Isolierung und chemische Charakterisierung von Lipid A von gramnegativen Bakterien

Zusammenfassung

Isolierung und Charakterisierung der Lipid-A-Domäne von Lipopolysaccharid (LPS) von gramnegativen Bakterien gibt Einblick in Zelloberfläche basierend Mechanismen der Antibiotikaresistenz, bakterielle Überlebensrate und Fitness, und wie chemisch unterschiedlicher Lipid einer molekularen Spezies unterschiedlich modulieren Host angeborenen Immunantwort.

Zusammenfassung

Lipopolysaccharid (LPS) ist die Hauptzelloberflächenmolekül von gram-negativen Bakterien auf dem äußeren Blatt der äußeren Membran-Doppelschicht abgeschieden. LPS kann in drei Bereiche unterteilt werden: der distale O-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid und das Lipid A-Domäne, die aus einer Lipid-A-Molekularspezies und 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic Säurereste (Kdo). Die Lipid-A-Domäne ist die einzige Komponente, die für bakterielle Zellüberleben. Nach der Synthese wird Lipid A chemisch in Reaktion auf Umwelteinflüsse, wie pH oder Temperatur verändert, die Förderung von Resistenz gegen Antibiotika-Verbindungen und die Erkennung durch Mediatoren der Wirts angeborenen Immunantwort zu entziehen. Das folgende Protokoll beschreibt die kleinen und großen Isolierung von Lipid A aus gram-negative Bakterien. Isoliert Material wird dann chemisch durch Dünnschicht-Chromatographie (DC) oder Massenspektrometrie (MS) gekennzeichnet. Zusätzlich zur Matrix-unterstützte Laser-Desorptions / Ionisations-Zeit fLicht (MALDI-TOF) MS beschreiben wir auch Tandem-MS-Protokolle für die Analyse von Lipid einer molekularen Spezies mit Elektrospray-Ionisation (ESI), um eine Kollision induzierte Dissoziation (CID) gekoppelt ist und neu eingestellten UV-Photodissoziation (UV-PD)-Methoden. Unsere MS-Protokolle ermöglichen die eindeutige Bestimmung der chemischen Struktur, ausschlaggebend für die Charakterisierung der Lipid-A-Moleküle, die einzigartig oder neuartige chemische Modifikationen enthalten. Wir beschreiben auch die Radioisotop-Markierung, und die anschließende Isolierung von Lipid A aus Bakterienzellen für die Analyse durch TLC. Bezogen auf MS-basierte Protokolle bietet TLC eine wirtschaftlichere und schnelle Charakterisierung Verfahren, kann aber nicht verwendet werden, um eindeutig zuordnen Lipid eine chemische Strukturen ohne die Verwendung von Standards bekannter chemischer Struktur sein. In den letzten zwei Jahrzehnten Isolierung und Charakterisierung von Lipid A auf zahlreiche spannende Entdeckungen geführt, die unser Verständnis der Physiologie von gram-negativen Bakterien, die Mechanismen der Antibiotika-Widerstand verbessert habentung, die menschliche angeborene Immunantwort, und viele neue Ziele in der Entwicklung antibakterieller Verbindungen vorgesehen.

Einleitung

Lipopolysaccharid (LPS) der äußeren Hauptfläche Molekül fast allen gramnegativen Organismen und besteht aus drei molekularen Domänen: eine distale O-Antigen-Polysaccharid, ein Kern-Oligosaccharid, und die Membran-assoziierten Lipid A-Domäne auf dem äußeren Blatt der abgeschiedene Außenmembrandoppelschicht ^1,2. Die Lipid-A-Domäne besteht aus 3-Desoxy-D-manno-oct-2-ulosonic (Kdo) Resten und einer Lipid-A-Molekülspezies, wobei Lipid A kann als das Chloroform lösliche Teil von LPS bei milder Säurehydrolyse ¹ definiert ^{ist, 2.} Die Standard-Lipid-A-Molekül kann chemisch als diglucosamine Rückgrat, Hexa-acyliert und bisphosphoryliertes definiert werden, im Einklang mit den in den Modellorganismus Escherichia coli (E. coli) ^1,2 beobachtet Haupt Lipid A-Spezies. Neun konstitutiv exprimierte Gene, während gram-negative Bakterien konserviert ist, sind für die Herstellung von Lipid-A-Domäne (Fig. 1) ^1,2 verantwortlich. Die meisten Bakterien haben einen zusätzlichen Satz von Genen, die im Grad der phylogenetischen Konservierung variieren, die in weitere chemische Modifikation der ^Lipid-A-3 teilnehmen. Dephosphorylierung, Entfernen von Acylketten, und die Zugabe von chemischen Gruppierungen, wie Amino-Zucker (z. B. Aminoarabinose) und / oder Phosphoethanolamin sind die am häufigsten beobachteten Aktivitäten (1). Viele der Enzyme, die für Lipid A Modifikation verantwortlich sind, werden direkt durch Umweltsignale, wie zweiwertige Kationen aktiviert ist, oder deren Expression durch zwei Teilantwort-Regler-Systeme ³ geregelt.

Anerkennung von Lipid A-Arten durch den Host angeborene Immunsystem wird durch die Toll-like-Rezeptor-4/myeloid Differenzierungsfaktor 2 (TLR4/MD2) Co-Rezeptor ⁴ vermittelt. Hydrophobe Kräfte zwischen MD2 und der Lipid-A-Acyl-Ketten, sowie zwischen TLR4 und der 1 und 4 'Phosphatgruppen von Lipid A fördern die starke Assoziation der Lippeid A mit TLR4/MD2 ^4,5. Änderungen, die Acylierung Staat oder die negative Ladung der Lipid A Auswirkungen TLR4/MD2 basierend Lipid A verändern Anerkennung und nachgelagerten Stimulation der angeborenen Immunantwort Aktivatoren NF-kB und Entzündungsmediatoren wie TNF und IL1-β ^6,7. Änderungen, die die negative Ladung der Lipid A-Maske verhindern auch bakterizide kationische antimikrobielle Peptide aus der Bindung an gram-negative Zelloberflächen ^3,8. Viele Lipid A Änderungen Hypothese aufgestellt, um bakterielle Fitness unter bestimmten Umweltbedingungen, wie im menschlichen Wirt oder in einer ökologischen Nische zu erhöhen. Aus diesem Grund viele Modifikation Enzyme sind attraktive Ziele in der Rationalisierung der antimikrobielle Verbindungen. Die chemische Vielfalt der Lipid-A-Strukturen in Bezug auf Organismus und / oder Umwelt und der biologischen Auswirkungen dieser unterschiedlichen Strukturen machen die strukturelle Charakterisierung von Lipid A ein wichtiges Unterfangen in ter studieren gram-negativer Bakterien.

Isolierung von Lipid-A-Moleküle aus ganzen Bakterien umfasst die Extraktion von LPS aus der Bakterienzelloberfläche, einer hydrolytischen Schritt Lipid A zu befreien, gefolgt von einem abschließenden Reinigungsverfahren ^9-11. Die am häufigsten genannten LPS Extraktionsverfahren ist das heiße Wasser-Phenol-Extraktionsverfahren, die zuerst von Westphal und Jann ¹⁰ eingeführt. Nach Extraktion ganzen LPS ist mild-sauren Hydrolyse, die chemisch trennt Kdo von der 6'-Hydroxylgruppe des distalen Glucosamin-Zucker-Lipid A (Fig. 1) unterzogen. Zahlreiche Gefahren für die Warmwasserphenolverfahren einschließlich der Verwendung eines Hochrisiko-Reagens vorhanden ist, werden die Notwendigkeit der Zusammenarbeit extrahierten Nukleinsäuren und Proteinen und einigen Tagen abgebaut erforderlich, um das Protokoll ¹⁰ zu vervollständigen.

Unser Labor hat sich weiter die Extraktion und Isolierung von Lipid A entwickelt, wie zuerst von Caroff und Raetz ^12,13 entwickelt. Im Vergleich zu Heißwasserverfahren Phenol ist das hier vorgestellte Verfahren schneller und effizienter und bietet eine breite Palette von Kulturvolumen von 5 ml bis mehrere Liter. Darüber hinaus, im Gegensatz zu Warmwasser Phenol-Extraktionen, unsere Methode funktioniert nicht für grobe oder glatte Typen von LPS wählen, eine optimale Wiederherstellung der Lipid-A-Arten. In unserem Protokoll wird eine chemische Lyse ganzer Bakterienzellen unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Wasser, wo LPS kann durch Zentrifugation pelletiert werden. Eine Kombination von milder Säurehydrolyse und Lösemittelextraktion (Bligh-Dyer) werden verwendet, um Lipid A aus kovalent gebundenen Polysaccharids zu befreien. Das Verfahren von Bligh und Dyer wurde die Extraktion von Lipid-Spezies aus einer Vielzahl von Tier-und Pflanzengeweben ¹⁴ aufgebracht, hier modifiziert, um hydrolysierte Polysaccharid aus Lipid A. In diesem letzten Trennstufe zu trennen, Chloroform löslichen Lipide selektiv in die untere organische partitionieren Phase. Um weiter zu reinigen Lipid A, Umkehrphasen-oderAnionenaustausch-Säulenchromatographie verwendet werden ^12.

Nach der Isolierung von Lipid A-Spezies aus ganzen Zellen, kann eine Anzahl von analytischen Verfahren verwendet, um die chemische Struktur des isolierten Material, wie NMR, TLC und MS-basierte Analyse charakterisiert werden. NMR ermöglicht die zerstörungsfreie Strukturaufklärung und stellt strukturelle Details zu Glycosidbindungen, eindeutige Zuordnung von Acyl-Kettenpositionen und Zuordnung der Bindungsstellen für Lipid-A-Modifikationen wie Aminoarabinose oder Phosphoethanolamin ^15-17 zusammen. NMR-Analyse des Lipid A ist nicht in unserem Protokoll diskutiert, hat aber ausreichend anderswo ^15,16 beschrieben. Für die schnelle Analyse TLC basierte Methoden werden häufig verwendet, aber nicht, um direkte Informationen über die feinen chemischen Struktur zu schaffen. MS-basierte Protokolle sind die am häufigsten verwendete Methode zur Charakterisierung von Lipid-A-Strukturen ^18,19. Matrix zugeordnet Laserdesorptions-Ionisation (MALDI)-MS wird oft verwendet, um zunächst intakt überblicken Lipid A-Spezies. Einfach geladene Ionen von Analyten gemäß unserer Extraktionsverfahren hergestellt erzeugt. Da immer mehr Feinstrukturanalyse erforderlich ist, MS / MS-basierte Methoden beweisen, informativer als MALDI-MS. Gekoppelt Elektrospray Ionisation (ESI) einzeln oder mehrfach geladenen Lipid-A-Vorläufer-Ionen sind weitere Fragmentierung durch Kollision induzierte Dissoziation (CID) oder UV-Photodissoziation (UV-PD), strukturell informative Produkt-Ionen ^18,20,21 generieren. Neutralverlust Produkte von Lipid A-Vorläufer-Ionen werden häufig während ESI-MS erzeugt eine zusätzliche Schicht von Strukturinformationen.

Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) hat sich als notwendig und vielseitiges Verfahren zur Aufklärung der Lipid-A-Strukturen sein. Während MS / MS werden Ionen aktiviert wird, um eine Diagnosefragmentierungsmuster, die verwendet werden können, um die Struktur des Vorläuferionen aufzuklären ergeben. Die am weitesten AVAilable MS / MS-Methode ist CID. Dieses Verfahren erzeugt Fragment-Ionen durch Stöße der ausgewählten Vorläuferionen mit einem inerten Zielgas, was zu Energiedeposition, die zur Dissoziation führt. CID hat ein wichtiges Werkzeug bei der Zuordnung der Lipid A-Struktur für eine Vielzahl von Bakterienarten ^22-33 bewährt.

Obwohl CID ist die universell einsetzbar MS / MS-Verfahren, erzeugt es eine begrenzte Reihe von Produkt-Ionen. 193 nm UV-PD ist eine alternative und komplementäre MS / MS-Methode. Dieses Verfahren verwendet einen Laser, um Ionen zu bestrahlen, und die Absorption von Photonen führt Erregung der Ionen und anschließende Dissoziation. Diese höhere Energie MS / MS-Technik erzeugt eine Vielfalt von Produkt-Ionen als CID und bietet mehr informative Fragmentierungsmuster so. Insbesondere UV-PD bietet Informationen zu subtilen Veränderungen in der Lipid-A-Arten, basierend auf Spaltungen an glykosidischen, Amin-, Acyl-und CC-Bindungen verknüpft ^18,21,34.

Protokoll

Alle Lösungen sollten mit hochreinem Wasser für die HPLC und Methanol und Chloroform hergestellt werden. Hergestellten Lösungen, die organische Lösungsmittel, wie Methanol, Chloroform oder Pyridin, starke Säuren oder Basen enthalten sollte hergestellt und unter einem Abzug verwendet werden. Alle Lösungen können bei Raumtemperatur gelagert werden. Die Lösungsmittel sollten in abgestufter Glaszylinder gemessen und in Glasflaschen mit Lösungsmittel PTFE ausgekleidet gespeichert werden Kappen. Für die langfristige Lagerung Chloroform enthaltenden Lösungsmittel sollten in getönten Braunglasflaschen gelagert werden, um die Herstellung von Phosgen, einen stark reaktionsfähigen Säurechlorid zu vermeiden. PTFE-Zentrifugenröhrchen und am Rotationsverdampfer Kolben sollten mit Methanol und Chloroform vor der Verwendung gespült werden. Folgen notwendig Bundes-, Landes-und / oder institutionellen Abfallbeseitigungsvorschriften bei der Entsorgung von Lösungsmitteln und / oder radioaktiver Abfälle.

1. Large Scale Lipid A Extraktion (50 ml bis 1,5 l)

1. Bereiten Sie eine einphasige Bligh-Dyer Mischung: ChlorForm-Methanol-1X-phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4; 1:2:0.8 v / v). Kombinieren 200 ml Chloroform, 400 ml Methanol und 160 ml PBS in 1 l Lösungsmittelflasche. Cap-Flasche und mischen durch Inversion (> 30x). Lösen Sie die Kappe regelmäßig beim Mischen zu entlüften und speichern abgedichtet.
2. Bereiten Sie eine vorequilibriert Zwei-Phasen-Bligh-Dyer-Mischung Chloroform: Methanol: Wasser (2:2:1.8 v / v). Kombinieren 400 ml Chloroform, 400 ml Methanol und 180 ml Wasser in 1 l Lösungsmittelflasche. Cap-Flasche und mischen durch Umdrehen, achten Sie darauf, Kappe beim Mischen zu entlüften regelmäßig zu lockern. Lassen Sie ins Gleichgewicht O / N und speichern abgedichtet.
3. Bereiten Sie die milde Säurehydrolyse Puffer (50 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)). 500 ml milde Säurehydrolyse Puffer, wiegen 2,05 g Natriumacetat und in einen 500-ml-Becherglas. Fügen Sie Wasser auf ein Volumen von ~ 350 ml und umrühren, dann fügen Sie 50 ml 10% SDS. Mischen und pH-Wert auf 4,5, Transfer in ein Messzylinder, und Wasser bis zu 500 ml.
4. VorbereitenChloroform: Methanol (4:1, v / v): Messen Sie 100 ml Chloroform und Transfer zu Flasche Lösungsmittel. Messen Sie 25 ml Methanol und mit Chloroform zu mischen. Lagerung in Braunglasflasche.
5. Impfen 5 ml Medium (Luria-Brühe oder andere) von einem einzigen Bakterienkolonie. Wachsen O / N bei 37 ° C oder bei ° C für das Wachstum benötigt. Ein Diagramm des Extraktionsverfahrens wird in Fig. 2 gezeigt.
6. Am nächsten Tag messen die OD ₆₀₀ mit der 5 ml O / N-Kultur zu 200 ml der Kultur auf eine Ausgangs-OD ₆₀₀ von 0,05 zu inokulieren. Zellen wachsen, bis eine OD ₆₀₀ von 0,8-1,0 erreicht ist.
7. Ernten der Zellen mittels Zentrifugation bei 10.000 × g für 10 min. Längere spinnt kann für die Stämme, die schlecht zu pelletieren erforderlich. Medienüberstand abgießen.
8. Waschen Zellpellet mit 50 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Wiederholen der Zentrifugation Zellen zu pelletieren. Überstand abgießen und speichern Zellpellet bei -20 ° C, oder gehen Sie zu Schritt 1.9.
9. Die Zellen in 40 ml1x PBS und Aufteilung in zwei 250 ml-Zentrifugenröhrchen PTFE (ergibt 20 ml Zellsuspension / Röhrchen). 25 ml Chloroform und 50 ml Methanol zu jedem Röhrchen, für eine einzelne Phase Bligh-Dyer (Chloroform: Methanol: Wasser; 1:2:0.8 v / v) (Abbildung 2). Durch Umdrehen mischen und Inkubation bei RT> 20 min, um eine vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten.
10. Zentrifugieren der Mischung bei 2.000 × g für 20 min. LPS wird pelle zusammen mit Proteinen und Nukleinsäuren (Abb. 2), allerdings werden Phospholipide, Isoprenyl Lipide und kleine hydrophobe Peptide im Überstand verbleiben. Überstand verwerfen.
11. Mit ~ 100 ml Einphasen Bligh-Dyer Mischung Waschen Sie die LPS-Pellet. Zentrifugation bei 2.000 × g für 20 min. Überstand verwerfen. Bei der Isolierung von Lipid A von E. coli oder Salmonella ist nur ein Wasch erforderlich, jedoch zusätzliche Waschschritte erforderlich, um Phospholipid-Kontamination zu reduzieren, wenn die Isolierung Lipid A von einigen Organismen werden.
12. In 27 ml mild saure Hydrolyse-Puffer (50 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS, siehe Schritt 1.3) auf LPS-Pellet und mischen durch Pipettieren auf und ab, bis nur noch kleine Partikel bleiben. Ultraschallbad homogen suspendieren LPS-Pellet in Lösung mit Sondenspitze Ultraschallgerät mit einer konstanten Arbeitszyklus für 20 Sekunden bei 50% Leistung. Wiederholen Beschallung von Proben 2x (20 sec / platzen, ~ 5 Sek. zwischen Bursts).
13. Sieden Proben in einem Wasserbad für 30 min. Achtung: Stellen Sie sicher, dass die Kappen sind eng, aber nicht vollständig abgedichtet. Einige Organismen, wie Vibrio cholerae (V. cholerae) erfordern längere Inkubationszeiten (1 Std.), um die Gesamtrendite von Lipid A erhöhen Flaschen entfernen Wasserbad und lassen Probe auf RT abkühlen, bevor Sie fortfahren.
14. Lipide nach der Hydrolyse zu extrahieren, wandeln die SDS-Lösung in einem Zweiphasen Bligh-Dyer (2)-Mischung durch Zugabe von 30 ml Chloroform und 30 ml Methanol bei einer Chloroform: Methanol: Wasser (2:2:1.8, v / v)-Mischung. Mischen durch Umkehrung und Zentrifugieren der Probe für 10 min bei 2000 x g. Entpacken Sie die untere Phase in einen sauberen PTFE-Zentrifugenröhrchen mit einer Glaspipette.
15. Führen Sie eine zweite Extraktion durch Zugabe von 30 ml Unterphase aus einem vorequilibriert Zwei-Phasen-Bligh-Dyer-Gemisch (Schritt 1.2), an der oberen Phase aus Schritt 1.14. Mix, dann zentrifugieren bei 2.000 g für 10 min. Entpacken Sie die untere Phase und bündeln mit dem in Schritt 1.14 extrahiert untere Phase.
16. Waschen Sie die gepoolten unteren Phasen (insgesamt 60 ml) durch Zugabe von 114 ml vorequilibriert zwei Phase Bligh-Dyer obere Phase (Schritt 1.2), um eine Zwei-Phasen-Bligh-Dyer Gemisch (Chloroform erstellen: Methanol: Wasser; 02.02 Uhr: 1,8, v / v). Mischen. Zentrifugation bei 2.000 × g für 10 min.
17. Entfernen Sie die untere Phase in ein sauberes Glas Rotationsverdampferkolben und trockene Probe mittels Rotationsverdampfung (Abbildung 2).
18. 5 ml Chloroform: Methanol (4:1, v / v) mit dem Drehkolben und Bad-Ultraschallaufschluß (> 30 s), die in der Lipid-Suspension von den Seiten des Kolbens zu unterstützen. Verwenden Sie ein Glas Transferpipette Lipid zu einem sauberen übertragenGlasrohr (13 x 100 mm oder größer) mit PTFE ausgekleidet bedeckten Phenol Schraubverschlüsse. Trockenprobe unter einem Strom von Stickstoff unter Verwendung eines Stickstoff-Trockner.
19. Resuspendieren getrocknete Lipid in 1 ml Chloroform: Methanol (4:1, v / v). Transfer zum kleinen Glasprobenfläschchen (12 x 32 mm) mit einer konischen Basis für weitere quantitative Aufwirbelung mit kleinen Volumina (siehe Tabelle der Ausrüstung / Reagenzien). Trocknen Sie mit einem Stickstoff-Trockner.
20. Getrocknete Probe kann bei -20 ° C bis nachfolgende TLC (Protokoll 2) oder MS-Analyse (Protokoll Nr. 3, 4, oder 5) gespeichert werden. (Hinweis: Die Anzahl der Material isoliert und in den folgenden Protokolle verwendet wird, basiert auf, was für die meisten Organismen vorgeschlagen Das gleiche Lipidprobe kann in den Protokollen 5.2 verwendet werden, zur Kenntnis% Material entfernt Siehe Diskussion für weitere Details...).

2. Visualisierung von Lipid A Spezies über Dünnschicht-Chromatographie

1. Bereiten Sie die mobile Phase TLC Lösungsmittelsystem (Chloroform: Pyridin: 88% Ameisensäure: Wasser; 50:50:16:5 v / v). CombinE 200 ml Chloroform, 200 ml Pyridin, 64 ml 88% Ameisensäure und 20 ml Wasser in einem 1 l Lösungsmittelflasche. Cap-Flasche, mischen durch Umdrehen mehrfach und zu entlüften.
2. Verwenden Sie eine DC-Tank, 20 x 20 cm-Platten beherbergen wird. Linie TLC Tank mit ~ 40 cm Papier-Chromatographie.
3. Um TLC Tank 200 ml Chloroform: Pyridin: 88% Ameisensäure: Wasser (50:50:16:5, v / v) Mischung. Ermöglichen Tank vor äquilibrieren> 3 h, oft O / N ist bevorzugt und bequemer.
4. Entfernen Sie getrocknete Lipidproben aus dem Gefrierschrank (Schritt 1.20) und ließ auf RT erwärmen.
5. Mit einer Rasierklinge zu entfernen das Siliciumdioxid von der oberen Kante einer Silicagel-60-TLC-Platte. Mit einem stumpfen Bleistift, ziehen Sie eine Linie parallel zum Boden der Platte, 2 cm von der Unterseite. Diese Linie ist der Ursprung für die Erkennung von Proben. Mark erhöht entlang dieser Bezugslinie, um Proben von 1 cm zueinander erkennen.
6. Auflösen getrockneten Lipid aus Schritt 2.4 in 200 ul Chloroform: Methanol (4:1, v / v), Wirbel und beschallen (3x, jeweils ~ 15 sec), Ausbeute ~ 100 -500 ng / ul Lipid A, wenn aus E. extrahiert coli.
7. Verwendung einer Mikrokapillare Glaspipette, Spot ein Zehntel des Volumens (20 &mgr; l) auf die DC-Platte, wie in Schritt 2.5 markiert. Werden die Proben an der Luft trocknen auf DC-Platte für ~ 15 min. (Anmerkung: Die Proben in kleinen Glasfläschchen kann mit einem Stickstoff-Trockner getrocknet und bei -20 ° C für die spätere Verwendung in Protokollen gespeichert werden 3-5 Beachten% Material entfernt.).
8. Zeigen TLC-Platte, die in den Proben entdeckt vorequilibriert Tank. Nach Lösungsmittelfront die Oberkante der DC-Platte (~ 2,5-3 h) erreicht, entfernen Sie die Platte und an der Luft trocknen (> 60 min). Ein Kaltluftgebläse verwendet werden, um eine vollkommenere Trockenheit zu gewährleisten.
9. Während Platte Trocknen, schalten Sie heißen Platte bei 250 ° C für die Verkohlung.
10. In einem belüfteten Laborabzug, bereiten 10% iger Schwefelsäure-Ethanol-Gemisch für Verkohlung Lipide auf der DC-Platte Kieselgel gelöst (konzentrierte Schwefelsäure: 100% Ethanol, 1.09 v / v). Messung 10 ml Schwefelsäure und füge langsam zu 90 ml von 100% Ethanol. Pflegevollständig zu mischen und in ein Glas chromatographische Reagenz Zerstäuber.
11. In der Dunstabzugshaube, mit einem Glas chromatographische Reagenz Zerstäuber, die getrocknete DC-Platte mit 10% Schwefelsäure-Ethanol-Gemisch besprühen. Spray Mischung gleichmäßig über die Platte.
12. Legen Sie die DC-Platte auf der 250 ° C heißen Platte bis verkohlt Lipidproben schwarz / braune Flecken (<1 min) angezeigt. Die Platte überbelichten Sie nicht, da dies dazu führen, die gesamte Platte, um braun zu machen und Visualisierung von Lipid-A-Arten schwierig.

3. Strukturcharakterisierung von Lipid A über MALDI-TOF-Massenspektrometrie

1. Von Schritt 1.20 (oder Schritt 2.7) entfernen Lipid-A-Probe aus dem Gefrierschrank und auf RT erwärmen. Resuspendieren getrockneten Lipid einer Probe in ~ 20 ul Chloroform: Methanol (4:1, v / v) und einen Wirbel ~ 1-5 &mgr; g / &mgr; l Lipid eine Lösung zu erhalten, wenn aus E. extrahiert coli. (Anmerkung: 10% weniger konzentriert, wenn Material von Schritt 2.7 verwendet wird).
2. Bereiten ATT Matrixkomponenten. Gesättigte 6-Aza-2-thiothymin in 50% Acetonitril: in 500 ul Wasser und 500 ul Acetonitril in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, und fügen> 10 mg 6-Aza-2-thiothymin so dass die 50% Acetonitril ist übersättigt. Gesättigte tribasisches Ammonium-Citrat-Lösung: Fügen> 1 mg bis 500 ul Wasser, ausfallen sollte leicht zu erkennen sein. Vortex-Zentrifuge und Lösungen vor Gebrauch, nur gesättigte Überstand verwendet.
3. Vorbereitung ATT Matrixmischung: gesättigte 6-Aza-2-thiothymin in 50% Acetonitril, gesättigten dreibasisches Ammoniumcitrat (20:1, v / v). Mix Matrixkomponenten zusammen durch Zugabe von 20 ul ATT Lösung 1 ul gesättigten tribasisches Ammonium-Citrat-Lösung in 500 ul-Mikrozentrifugenröhrchen, Vortex mischen und zentrifugieren, bevor es auf MALDI-Platte.
4. Bereiten MALDI-Platte durch Zugabe von 0,5 ul Eich Mischung auf der MALDI-Platte auf einem Platz in der Nähe, wo die Proben aufgebracht werden, um die genaue Masse / Ladungsverhältnis Entscheidung trifft.
5. Kaution 0,5 ulvon ATT Matrix auf MALDI-Platte auf jeder Stelle, an der Lipid A-Probe aufgebracht werden.
6. Kaution 0,5 ul Probe (2,5% der Gesamtstichprobe) auf die Stelle des ATT-Matrix, um auf Platte zu mischen und zu erwerben Spektren durch Scannen Probe für optimale Ionensignale (Abbildung 3). Hinweis: Die Beträge für das optimale Signal kann mit MS Organismus variieren und müssen empirisch ermittelt werden. Um mehr Material hinzufügen, man kann 0,5 ul mehrfach so entdeckt Mischung zwischen Zugabe von mehr Probe trocknen erkennen. Probe können auch (in einem kleineren Volumen trocken und resuspendieren) konzentriert oder falls erforderlich, verdünnt werden. Ausgangsmaterial mehr (Volumen der Ausgangszellkultur) können ebenfalls verwendet werden (siehe Diskussion).

4. Elektrospray-Massenspektrometrie und durch Kollision herbeigeführte Dissoziation von Lipid A

1. Bereiten Sie eine Chloroform: Methanol-Lösungsmittelgemisch (1:1, v / v), indem man eine 200 ul Lager von HPLC-Qualität mit 200 ml Methanol für die HPLC Chloroform in einem Glas-SolEntlüftungsflasche.
2. Bringen Sie 200 ul der Chloroform: Methanol-Lösungsmittelgemisch in das Fläschchen mit Lipid A (z. B. von Schritt 1.20, 2.7, oder nach dem Protokoll Nr. 3 getrocknet) und beschallen die Lipid eine Lösung für 5 min oder bis alle gelöst ist.
3. Stellen Sie das Massenspektrometer zur negativen Modus Elektrospray-Ionisation.
4. Verwendung einer 250 &mgr; l-Spritze und einer Spritzenpumpe direkt infundiert die verdünnte Lipid einer Probe bei einer Fließgeschwindigkeit von 2,0-3,5 ml / min.
5. Optimieren und verbessern die Lipid-A-Ionensignal durch Abstimmen der Ionenoptik. Eine volle Massenspektrum kann nun der Lipid A-Spezies (Fig. 4) gesammelt werden.
6. Isolieren und aktivieren Sie die Ziel Lipid A, indem Sie als CID MS / MS-Methode.
7. Erhöhen Sie die CID-Spannung (oder normalisierten Kollisionsenergie, NCE), bis der Vorläufer Lipid im Vergleich zu den höchsten Produkt-Ionen-A Arten ist etwa 10% relative Häufigkeit.
8. Erwerben und mittlere Spektren, bis ausreichend Signal-zu-Rauschen für th erreichte Produkt-Ionen. Die Anzahl von Abtastungen erforderlich ist abhängig von der Signalintensität des ursprünglichen Vorläufers und kann 3 bis 300 Abtastungen (5A) liegen.

5. MS / MS auf Lipid A durch UV-Photodissoziation

1. Probe vorzubereiten und Massenspektrometer Schritte 4.1-4.5.
2. Einschalten des Lasers, um das Massenspektrometer angeschlossen. Das Massenspektrometer wurde mit einem 193-nm-Excimer-Laser ausgestattet und modifiziert, um UV-Aktivierung in der HCD-Zelle des Instruments zu ermöglichen. Photodissoziation wurde in einer Weise ähnlich der oben beschriebenen ³⁵ ausgeführt. Wir verwenden eine modifizierte Vakuumverteiler mit einer _CaF2 optische Fenster Photonen in die höhere Energie-C-Trap-Dissoziation (HCD)-Zelle übertragen. Der Laser wird während der MS / MS durch eine Transistor-Transistor-Logik (TTL)-Signal von Massenspektrometer mit einem Puls / Verzögerungsgenerator ausgelöst.
3. Richten Sie die Geräte-Software, so dass der Laser den Excimer-Laser auszulösen, wenn derIonen in die Zelle HCD. Dies erfordert eine leichte Modifizierung der Software.
4. Einschalten des Impulsgenerators derart, dass der Laser wird alle 2 ms (500 Hz) gepulst.
5. Isolieren Sie die Lipid-A-Vorläuferionen indem Sie HCD als MS / MS-Verfahren und stellen Sie die Kollisionsenergie auf 1% NCE. Dies ermöglicht die Isolierung von Vorläuferionen für UV-Dissoziation in der HCD-Zelle. Obwohl die HCD Zelle verwendet wird, wird die Software modifiziert, um UV-PD während dieses Intervalls durchzuführen.
6. Aktiviere die isolierten Lipid A-Ionen durch Erhöhung der Laserenergie und zum Einstellen der Anzahl der Laserimpulse. Eine typische UV-PD-Experiment wird durchgeführt unter Verwendung von zehn 6 ml Impulse werden.
7. Wie in Schritt 4.8, erwerben und Durchschnittsspektren, bis ausreichendes Signal-Rausch-Verhältnis wird für die UV-PD Produkt-Ionen erreicht. Die Anzahl von Abtastungen erforderlich ist abhängig von der Signalintensität des ursprünglichen Vorläufers und kann 3 bis 300 Abtastungen (5B) liegen.

6. ^32P-Labelingvon Lipid A und anschließende Isolierung

1. Impfen 5 ml Medium (Luria-Brühe oder andere Medien) von einer einzigen Kolonie. Wachsen O / N bei 37 ° C oder auf die gewünschte Temperatur.
2. Am nächsten Tag, messen Sie die OD ₆₀₀ und verwenden Sie den O / N-Kultur zu 7 ml Kultur bis zu einer Ausgangs-OD ₆₀₀ von ~ 0,05, in einem Standard 20 x 150 mm Einwegglaskulturröhrchen gewachsen zu impfen. In 2,5 Ci / ml anorganischer ³² P. Zellen wachsen, bis eine OD ₆₀₀ von 0,8-1,0 erreicht ist. Bitte folgen Bundes-, Landes-und / oder institutionellen Richtlinien für den sicheren und ordnungsgemäßen Umgang mit radioaktiven Stoffen.
3. Ernten Sie die Zellen in 16 x 125 mm Glaszentrifugenröhrchen mit PTFE ausgekleideten Deckel mit einem festen Winkel klinischen Zentrifuge bei 1500 g für 10 min. Überstand entfernen zu geeigneten radioaktiven Abfallbehälter. Alle radioaktiver Abfälle (z. B. flüssig, Glas, Biohazard) in nachfolgenden Schritten erzeugt sollte im Einklang mit Bundes-, Landes entsorgt werden, und / oder institutionelle guinien.
4. Waschen Zellpellet mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Zentrifuge für 10 min bei 1.500 x g. Überstand verwerfen.
5. Die Zellen in 5 ml Einphasen Bligh-Dyer-Gemisch (Abbildung 2), bestehend aus Chloroform: Methanol: Wasser (1:2:0.8, v / v). Vortex zu mischen, und Inkubation bei RT für> 20 Minuten, um eine vollständige Lyse der Zellen zu gewährleisten.
6. Zentrifuge in klinischen Zentrifuge bei 1500 × g für 20 min. Vorsichtig abgießen Überstand, der Phospholipide und Isoprenyl Lipide enthält.
7. Resuspendieren des Pellets LPS in 1,8 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1% SDS-Puffer durch Vortexen. Ultraschallbad Probe mit Hilfe eines Ultraschallbad bis Pellet wird gleichmäßig verteilt (~ 30 sec).
8. Inkubieren Probe für 30 min in kochendes Wasserbad. Stellen Sie sicher, Kappen sind eng, aber nicht verschlossen.
9. Vom Wasserbad nehmen und lassen Probe bei RT für 5-10 min abkühlen.
10. Die Lösung umzuwandeln in ein Zweiphasen Bligh-Dyer-Gemisch durch Zugabe von 2 ml Chloroform und 2 mlMethanol, was zu einer Chloroform: Methanol: wässriges (2:2:1.8 v / v)-Mischung. Vortex mischen und Zentrifuge für 10 min in klinischen Zentrifuge bei 1.500 xg separate Phasen.
11. Entpacken Sie die untere Phase in ein sauberes Glas Zentrifugenröhrchen mit einer Glaspipette (erste Extraktion).
12. Durchführen einer zweiten Extraktion der Probe durch Zugabe von 2 ml voräquilibriert zweiphasigen Bligh-Dyer untere Phase (hergestellt wie in Schritt 1.2) an die verbleibende obere Phase aus Schritt 11. Vortex und Zentrifuge 10 min. Entfernen untere Phase und verbinden sich mit der unteren Phase aus der ersten Extraktion.
13. 2:2:1.8, v, Wasser: Um der gepoolten untere Phase (~ 4 ml Gesamtvolumen), fügen Sie 7,6 ml vorequilibriert obere Phase (Schritt 1.2), was eine Zwei-Phasen-Bligh-Dyer-Lösung (Chloroform: Methanol / v). Vortex und Zentrifuge für 10 min.
14. Entfernen Sie die untere Phase in ein sauberes Glasröhrchen und trocken mit einem Stickstoff-Trockner. Getrocknete Proben können bei -20 ° C bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.

7. Visualisierungrung von ³² P-markierten Lipid A Spezies über Dünnschichtchromatographie

1. Vorbereitung ³² P-markierten Lipid einer Probe, TLC Tank und TLC-Platten wie in den Schritten 2.1-2.8 beschrieben.
2. Man löst ³² P-markierten Probe in 500 &mgr; l von 4:1 Chloroform-Methanol (v / v). Vortex und Bad beschallen zu Lipid-Material vollständig zu lösen. Mit 5 &mgr; l Probe in Szintillationsfläschchen mit 5 ml Scintillationscocktail. Graf in Szintillationszähler und berechnen die Gesamtaktivität / min Probe.
3. Bei der Visualisierung von radiomarkierten Lipidspezies, können 10 x 20 cm oder 20 x 20 cm TLC-Platten verwendet werden. Für 10x20-cm-Platten, sollten die Proben entlang der Herkunft in Schritt 2.5 gesichtet markiert werden, so dass die Platten längste vertikale Dimension ist (dh Proben mit Herkunft gesichtet markiert 2 cm über dem Rand 10 cm).
4. Mit einer Pipette Mikrokapillar, vor Ort 10.000-20.000 cpm / Probe auf der Platte und lassen Flecken trocknen (> 15 min). Die Proben müssen möglicherweise durch Trocknen unter konzentriert werdenStickstoff und in einem geeigneten Volumen resuspendiert, auf 10.000-20.000 counts / min / Fleck (2 ul ul oder 2 zu einem Zeitpunkt für <10 ul Gesamt) zu erreichen.
5. Platzieren TLC-Platte, die radioaktiv markierte Proben in der voräquilibriert Tank. Nach Lösungsmittelfront die Oberkante der DC-Platte (~ 3 h) erreicht, entfernen Sie die Platte und an der Luft trocknen (> 60 min). Achtung: DC-Platten in Gegenwart von Pyridin laufen muss gründlich in einer chemischen Abzugshaube getrocknet werden, da Spuren von Pyridin Phosphorimaging Bildschirme beschädigen. Ein Kaltluftgebläse verwendet werden, um eine vollkommenere Trockenheit zu gewährleisten.
6. Wickeln Sie die Platte in Plastikfolie und aussetzen Phosphorbildschirm in einer Autoradiographie-Kassette O / N. Am nächsten Morgen, scannen Sie den Bildschirm, um das Bild (Abbildung 6) zu erhalten. Densitometrie unter Verwendung von Bildanalysesoftware ermöglicht dieses Verfahren eine genaue relative Quantifizierung der Lipid A-Spezies.

Ergebnisse

Canonical Lipid A von E. coli und Salmonella enterica Serovar Typhimurium ist ein Hexa-acylierte Glucosamin-Disaccharid mit Phosphatgruppen an der 1 - und 4 "-Positionen. Während des Wachstums in reichen Medien (z. B. Luria Broth) ein Teil des Lipid-A enthält eine Pyrophosphat-Gruppe an der 1-Position ergibt ein Tris-phosphorylierten Spezies ³⁶ (Fig. 1). KDO-(3-Desoxy-D-manno-octulosonsäure), befestigt an der 6'-Hydroxylgruppe und bilde...

Diskussion

In diesem Protokoll haben wir die Isolierung von Lipid-A-Arten aus ganzen Zellen von Bakterien beschrieben und beschrieben TLC oder MS auf Basis analytischer Methoden, um dieses isolierte Material chemisch zu charakterisieren. Tandem-Massenspektrometrie ist eine wirkungsvolle Strategie für die de novo Strukturaufklärung von biologischen Verbindungen und ist von unschätzbarem Wert für die chemische Charakterisierung der Palette der Lipid in der Natur beobachtet A-Moleküle. CID und UV-PD sind zwei sich ergä...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1