1. Préparer le système de solvant de phase mobile TLC (chloroforme: pyridine: acide formique à 88%: de l'eau; 50:50:16:5 v / v). Combine 200 ml de chloroforme, 200 ml de pyridine, 64 ml d'acide formique à 88%, et 20 ml d'eau dans une bouteille de 1 litre de solvant. Cap bouteille, mélanger par inversion à plusieurs reprises, et de ventilation.
2. Utilisez un réservoir TLC qui pourra accueillir 20 x 20 cm plaques. Ligne réservoir CCM avec ~ papier de chromatographie de 40 cm.
3. Pour réservoir TLC ajouter 200 ml de chloroforme: pyridine: 88% d'acide formique: eau (50:50:16:5, v / v). Laissez le réservoir de pré-s'équilibrer pendant> 3 heures, souvent O / N est préférable et plus pratique.
4. Retirer les échantillons lipidiques secs du congélateur (étape 1.20) et laisser tiédir à température ambiante.
5. Avec un rasoir retirer la silice à partir du bord supérieur d'une plaque de gel de silice 60 TLC. En utilisant un crayon terne, tracer une ligne parallèle au fond de la plaque, 2 cm du fond. Cette ligne est à l'origine pour repérer les échantillons. Mark incrémente le long de cette ligne de référence pour repérer des échantillons de 1 cm.
6. Dissoudre lipide séché de l'étape 2.4 dans 200 ul de chloroforme: methanol (4:1, v / v), vortex et sonication (3 x, ~ 15 s chacun), les rendements ~ 100 -500 ng / ul lipide A si extrait de E. coli.
7. En utilisant une pipette de verre de micro-capillaire, repérer un dixième du volume (20 ul) sur la plaque de chromatographie sur couche mince comme indiqué dans l'étape 2.5. Laisser les échantillons à l'air sec sur plaque de CCM pour ~ 15 min. (Note: les échantillons dans des flacons en verre petit peuvent être séchées en utilisant un sécheur d'azote et conservés à -20 ° C pour une utilisation ultérieure dans des protocoles 5.3 Notez% de matière enlevée.).
8. Placer la plaque CCM contenant des échantillons repérés dans le réservoir pré-équilibrée. Une fois devant solvant atteint le sommet de la plaque de CCM (~ 2,5-3 h), enlever la plaque et l'air sec (> 60 min). Un pistolet d'air froid peut être utilisé pour assurer siccité complète.
9. Tandis que la plaque sèche, tourner sur la plaque chaude à 250 ° C pour la carbonisation.
10. Dans une hotte chimique ventilé, préparer le mélange d'acide sulfurique et d'éthanol à 10% pour la carbonisation des lipides résolus sur la plaque de chromatographie sur couche mince de silice (acide sulfurique concentré: 100% d'éthanol, 01:09 v / v). Mesurer 10 ml d'acide sulfurique et on ajoute lentement à 90 ml d'éthanol à 100%. Soinsentièrement mélanger et transférer à un réactif atomiseur de chromatographie en verre.
11. Dans la hotte, utiliser un verre chromatographique réactif atomiseur pour pulvériser la plaque de CCM séché avec un mélange d'acide sulfurique et d'éthanol 10%. Vaporisez le mélange uniformément sur la plaque.
12. Placer la plaque CCM sur la plaque chauffante à 250 ° C jusqu'à ce que des échantillons de lipides carbonisés apparaissent comme des taches noires / brunes (<1 min). N'exposez pas la plaque, car cela provoquerait la totalité de la plaque à brunir et rendre la visualisation des espèces lipidiques A difficile.

3. La caractérisation structurale du lipide A par l'intermédiaire de MALDI-TOF Mass Spectrometry

1. De l'étape 1.20, (ou étape 2.7) enlever lipides Un échantillon du congélateur et laisser réchauffer à température ambiante. Remettre en suspension les lipides séchés dans un échantillon de ~ 20 ul de chloroforme: methanol (4:1, v / v) et pour obtenir un vortex ~ 5.1 ug / ul de solution de lipide A si extrait de E. coli. (Remarque: 10% moins concentré si le matériel utilisé à partir de l'étape 2.7).
2. Préparer ATT composants de la matrice. Saturés 6-aza-2-thiothymine à 50% d'acétonitrile: ajouter 500 ul d'eau et 500 pi d'acétonitrile dans un tube de 1,5 ml, puis ajouter> 10 mg 6-aza-2-thiothymine de sorte que le 50% d'acétonitrile est super-saturée. Tribasique une solution saturée de citrate d'ammonium: Ajouter> 1 mg à 500 pi d'eau, précipiter devrait être évident. solutions Vortex et centrifugeuses avant utilisation; ne surnageant saturé est utilisé.
3. Préparer le mélange de matrice ATT: saturée 6-aza-2-thiothymine à 50% d'acétonitrile, saturé citrate d'ammonium tribasique (20:01, v / v). Mélanger ensemble des composants de matrice en ajoutant 20 ul d'une solution à 1 ul ATT saturés tribasique solution de citrate d'ammonium dans 500 ul de centrifugation de tubes, vortex pour mélanger et centrifuger avant l'application à la plaque MALDI.
4. Préparer la plaque MALDI en ajoutant mélange d'étalonnage de 0,5 pi à la plaque MALDI sur une place près du lieu où les échantillons seront déposés, pour fournir la plus précise masse / charge rapport détermination l'.
5. Déposer 0,5 piATT de matrice sur la plaque MALDI sur chaque endroit où lipidique Un échantillon sera déposé.
6. Caution 0,5 pi de l'échantillon (2,5% de l'échantillon total) sur la place de la matrice ATT, à mélanger sur la plaque, et d'acquérir des spectres par échantillon de balayage des signaux d'ions optimales (Figure 3). Note: Les montants pour le signal le plus optimal MS peuvent varier en fonction de l'organisme et doivent être déterminées empiriquement. Pour ajouter plus de matière, on peut repérer 0,5 pi à plusieurs reprises permettant mélange repéré sécher entre outre de plus l'échantillon. L'échantillon peut également être concentré (sec et remettre en suspension dans un volume plus petit) ou dilué si nécessaire. Plus la matière de départ (en volume de culture cellulaire de départ) peut également être utilisé (voir la discussion).

4. Spectrométrie de masse électrospray et dissociation induite par collision de lipide A

1. Préparer un mélange chloroforme: méthanol mélange de solvants (01:01, v / v) en mélangeant 200 pi actions de méthanol de qualité HPLC avec 200 ml de chloroforme HPLC grade dans un sol de verreventilation bouteille.
2. Transférer 200 ul de chloroforme: méthanol mélange solvant dans le flacon avec le lipide A (par exemple de l'étape 1.20, 2.7, ou séché après Protocol 3) et le lipide soniquer une solution pendant 5 min ou jusqu'à ce que tout le matériel est dissous.
3. Préparer le spectromètre de masse en mode électrospray négatif ionisation.
4. En utilisant une seringue de 250 pl et une pompe à seringue, injecter directement le lipide Un échantillon dilué à un débit de 2,0 à 3,5 pl / min.
5. Optimiser et d'améliorer le lipide A signal d'ions en réglant l'optique ionique. Un spectre de masse complet peut alors être recueilli de l'espèce de lipide A (figure 4).
6. Isoler et activer la cible lipide A en sélectionnant CID que la méthode MS / MS.
7. Augmenter la tension de la DRC (ou énergie de collision normalisée, NCE) jusqu'à ce que le lipide A de précurseur espèces est d'environ 10% d'abondance relative par rapport à l'ion de produit plus élevée.
8. Acquérir et spectres moyenne jusqu'à ce que suffisamment de signal-bruit est obtenue pour eions produits e. Le nombre de balayages nécessaires dépend de l'intensité du signal du précurseur initial et peut aller de 3 à 300 scans (Figure 5A).

5. MS / MS sur le lipide A par ultraviolet Photodissociation

1. Préparer l'échantillon et le spectromètre de masse comme dans les étapes 4.1 à 4.5.
2. Allumer le laser est relié au spectromètre de masse. Le spectromètre de masse a été équipé d'un laser à excimère de 193 nm et modifié pour permettre l'activation des UV dans la cellule de HCD de l'instrument. Photodissociation a été mis en œuvre d'une manière similaire à celle décrite précédemment ^35. Nous utilisons une rampe à vide modifiée avec une fenêtre optique de CaF ₂ pour transmettre des photons en énergie la plus élevée C-piège dissociation (HCD) cellule. Le laser est déclenché pendant MS / MS par une logique transistor-transistor (TTL) signal du spectromètre de masse à un générateur d'impulsions / de retard.
3. Mettre en place le logiciel de l'appareil de sorte que le laser va déclencher le laser excimer lorsque leles ions entrent dans la cellule de HCD. Cela nécessite une modification modeste du logiciel.
4. Mettre en marche le générateur d'impulsions de telle sorte que le laser est pulsé toutes les 2 ms (500 Hz).
5. Isoler le lipide A ion précurseur en sélectionnant HCD comme méthode MS / MS et ajuster l'énergie de collision de 1% des RCE. Cela permet l'isolement des ions précurseurs pour la dissociation ultraviolet à l'intérieur de la cellule HCD. Bien que la cellule HCD est utilisé, le logiciel est modifié pour effectuer UVPD pendant cet intervalle.
6. Activer le lipide A ion isolé en augmentant l'énergie du laser et en ajustant le nombre d'impulsions laser. Une expérience de UVPD typique sera effectuée en utilisant dix 6 ml impulsions.
7. Comme à l'étape 4.8, et acquérir des spectres moyenne jusqu'à ce que le bruit de signal-à-suffisante est obtenue pour les ions produits de UVPD. Le nombre de balayages nécessaires dépend de l'intensité du signal du précurseur initial et peut aller de 3 à 300 scans (Figure 5B).

6. ³² P-étiquetagede lipide A et isolement subséquent

1. Inoculer 5 ml de milieu (bouillon de Luria ou autre support) à partir d'une seule colonie. Cultiver O / N à 37 ° C ou à la température requise.
2. Le lendemain, mesurer la DO ₆₀₀ et utiliser la culture O / N pour inoculer 7 ml de culture à un OD à partir de ₆₀₀ ~ 0,05, cultivées dans un tube de culture en verre jetable de 20 x 150 mm. Ajouter 2,5 pCi / ml de ³² inorganique P. Cultiver les cellules jusqu'à une DO ₆₀₀ de 0,8-1,0 est atteint. S'il vous plaît suivez fédéral, état, et / ou les directives institutionnelles pour la manipulation correcte et sans danger des matières radioactives.
3. Récupération des cellules en 16 x 125 mm tubes à centrifuger en verre avec bouchon en PTFE aide d'une centrifugeuse clinique d'angle fixe à 1500 g pendant 10 min. Retirer le surnageant dans un récipient approprié des déchets radioactifs. Tous les déchets radioactifs (par exemple, liquide, verre, biohazard) généré dans les étapes suivantes doivent être éliminés conformément aux règlements fédéraux, provinciaux et / ou gui institutionneldelines.
4. Laver culot de cellules avec 5 ml de 1 x tampon phosphate salin (PBS). Centrifuger pendant 10 min à 1500 x g. Rejeter le surnageant.
5. Resuspendre les cellules dans 5 ml d'une seule phase de Bligh-Dyer mélange (figure 2) constitué par le chloroforme: méthanol: eau (1:2:0.8, v / v). Vortex pour mélanger et incuber à température ambiante pendant> 20 minutes pour assurer une lyse complète des cellules.
6. Centrifugeuse centrifugeuse clinique à 1500 g pendant 20 min. Verser doucement le surnageant, qui contient des phospholipides et lipides isoprényles.
7. Reprendre le culot dans 1,8 ml de LPS de l'acétate de sodium 50 mM, pH 4,5; tampon SDS 1% au vortex. Soniquer échantillon en utilisant un bain sonique jusqu'à culot est répartie de façon égale (~ 30 sec).
8. Incuber l'échantillon pendant 30 minutes dans un bain d'eau bouillante. Assurez-vous que les chapeaux sont serré, mais pas étanche.
9. Supprimer de bain d'eau et laissez refroidir l'échantillon à température ambiante pendant 5-10 min.
10. Autre solution dans l'un de Bligh-Dyer mélange à deux phases par addition de 2 ml de chloroforme et 2 ml d'methanol, ce qui donne un mélange chloroforme: methanol: mélange aqueux (2:2:1.8 v / v). Vortex à mélanger et centrifuger pendant 10 min dans la centrifugeuse clinique à 1500 xg à phases séparées.
11. Extraire la phase inférieure dans un tube à centrifuger en verre propre en utilisant une pipette en verre (première extraction).
12. Effectuer une seconde extraction sur l'échantillon en ajoutant 2 ml de la pré-équilibré à deux phases Bligh-Dyer phase inférieure (préparée comme dans l'étape 1.2) de la phase supérieure restante de l'étape 11. Vortex et centrifuger 10 min. Retirer phase inférieure et se combiner avec la phase inférieure de la première extraction.
13. Pour la phase inférieure commun (~ 4 ml de volume total), ajouter 7,6 ml de pré-équilibrée phase supérieure (étape 1.2), ce qui donne une solution à deux phases Bligh-Dyer (chloroforme: méthanol: eau; 2:2:1.8, v / v). Vortex et centrifuger pendant 10 min.
14. Retirez la phase inférieure dans un tube de verre propre et sécher avec un sèche-azote. Les échantillons séchés peuvent être conservés à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.

7. Visuation de ³² P marqué lipide A espèces par chromatographie sur couche mince

1. Préparer marqué au ^32P lipide A échantillon, TLC réservoir, et des plaques de CCM comme décrit dans les étapes 2.1 à 2.8.
2. Dissoudre ³² échantillon de P-marqué dans 500 ul de chloroforme-méthanol 04:01 (v / v). Vortex et bain de traitement par ultrasons pour dissoudre complètement la matière lipidique. Ajouter 5 ul d'échantillon de flacon à scintillation contenant 5 ml de cocktail de scintillation. Compter dans un compteur à scintillation et calculer totale coups / min de l'échantillon.
3. Lorsque la visualisation des espèces lipidiques radiomarqués, 10 x 20 cm ou 20 cm x 20 plaques de TLC peuvent être utilisés. Pour les plaques 10x20 cm, les échantillons doivent être repérés le long de l'origine marquée dans l'étape 2.5 de sorte que la plus grande dimension de la plaque est verticale (c.-à-échantillons repérés à l'origine marqués 2 cm au-dessus du bord de 10 cm).
4. En utilisant une pipette de micro-capillaire, repérer 10.000-20.000 cpm / échantillon sur la plaque et laisser sécher les gouttes (> 15 min). Les échantillons peuvent avoir besoin d'être concentré par séchage sousazote et remises en suspension dans un volume approprié, pour atteindre 10.000-20.000 coups / min / place (2 pi ou 2 pi à la fois pour <10 pi total).
5. Placer la plaque CCM contenant des échantillons radiomarqués dans le réservoir pré-équilibrée. Une fois devant solvant atteint le sommet de la plaque de CCM (~ 3 h), enlever la plaque et l'air sec (> 60 min). Attention: plaques de CCM exécuter en présence de pyridine doivent être soigneusement séchés dans une hotte chimique, comme des traces de pyridine peuvent abimer les écrans phosphorimaging. Un pistolet d'air froid peut être utilisé pour assurer siccité complète.
6. Enveloppez la plaque dans une pellicule plastique et exposer à l'écran Phosphorlmager dans une autoradiographie cassettes O / N. Le lendemain matin, balayer l'écran pour obtenir l'image (Figure 6). En utilisant un logiciel d'analyse d'image de densitométrie, cette méthode permet une exacte, la quantification relative des espèces lipidiques A.

Résultats

Canonical lipide A de E. coli et Salmonella enterica sérotype Typhimurium est un disaccharide hexa-acylés de la glucosamine avec des groupes de phosphate à 1 - et 4 'positions. Au cours de la croissance dans des milieux riches (par exemple Luria Broth) une partie du lipide A contient un groupe pyrophosphate en position 1 qui donne une espèce de tris-phosphorylée ³⁶ (figure 1). Kdo (3-désoxy-D-manno-octulosonique acide), est fixé à la 6&...

Discussion

Dans ce protocole, nous avons détaillé l'isolement des lipides Une espèce de cellules entières de bactéries, et décrit les méthodes d'analyse TLC ou MS pour caractériser chimiquement ce matériel isolé. Spectrométrie de masse tandem est une stratégie puissante pour de novo caractérisation structurale des composés biologiques, et est inestimable pour la caractérisation chimique de la panoplie de molécules lipidiques A observés dans la nature. CID et UVPD existe deux méthodes d'activa...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1