그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

요약

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

초록

지질 다당류 (LPS)는 외막 이중층의 외부 전단지에 증착 그람 음성 박테리아의 주요 세포 표면 분자이다. LPS는 세 개의 도메인으로 분할 될 수있다 : 원심 O-다당류, 코어 올리고당 및 지질 지질로 이루어진 도메인 분자 종 및 3 - 데 옥시-D-Manno의-옥트 -2 - ulosonic 잔기 (KDO). 지질 도메인은 세균 세포의 생존에 필수적인 유일한 구성 요소입니다. 그 합성에 이어 지질 화학적 항생제 화합물에 대한 내성을 증진하기 위해, 그리고 호스트 선천성 면역 반응의 매개체하여 인식을 회피하기 위해, 그러한의 pH 나 온도 등의 환경 스트레스에 대응하여 수정된다. 다음 프로토콜은 그람 음성 세균으로부터의 지질의 소규모 및 대규모 분리 세부. 절연 물질은 화학적 후 박층 크로마토 그래피 (T​​LC) 또는 질량 분광법 (MS)에 의해 특징된다. 또한에 F의 레이저 탈착 / 이온화 타임 매트릭스 지원빛 (MALDI-TOF) MS는, 우리는 또한 충돌 유발 분해 (CID)에 연결된 전자 분무 이온화 (ESI) 및 새로 채용 자외선 광분해 (UVPD) 방법을 사용하여 지질에게 분자 종을 분석 탠덤 MS의 프로토콜을 설명합니다. 우리의 MS 프로토콜은 고유 또는 새로운 화학 수정을 포함하는 지질 분자의 특성에 가장 중요한, 화학 구조의 명백한 결정을 위해 수 있습니다. 우리는 또한 TLC로 분석 박테리아 세포에서 지질의 방사성 동위 원소 표지, 이후 격리를 설명합니다. MS-기반 프로토콜에 상대적 TLC는보다 경제적이고 신속한 특성화 방법을 제공하지만, 명백하게 알려진 화학 구조의 표준을 사용하지 않고 화학 구조 지질을 할당 할 수 없다. 지난 20 년간 지질의 분리 및 특성은 그람 음성 세균, 항생제 RESIS의 메커니즘의 생리에 대한 우리의 이해를 향상하는 많은 흥미로운 발견되었다tance, 인간의 타고난 면역 반응 및 항균 화합물의 개발에 많은 새로운 목표를 제공하고 있습니다.

서문

지질 다당류 (LPS)는 거의 모든 그람 음성균의 주요 외부 표면 분자이며 세 분자 도메인으로 구성 원위 O-항원 다당류, 코어 올리고당, 및 막 - 관련 지질의 외측 전단지에 증착 도메인 외막 이중층 ^1,2. 지질 도메인은 ^지질이 약한 산 가수 분해 ^1시 LPS의 클로로포름 가용 부분으로 정의 할 수 있습니다 3 - 데 옥시-D-Manno의 10 월 2 ulosonic (KDO) 잔류 물과 지질 분자 종으로 구성 ^2. 모델 생물 대장균 (E. 콜라이) ^1,2 관찰 주요 지질 종과 일치; 표준 지질 분자는 화학적 헥사 아 실화 및 비스 - 인산화 diglucosamine 백본으로 정의 될 수있다. 그람 음성 박테리아에 걸쳐 보존 나인 구조적으로 표현 된 유전자는 지질의 생산 도메인 (그림 1) ^{1, 2에} 대한 책임이 있습니다. 대부분의 박테리아는 지질 ^3의 추가 화학적 변형에 참여 계통 보호의 정도에 차이가 유전자의 추가 집합을 보유하고 있습니다. 탈 인산화, 아실 사슬의 제거와 같은 아미노 당 (예 aminoarabinose) 및 / 또는 phosphoethanolamine 화학적 잔기의 첨가는 일반적으로 관찰 활동 (도 1)이다. 지질 변형에 대해 책임 효소의 많은 직접적 가의 양이온 등의 환경 신호에 의해 활성화되고, 또는 그 발현이 성분 응답 레귤레이터 시스템 ^(3)에 의해 규제된다.

호스트 타고난 면역 시스템에 의해 지질 종의 인식은 수신자 같은 수용체 4/myeloid 분화 인자 2 (TLR4/MD2) 공동 수용체 ^(4)에 의해 매개된다. MD2와 지질 아실 체인뿐만 아니라 TLR4 및 지질의 1 및 4 '인산기 립의 강한 연관을 촉진 간의 소수성 세력TLR4/MD2 ^4,5와 아이디. 실화 상태 또는 지질의 음전하 영향 TLR4/MD2 기반 지질을 변경 수정은 인식과 타고난 면역 반응의 하류 자극은 NF-κB와 같은 TNFα와 IL1-β ^6,7와 같은 염증 매개 활성제. 지질의 음전하 마스크 수정은 세포 표면 ^3,8를 음성에게 그램 바인딩에서 살균 양이온 항균 펩타이드를 방지합니다. 많은 지질의 수정은 이러한 인간의 호스트 내부 또는 생태 학적 틈새 시장과 같은 특정 환경 조건에서 세균의 체력을 증가하는 가정합니다. 이러한 이유로 많은 수정 효소는 항균 화합물의 합리적인 개발에 매력적인 대상입니다. 지질 구조체의 화학적 다양성, 유기체 및 / 또는 환경, 이러한 다양한 구조의 생물학적 영향에 대하여 지질의 구조적 특성화 t에서 중요한 노력을하게그는 그람 음성 박테리아의 연구.

전체 박테리아 지질 분자의 분리는 최종 정제 절차 ^{9-11이어서} 세균 세포 표면으로부터 LPS의 추출, 지질을 해방하는 가수 분해 단계를 포함한다. 가장 자주 인용 LPS 추출 절차는 첫 번째 웨스트 팔과 쟌 ^(10)에 의해 도입, 핫 페놀 물 추출 절차입니다. 추출 전체 LPS는 화학적으로 지질의 말단 글루코사민 설탕 (그림 1)의 6'-히드 록에서 KDO을 분리 약한 산 가수 분해를 받게되면. 수많은 함정 높은 위험 시약의 사용 등 핫 페놀 물 절차 존재 공동 추출한 핵산 및 단백질, 며칠을 분해 할 필요가 프로토콜 ^(10)을 완성해야한다.

첫 번째 Caroff 및 Raetz ^{(12, 13)에} 의해 개발 된 우리의 실험실은 또한 지질의 추출 및 분리를 개발했습니다. 핫 페놀 물 절차에 비해, 여기에서 제시된 방법은보다 신속하고 효율적이며 5 ㎖에서 체류 리터 배양 부피의 넓은 범위를 수용한다. 또한, 핫 페놀 물 추출과는 달리, 우리의 방법은 지질 종의 최적의 복구를 제공, LPS의 거친 또는 부드러운 유형을 선택하지 않습니다. 우리의 프로토콜에서, 전체 박테리아 세포의 화학적 용해는 LPS는 원심 분리에 의해 펠릿 화 될 수 클로로포름, 메탄올 및 물을 혼합하여 수행된다. 약한 산 가수 분해 및 용매 추출 (Bligh 고 - 다이어)의 조합은 공유 연결된 다당류에서 지질을 해방하는 데 사용됩니다. Bligh 고 및 다이어의 방법은 제 ^14의 조직은, 동물 및 식물의 다양한 지질 종의 추출에 적용이 최종 분리 단계 지질 A.에서 가수 분해 된 폴리 사카 라이드를 분리하는 여기 변성시키고, 클로로포름에 용해 지질 선택적 하부 유기적으로 분할 상. 또한, 지질를 정화하는 역상 또는음이온 교환 칼럼 크로마토 그래피 ^(12)를 사용할 수있다.

전체 세포에서 지질 종의 분리 후, 분석 방법의 수는 NMR, TLC 및 MS-기반 분석과 같은 절연 물질의 화학 구조를 특성화하기 위해 사용될 수있다. NMR은 비파괴 구조 규명이 가능하고, 글리코 시드 결합, 아실 체인 위치의 명백한 할당, aminoarabinose 또는 phosphoethanolamine ^15-17와 같은 지질 수정에 대한 첨부 파일 사이트의 할당과 관련된 구조적인 세부 사항을 제공합니다. 지질의 NMR 분석은 우리의 프로토콜 내에서 설명되지 않지만, 그 밖에 ^15,16 충분히 설명되었다. 신속한 분석을 위해 TLC 방법이 자주 사용하는 기반으로하지만, 정밀 화학 구조에 대한 직접적인 정보를 제공하기 위해 실패합니다. MS 기반 프로토콜은 지질 구조 ^{(18, 19)의 특징을} 가장 자주 사용되는 방법이다. 매트릭스 연관된 레이저 탈착 이온화 (MALDI)-MS는 종종 처음 그대로 지질 종을 조사하는 데 사용됩니다. 단독으로 하전 된 이온을 분석 우리의 추출 절차에 따라 제조에서 생성됩니다. 더 미세 구조 분석이 요구되기 때문에, MS / MS 기반의 방법은 MALDI-MS보다 더 많은 정보를 증명한다. 구조적으로 정보를 제품의 이온 ^18,20,21를 생성하기 위해, (ESI) 전구체 이온이 충돌 유발 분해 (CID) 또는 자외선 광분해 (UVPD)에 의해 더 조각난 단일 또는 다중 충전 지질 이온화 전기 분무에 결합. 전구체 이온으로부터 중성 지질 감소 제품도 종종 구조 정보의 부가 층을 제공하는 ESI-MS 동안 생성된다.

탠덤 질량 분석 (MS / MS)의 지질 구조의 해명을위한 필수 불가결하고 다양한 방법으로 입증되었습니다. MS / MS 동안, 이온은 이온 전구체의 구조를 설명하기 위하여 사용될 수있는 진단 조각화 패턴을 수득하기 위해 활성화된다. 가장 널리 AVAilable MS / MS 방법은 CID입니다. 이 방법은 해리 리드 에너지 증착의 결과로, 불활성 가스를 타겟으로 선택된 전구체 이온의 충돌을 통해 단편 이온을 생성한다. CID는 세균 종 ^22-33 광범위한 지질 구조체의 할당에서 중요한 도구를 입증했다.

CID가 가장 보편적으로 구현 MS / MS 방법이지만, 그것은 제품 이온의 한정된 어레이를 생성한다. 193 nm의 UVPD 대안 및 보완 MS / MS 방법입니다. 이 방법은 이온을 조사하는 레이저를 사용하고, 광자의 흡수 이온 및 후속 해리 통전 초래한다. 이 높은 에너지 MS / MS 기술은 CID보다 제품 이온의보다 다양한 배열을 생산하고, 따라서 더 많은 정보를 조각 패턴을 제공합니다. 특히, UVPD는 글리코 시드, 아민, 아와 CC 연계 채권 ^{18,21,34에서} 분열에 따라 지질 종의 미묘한 변화에 대한 정보를 제공한다.

프로토콜

모든 솔루션은 초순수 및 HPLC 급 메탄올과 클로로포름으로 준비를해야합니다. 메탄올, 클로로포름, 피리딘 및 농축 산 또는 염기와 같은 유기 용매를 포함하는 준비 솔루션을 준비하고 화학 흄 후드에서 사용되어야한다. 모든 용액은 RT에서 저장 될 수있다. 용제는 캡을 지어 졸업 유리 실린더 측정 및 PTFE 유리 용매 병에 보관해야합니다. 장기간 저장을 위해 클로로포름 - 함유 용매는 포스겐의 생산, 고 반응성 산 클로라이드를 피하기 위해 착색 호박색 유리 병에 저장되어야한다. PTFE의 원심 분리기 튜브 및 회전 증발기 플라스크는 사용하기 전에 메탄올과 클로로포름으로 세척해야한다. 용매 및 / 또는 방사성 폐기물의 처분 필요한 경우 연방, 주 및 / 또는 기관의 폐기물 처리 규정을 따르십시오.

1. 대규모 지질 추출 (50 ㎖ L 1.5)

1. 단상 Bligh 고 - 다이어 혼합물을 준비 클로로폼 메탄올-1X 인산은 식염수 (PBS), 산도 7.4 버퍼, 1:2:0.8 V / V). 클로로포름 200 ㎖, 1 L 용매 병에 PBS 400 ㎖의 메탄올 160 ㎖의 결합. 모자 병 및 반전에 의해 혼합 (> 30 배). 환기 및 밀봉 저장하는 혼합 동안 주기적으로 캡을 풉니 다.
2. 전 평형을 두 단계 Bligh 고 - 다이어 혼합물 - 클로로포름을 준비 : 메탄올 : 물 (2:2:1.8 V / V). 클로로포름 400 ㎖, 400 ㎖의 메탄올 1 L 용매 병에 물 180 ㎖를 결합합니다. 모자 병 및 반전에 의해 혼합, 배출하기 위해 혼합하는 동안 주기적으로 모자를 풀어야하고. O / N 및 저장 밀봉 평형을 보자.
3. 순한 산 ​​가수 분해 버퍼 준비 (50 mM의 아세트산 나트륨, pH가 4.5, 1 % 소듐 도데 실 설페이트 (SDS)). 순한 산 ​​가수 분해 완충액 500 ㎖를 들어, 아세트산 나트륨 2.05 g의 무게를 500 ㎖의 비이커에 옮긴다. 다음 50 ㎖의 10 % SDS를 추가 ~ 350 ㎖ 및 교반의 볼륨에 물을 추가합니다. 혼합하고, 4.5로 산도를 조정 눈금 실린더에 전송하고, 500 ㎖의 물을 추가합니다.
4. 준비클로로포름 : 메탄올 (4:1 V / V) : 100 ㎖의 클로로포름을 측정 병을 용매로 전송. 메탄올 25 ㎖를 측정하고 클로로포름으로 섞는다. 호박색 유리 병에 보관합니다.
5. 하나의 박테리아의 식민지에서 미디어의 5 ML (루리아 국물 등)을 접종한다. 37 ° C에서 O / N을 성장, 또는에서 성장을위한 C °이 필요합니다. 추출 조작의 도면은도 2에 도시된다.
6. 다음 날, OD _600을 측정하고 0.05의 시작 OD ₆₀₀ 문화 200 ㎖를 접종하는 5 ㎖의 O / N 문화를 사용합니다. 0.8 ~ 1.0의 _{600에 도달} OD 때까지 세포를 성장.
7. 10 분 동안 10,000 XG에 원심 분리를 통해 수확 세포. 더 이상 회전이 제대로 펠렛 종자 필요할 수 있습니다. 미디어 상층 액을 붓는다.
8. 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)의 50 ml의 세포 펠렛을 씻으십시오. 펠릿 세포 원심 분리를 반복합니다. -20 ° C에서 뜨는 및 저장 세포 펠렛을 부어, 또는 1.9 단계로 진행합니다.
9. 40 ㎖에 재현 탁 세포1X PBS와 (세포 현탁액 / 관 20 ㎖를 산출)이 250 ㎖의 PTFE의 원심 분리기 튜브 사이의 분열. 단상 Bligh 고 - 다이어를 들어, 각각의 튜브에 클로로포름 25 ㎖ 및 메탄올 50 ㎖를 추가 (: 메탄올 : 클로로포름 물, 1:2:0.8 V / V) (그림 2). 반전에 의해 혼합하고 완전한 세포 용해를 보장하기> 실온에서 20 분 동안 품어.
10. 20 분 동안 2,000 XG에서 상기 혼합물을 원심 분리기. 그러나, 인지질, 이소 프레 지질, 소규모, 소수성 펩타이드가 뜨는에 남아, LPS는 단백질과 핵산 (그림 2)와 함께 펠렛됩니다. 상층 액을 버린다.
11. ~ 100 ㎖의 단상 Bligh 고 - 다이어의 혼합물로 LPS 펠렛을 씻으십시오. 20 분 2,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. E.로부터 지질을 단리되면 대장균이나 살모넬라 균이 하나만 워쉬가 필요하지만, 추가적인 세척 단계는 몇몇 유기체로부터 지질을 단리 때 인지질 오염을 감소시키기 위해 필요할 수있다.
12. 미시간의 27 ML을 추가LD 산 가수 분해 완충액 LPS 펠릿에 (50 mM의 아세트산 나트륨, pH가 4.5], 1 % SDS 단계 1.3 참조)과는 작은 입자가 남아있을 때까지 아래로 피펫 팅하여 혼합한다. 초음파 처리는 균일하게 50 %의 출력에서​​ 20 초 동안 일정한 듀티 사이클에서 프로브 팁 초음파기와 LPS 용액에 펠릿을 재현 탁한다. 샘플 2 배 (버스트 사이에 20 초 / 버스트 ~ 5 초)의 초음파를 반복합니다.
13. 30 분 동안 물을 욕조에 삶아 샘플. 주의 : 뚜껑이 꽉 있지만 완전히 밀봉하지 있는지 확인합니다. 콜레라 균 (V. cholerae의)와 같은 일부 생물은 물을 욕조에서 병을 제거하고 샘플을 진행하기 전에 실온으로 냉각 할 수 있도록 지질 A의 총 수율을 높이기 위해 더 이상 배양 시간 (1 시간)이 필요합니다.
14. 가수 분해 후 지질을 추출 클로로포름에 대해, 클로로포름 30 ㎖ 및 메탄올 30 ㎖를 추가하여 2 단계 Bligh 고 - 다이어 (그림 2) 혼합물에 SDS 솔루션을 변환하려면 : 메탄올 : 물 (2:2:1.8, V / v)의 혼합물. 반전에 의해 혼합 2에서 10 분 동안 샘플을 원심 분리,000 X g. 유리 피펫을 사용하여 깨끗한 PTFE 원심 분리기 튜브에 더 낮은 단계의 압축을 풉니 다.
15. 단계 1.14의 상부 상에, 사전에 평형화 두 단계 Bligh 고 - 다이어 혼합물 (단계 1.2)에서 하부 단계 30 ㎖를 첨가하여 두 번째 추출을 수행한다. 혼합 후 10 분 2,000 XG에 원심 분리기. 낮은 단계의 압축을 해제하고, 단계 1.14에서 추출 된 낮은 단계와 풀.
16. 메탄올 : 사전 평형 2 단계 Bligh 고 - 다이어 상위 단계 2 단계 Bligh 고 - 다이어 혼합물 (클로로포름 만드는 (단계 1.2) 114 ㎖를 추가하여 풀링 낮은 단계 (60 ㎖의 총을) 세척 물, 2시 2분 : 1.8 V / V). 혼합. 10 분 2,000 XG에 원심 분리기.
17. 회전 증발 (그림 2)를 사용하여 깨끗한 유리 회전 증발기 플라스크와 건조 시료에 낮은 단계를 제거합니다.
18. 플라스크의 측면에서 지질의 정지에 도움 회전 플라스크에 메탄올 (4:1 V / V), 및 목욕 초음파 처리 (> 30 초) : 5 ㎖의 클로로포름을 추가합니다. 청소에 지질을 전송하는 유리 전송 피펫을 사용하여유리관 (13 × 100 mm 또는 그 이상) PTFE로 덮인 페놀 스크류 캡을 지어. 질소 건조기를 이용하여 질소 기류 하에서 건조 샘플.
19. 클로로포름 1 ㎖에 재현 탁을 건조 지질 : 메탄올 (4:1 V / V). 작은 볼륨을 사용하여 더 많은 양적 재 부상에 대한 테이퍼베이스 (장비 / 시약의 표 참조) 작은 유리 견본 작은 유리 병 (12 × 32 ㎜)로 전송. 질소 건조기를 사용하여 건조.
20. 말린 샘플은 다음 TLC (프로토콜 2) 또는 MS 분석 (프로토콜 3, 4, 5)까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다. (주 : 재료 절연 및 후속 프로토콜에 사용되는 양이 대부분의 생물에 대한 충분한 무엇을 기준으로 제안하는 것과 동일한 지질 샘플 프로토콜 2-5에서 사용할 수있는, 제거 % 소재로 메모를 복용 자세한 내용은 설명을 참조하십시오...).

2. 박층 크로마토 그래피를 통해 지질 종의 시각화

1. TLC 이동상 용매 시스템 준비 (: 피리딘 : 88 % 포름산 : 클로로포름 물, 50:50:16:5 V / V). COMBIN클로로포름 E 200 ㎖, 피리딘 200 ㎖, 1 L 용매 병 (64) 88 % 포름산 ml의 물 20 밀리리터. 캡 병, 반전 여러 번에 섞어 배출.
2. 20 × 20cm 플레이트를 수용 할 TLC 탱크를 사용합니다. ~ 40cm 크로마토 그래피 종이 라인 TLC 탱크.
3. 피리딘 : 88 % 포름산 : 물 (50:50:16:5, V / V) 혼합 TLC 탱크에 200 ㎖의 클로로포름을 추가합니다. 탱크는 종종 O / N이 바람직하고,보다 편리하게,> 3 시간 동안 사전 평형을 허용합니다.
4. 냉장고에서 건조 지질 샘플을 제거 (1.20 단계) 및 RT 따뜻한하자.
5. 면도칼로 실리카 겔 (60) TLC 판의 위쪽 가장자리에서 실리카를 제거합니다. 무딘 연필을 사용하여, 판의 아래쪽 바닥으로부터 2cm 평행 한 선을 그린다. 이 라인은 샘플을 탐지의 기원이다. 마크는 1cm 간격 샘플을 탐지하는이 기준 라인을 따라 증가합니다.
6. 클로로포름 200 μL의 단계 2.4에서 건조 지질을 용해 : 메탄올 (4:1 V / V), 와류 및 초음파 처리 (3 배 ~ 15 초마다), 수율 ~ 100 -E.에서 추출 된 500 NG / μL 지질 경우 대장균.
7. 2.5 단계에서 표시로 미세 모세관 유리 피펫을 사용하여 TLC 판에 볼륨 (20 μL)의 10 분의 1 자리. 15 분 ~를위한 TLC 판에 자연 건조시킨 샘플을 허용합니다. (주 : 작은 유리 병에 샘플 질소 건조기를 이용하여 건조 및 프로토콜 3-5 이후 사용을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 제거 % 소재에주의하십시오.).
8. 전 평형 탱크에 발견 샘플을 포함하는 TLC 판을 놓습니다. 용매 전면 TLC 판 (~ 2.5-3 시간)의 상단에 도달하면, 접시와 공기 건조 (> 60 분)를 제거합니다. 냉 에어건 완전한 건조를 보장하기 위해 사용될 수있다.
9. 플레이트가 건조되는 동안 타거나 250 ° C에서 핫 플레이트의 전원을 켭니다.
10. 통풍 화학 퓸 후드에서, 실리카 TLC 플레이트 상 해결 지질 탄화 10 % 황산 - 에탄올 혼합물을 제조 (농축 황산 : 100 % 에탄올; 1시 9분 V / v). 황산 10 ㎖를 측정하고 100 % 에탄올 90 ㎖를 천천히 추가 할 수 있습니다. 주의완전 혼합 및 유리 크로마토 그래피 시약 분무기로 전송할 수 있습니다.
11. 흄 후드에서, 10 % 황산 - 에탄올 혼합물로 건조 된 TLC 판을 스프레이 유리 크로마토 그래피 시약 분무기를 사용합니다. 골고루 접시에 걸쳐 혼합물을 스프레이.
12. 불에 탄 지질 샘플 블랙 / 갈색 반점 (<1 분)으로 표시 될 때까지 250 ° C 뜨거운 접시에 TLC 판을 놓습니다. 이 전체 판은 갈색 회전의 원인이 될 수 있고, 지질 종의 시각화가 어려운 것 같이, 플레이트를 지나치게 노출하지 마십시오.

3. MALDI-TOF 질량 분석을 통해 지질의 구조 특성

1. 단계 1.20 (또는 단계 2.7)에서 냉동고에서 지질에게 샘플을 제거하고 RT 따뜻한하자. 건조 지질에게 ~의 샘플을 Resuspend 20 μL의 클로로포름 : 메탄올 (4:1 V / V)와 E.에서 추출하면 ~ ~ 5 ㎍ / ㎕의 지질 솔루션을 얻기 위해 소용돌이 대장균. (참고 : 10 % 이하로 큰 경우 단계 2.7에서 사용되는 재료).
2. ATT 매트릭스 구성 요소를 준비합니다. 포화 6 - 아자50 % 아세토 니트릴-2-thiothymine은 : 1.5 ML microcentrifuge 관에 물 500 μL 아세토 니트릴 500 μl를 추가 한 다음 추가> 10 ㎎ 6 - 아자-2-thiothymine 50 % 아세토 니트릴 슈퍼 포화되도록. 포화 삼 염기 구연산 암모늄 용액 : 침전, 500 ㎕의 물에> 1 mg의 추가는 명백해야한다. 사용하기 전에 소용돌이 원심 분리 솔루션은, 단지 포화 상층 액을 사용한다.
3. ATT 매트릭스 혼합물을 제조 : 50 % 아세토 니트릴 포화 6 - 아자-2-thiothymine, 포화 삼 염기 구연산 암모늄 (20:1 V / V). MALDI 플레이트에 적용하기 전에 500 μL의 microcentrifuge 관, 혼합하는 소용돌이, 원심 분리에 삼 염기 구연산 암모늄 포화 용액 1 μL에 ATT 용액 20 μl를 추가하여 함께 매트릭스의 구성 요소를 섞는다.
4. 가장 정확한 질량 / 충전 비율 결정을 제공하는 샘플이 입금 될 위치 근처의 자리에서 MALDI 플레이트에 0.5 μL의 calibrant 혼합물을 추가하여 MALDI 플레이트를 준비합니다.
5. 0.5 ㎕의 예금지질 샘플을 기탁 각 자리에서 MALDI 판에 ATT 행렬.
6. 접시에 섞어 최적의 이온 신호에 대한 스캐닝 샘플로 스펙트럼 (그림 3)을 취득하는 ATT 행렬의 자리 위에 예금 샘플의 0.5 μL (전체 표본의 2.5 %). 참고 : 최적의 MS 신호에 대한 금액이 유기체에 따라 다양하고 경험적으로 결정해야 할 수 있습니다. 더 많은 자료를 추가 한 0.5 μL에게 발견 혼합물이 더 많은 샘플을 첨가 사이에 건조 할 수 있도록 여러 번 발견 할 수 있습니다. 샘플도 (작은 볼륨에서 건조에 resuspend) 농축 또는 필요에 따라 희석 될 수있다. 상세 출발 물질 (세포 배양을 개시 볼륨)도 (설명 참조)을 사용할 수있다.

4. 전기 분무 이온화 질량 분석 및 지질의 충돌 유도 해리

1. 클로로포름을 준비 메탄올 혼합 용매 (1:1, V / V) 유리 졸 200 ㎖에 HPLC 등급 클로로포름으로 HPLC 급 메탄올 200 ㎕의 주식을 혼합하여병을 배출.
2. (단계 1.20, 2.7, 또는 프로토콜 3 후 건조에서 예) 지질을 유리 병에 메탄올 혼합 용매 및 지질에게 5 분 동안 또는 모든 재료가 녹을 때까지 용액을 초음파 처리 : 클로로포름 200 μl를 전송합니다.
3. 음의 모드 전기 분무 이온화 질량 분석기를 설정합니다.
4. 250 μL 주사기 및 주사기 펌프를 사용하여, 직접 2.0-3.5 μL / 분의 유속으로 희석 지방질에게 시료를 주입한다.
5. 이온 광학 장치를 조정하여 최적화 및 지질에게 이온 신호를 향상시킬 수 있습니다. 전체 질량 스펙트럼은 현재 지질 종 (그림 4)로 수집 할 수 있습니다.
6. 격리 및 MS / MS 방법으로 CID를 선택하여 목표 지질을 활성화.
7. 종은 가장 높은 제품 이온에 비해 약 10 %의 상대 풍부하다 전구체 지질 때까지 CID 전압 (또는 정규화 된 충돌 에너지, NCE)을 증가시킨다.
8. 신호대 충분한 번째는 달성 될 때까지 획득 및 평균 스펙트럼전자 제품 이온. 필요한 스캔의 개수는 일본어 전구체의 신호 강도에 의존하고 3-300 스캔 (도 5a)까지의 범위 일 수있다.

5. 자외선 광분해에 의해 지질에 대한 MS / MS

1. 단계 4.1-4.5에서와 같이 시료와 질량 분석기를 준비합니다.
2. 질량 분석기에 인터페이스 레이저의 전원을 켭니다. 질량 분석계는 193 nm의 엑시머 레이저 등도 및 악기의 HCD 셀에서 UV 활성화를 허용하기 위해 수정되었다. 광분해 기계 ^(35)을 기재 한 것과 유사한 방식으로 구현 하였다. 우리는 높은 에너지 C-트랩 해리 (HCD) 셀에 광자를 전송하는 _CaF2와 광학 창에 수정 된 진공 매니 폴드를 사용합니다. 레이저 펄스 / 지연 발생기 질량 분석기에서 트랜지스터 - 트랜지스터 로직 (TTL) 신호에 의해 MS / MS 동안 트리거됩니다.
3. 레이저는 엑시머 레이저를 트리거 할 수 있도록 기기의 소프트웨어를 설정할 때이온은 HCD 셀을 입력합니다. 이것은 소프트웨어의 겸손한 수정이 필요합니다.
4. 레이저는 매 2 밀리 초 (500 Hz에서) 펄스되도록 펄스 발생기의 전원을 켭니다.
5. MS / MS 방법으로 HCD를 선택하여 지질에게 전구체 이온을 분리하고 1 % NCE에 충돌하는 작은 에너지를 조정합니다. 이것은 HCD 셀 내 자외선 분해에 대한 전구체 이온의 분리를 허용한다. HCD 전지가 사용되고 있지만, 소프트웨어는이 간격 동안 UVPD를 수행하도록 수정된다.
6. 레이저 에너지를 증가시키고, 레이저 펄스의 수를 조정함으로써 절연 지질보기 이온을 활성화. 전형적인 UVPD 실험 10 6 ㎖의 펄스를 이용하여 수행 될 것이다.
7. 충분한 신호 대 노이즈 UVPD 생성물 이온에 대해 달성 될 때까지 단계 4.8에서와 같이, 취득 및 평균 스펙트럼. 필요한 스캔의 개수는 일본어 전구체의 신호 강도에 의존하고 3-300 스캔 (도 5b)까지의 범위 일 수있다.

6. ³² P 라벨링지질 및 후속 절연의

1. 하나의 식민지에서 미디어 (루리아 국물 또는 기타 미디어) 5 ㎖를 접종한다. 37 ° C에서 또는 필요한 온도에서 오 / N을 성장.
2. 다음 날, OD _600을 측정하고 표준 20 X 150mm 일회용 유리 문화 튜브에 성장 ~ 0.05의 시작 OD _600에 문화의 7 ㎖를 접종하는 O / N 문화를 사용합니다. 무기 ³² P. 2.5 μCi / ML을 추가합니다 0.8 ~ 1.0의 _{600에 도달} OD 때까지 세포를 성장. 연방, 주 및 / 또는 방사성 물질의 안전하고 적절한 처리에 대한 제도적 지침을 따르십시오.
3. PTFE와 16 × 125mm 유리 원심 분리기 튜브에서 수확 세포는 10 분 동안 1,500 XG에서 고정 된 각도 임상 원심 분리기를 사용하여 캡을 늘어서있다. 적절한 방사성 폐기물 용기에 뜨는을 제거합니다. 다음 단계에서 생성 된 모든 방사성 폐기물 (예를 들어, 액체, 유리, 생물)은 연방, 주에 따라서 처리 및 / 또는 기관 GUI한다delines.
4. 1X 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 5 ㎖의 세포 펠렛을 씻으십시오. 1,500 X g에서 10 분 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
5. 단상 Bligh 고 - 다이어 혼합물을 5 ㎖의 클로로포름으로 구성된 (그림 2)에 재현 탁 세포 : 메탄올 : 물 (1:2:0.8, V / V). 소용돌이 혼합, 완전 세포 용해를 보장하기> 실온에서 20 분 동안 배양한다.
6. 20 분 1,500 XG에 임상 원심 분리기에서 원심 분리기. 부드럽게 인지질 및 이소 프레 지질을 포함 상층 액을 부어.
7. 50 mM의 아세트산 나트륨, pH가 4.5 1.8 ml의 LPS 펠렛을 재현 탁, 1 % SDS 완충액 텍싱 따라. 펠릿을 균일하게 분산 될 때까지 목욕 초음파기를 사용하여 초음파 처리 샘플 (~ 30 초).
8. 물 목욕을 끓는 30 분 동안 샘플을 품어. 반드시 캡을 꽉 그러나 밀봉되지 않습니다 있는지 확인하십시오.
9. 수조에서 제거하고 시료 5 ~ 10 분 동안 실온에서 냉각 할 수 있습니다.
10. 클로로포름 2 ㎖ 및 2 ㎖를 첨가하여 2 상 Bligh 고 - 다이어 혼합물에 용액 변환메탄올, 클로로포름를 산출 : 메탄올 : 수성 (2:2:1.8 V / V)의 혼합물. 혼합하는 소용돌이, 별도의 단계에 1,500 XG에 임상 원심 분리기에서 10 분 동안 원심 분리기.
11. 유리 피펫 (제 1 추출)를 사용하여 깨끗한 유리 원심 분리기 튜브에 더 낮은 단계의 압축을 풉니 다.
12. 11 단계에서 나머지 상위 단계로 (단계 1.2에서와 같이 제조) 전 평형 두 단계 Bligh 고 - 다이어 낮은 단계의 2 ㎖를 추가하여 샘플에 두 번째 추출을 수행합니다. 소용돌이와 원심 분리기 10 분. 낮은 단계를 제거하고 제 1 추출의 낮은 위상과 결합.
13. 메탄올 : 풀링 낮은 단계 (~ 4 ml의 총 부피)에, 2 단계 Bligh 고 - 다이어 솔루션 (클로로포름 산출, 전 평형 상위 단계 (단계 1.2) 7.6 mL를 넣고 물을, 2:2:1.8, V / v). 10 분 동안 소용돌이 원심 분리기.
14. 깨끗한 유리 튜브에 더 낮은 단계를 제거하고 질소 건조기를 사용하여 건조. 말린 샘플을 추가로 사용할 때까지 -20 ° C에 저장할 수 있습니다.

7. Visuali박층 크로마토 그래피를 통해 ³² P 표지 지질 종의 zation

1. 단계 2.1-2.8에 설명 된대로 ³² P 표지 지질에게 샘플, TLC 탱크 및 TLC 판을 준비합니다.
2. 4시 1분 클로로포름 - 메탄올 (V / V) 500 ㎕의 ³² P - 라벨 샘플을 녹입니다. 소용돌이 목욕 초음파 처리는 완전히 지질 물질을 용해한다. 섬광 칵테일 5 ㎖를 포함하는 섬광 유리 병에 시료의 5 μl를 추가합니다. 섬광 카운터에서 계산 및 샘플의 총 카운트 / 분을 계산합니다.
3. 방사성 동위 원소 지질 종을 시각화 할 때, 10 × 20cm, 20 × 20 ​​센티미터 TLC 판을 사용할 수 있습니다. 플레이트의 긴 치수 (원점에서 발견 즉, 샘플이 10cm의 가장자리 위 2cm를 표시) 수직이되도록 10X20 센티미터 플레이트를 들어, 샘플 단계 2.5에 표시된 원산지 함께 발견되어야한다.
4. 마이크로 모세관 피펫을 사용하여 접시에 10000 노출 당 비용 (CPM) / 샘플을 발견하고 반점 (> 15 분)을 건조 할 수 있습니다. 샘플에서 건조하여 집중해야 할 수도 있습니다질소와 10000 카운트 / 분 / 장소 (<10 μL의 총 시간에 2 μL 2 μL)를 달성하기 위해, 적절한 볼륨에 재현 탁.
5. 전 평형 탱크에 방사성 동위 원소 샘플을 포함하는 TLC 판을 놓습니다. 용매 전면 TLC 판 (~ 3 시간)의 상단에 도달하면, 접시와 공기 건조 (> 60 분)를 제거합니다. 주의 : 피리딘 미량이 phosphorimaging 화면을 손상시킬 같이 피리딘의 존재하에 실행 TLC 플레이트는, 화학 퓸 후드에서 충분히 건조되어야한다. 냉 에어건 완전한 건조를 보장하기 위해 사용될 수있다.
6. 플라스틱 포장의 판을 감싸고 오토 라디오 카세트 O / N.에 phosphorImager 화면에 노출 다음 날 아침, 이미지 (그림 6)을 얻기 위해 화면을 검사합니다. 화상 농도계 분석 소프트웨어를 사용하여,이 방법은 지질 종의 정확한 상대적 정량을 허용한다.

결과

E.의 정식 지질 4 '- 위치 - 대장균 및 살모넬라 엔테의 혈청 형 티피 뮤 리움은 헥사 실화 1에 인산염 그룹과 글루코사민의 이당류이다. 리치 미디어 (예 : 루리아 국물)의 성장하는 동안 지질의 부분은 트리스 - 인산화 종 ³⁶ (그림 1)를 산출 한 위치에서 피로 인산 그룹이 포함되어 있습니다. KDO (3 - 데 옥시-D-Manno의 - octulosonic 산은)에 ?...

토론

이 프로토콜에서 우리는 박테리아의 전체 세포에서 지질 종의 분리를 자세히 설명하고, 화학적으로이 절연 재료의 특성을 TLC 또는 MS 기반의 분석 방법을 설명했다. 텐덤 질량 분석법은 생물학적 화합물의 드 노보 구조적 특성에 대한 강력한 전략이며, 자연에서 볼 수있는 지질 분자의 갑옷의 한 벌의 화학적 특성 분석을위한 매우 중요한 이점입니다. CID 및 UVPD 지질 분자에 대한 키 지문을 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	C607	HPLC Grade
Methanol	Thermo Fisher Scientific	A452	HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles	Thermo Fisher Scientific	05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates	EMD Biosciences	5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper	Whatman	3030700
Orbitrap Elite	Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer	Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters	New Obectives		≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator	Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200	Barnstead/Thermolyne	HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes	Corning Pyrex	99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415	Corning	9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager)	BioRad	170-9400
Autoradiography Cassette	Thermo Fisher Scientific	FBCS810
Phosphorscreen SO230	Kodak
Peptide Mass Standards Kit	Sequazyme	P2-3143-00
Sonifier S250-A	Branson	101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial	Thermo Fisher Scientific	C4000-V1