Floresan Etiketli Vaksinia Virüs Proteinlerinin Verimli Üretimi için Metodoloji

Özet

Geçici baskın seçim yöntemini kullanarak floresan etiketli proteinleri aynı anda ifade eden rekombinant vaksinia virüslerinin üretimi için hızlı ve modüler bir protokol burada açıklanmıştır.

Özet

Viral proteinlerin floresan proteinlerle etiketlenmesi, virüs konak etkileşimleri anlayışımızı ilerletmek için vazgeçilmez bir yaklaşım olduğunu kanıtlamıştır. Çiçek hastalığının yok edilmesinde kullanılan canlı aşı olan Vaksinia virüsü (VACV), büyük virion büyüklüğü ve genom seviyesinde mühendislik kolaylığı nedeniyle floresan canlı hücreli mikroskopiye özellikle elverişlidir. Burada rekombinant virüsler üretmek için optimize edilmiş bir protokol bildiriyoruz. Yapı oluşturmanın basitleştirilmesine izin veren vaksinia replikasyonu sırasında hedeflenen homolog rekombinasyon için minimum gereksinimler belirlendi. Bu, geçici baskın seçimin (TDS) floresan bir muhabir ve metabolik seçim ile ittifakının, floresan olarak etiket viral proteinlere hızlı ve modüler bir yaklaşım sağlamasını sağladı. Floresan rekombinant virüslerin neslini kolaylaştırarak, virüs replikasyonu sırasında ortaya çıkan virüs ana bilgisayar etkileşiminin birçok yönünün gelişmiş görüntüleme analizi gibi aşağı akış uygulamalarını kolaylaştırabiliyoruz.

Giriş

Vaksinia virüsü (VACV) prototipik poksvirüstür ve çiçek hastalığının etken maddesi olan variola virüsü ile oldukça ilişkilidir. Bu virüslerin her ikisi de maymunpox ve ektromelia virüsü (mousepox)¹gibi diğer önemli patojenleri içeren ortopedi cinsinin üyeleridir. Ortopediksler, tahmin edilen 200 açık okuma çerçevesinin^2,3'ünekadar kodlayan büyük çift iplikli DNA genomlarına (180-220 kb) sahiptir. Bu virüslerin replikasyonu, olgun virüslerin (MV) yapıldığı bir perinükleer virüs fabrikasının ve MV'nin bir alt kümesinin sarılmış virüsler (WV) oluşturmak için iki ek membran edindiği trans-Golgi ağının oluşumunu içerir (Roberts ve Smith⁴tarafından incelenmiştir). Ortopedik genomlar, VACV genom replikasyonunun bir özelliği olan ve viral DNA polimeraz⁵tarafından aracılık edilen yüksek derecede genetik rekombinasyon nedeniyle genetik manipülasyona oldukça elverişlidir. Rekombinant virüslerin üretilmesi, vaksinia virüslü hücrelerde rekombinasyona aracılık etmek için yeterli olan 12 bp kadar küçük homologlara sahip homolog rekombinasyon ve doğrusal DNA moleküllerine dayanır⁶. Vaksinia virüsünün floresan etiketlemesi, virion başına birçok floresan proteinin birleştirilmesine izin veren ortopedik parçacıkların büyüklüğü nedeniyle son derece parlak virüs parçacıkları verebilir⁷. Vaccinia, yabancı DNA^8'in büyük parçalarını taşıma kapasitesine sahiptir ve ayrıca, sert kapsid simetri eksikliği, endojen loci^9'larındanviral protein gen füzyonlarını ifade ederken bir dereceye kadar esneklik sağlayabilir. VACV proteinlerinin floresan etiketlemesi, özellikle virüs girişi^{10, transport 11-13}ve morfogenez, özellikle sarılmış virionlar⁷alanında, hücre altı düzeyde^{konak-patojen}etkileşimlerinin incelenmesi için paha biçilmez olduğunu kanıtlamıştır.

Rekombinant virüsler zayıflatılmış büyüme fenotipi^14,15, metabolik seleksiyon^16-18veya bir işaret geninin ekspresy ekspresyasyonu ile seçilebilir (örneğin X-gal¹⁹ veya floresan protein^13,20). Burada floresan ve metabolik seçimin güçlü bir kombinasyonunu kullanarak floresan virüslerin seçimini açıklıyoruz. Faulkner ve Moss (1990)²¹tarafından geliştirilen geçici baskın seleksiyon (TDS) vektörleri, işaretleyicilerin istenen floresan etiketli ilgi geni ile birlikte entegre edilmesine izin verir. Metabolik seleksiyon çıkarıldığında, seçim genlerini ekseren, ancak floresan etiketli virüs proteinini sağlam bırakan ikincil bir rekombinasyon olayı meydana gelebilir. Aşağıdaki Şekil 2 deneysel prosedüre genel bir bakış sunmaktadır. Bu çalışmada kullanılan seçim genleri mCherry ve Escherichia coli guanine fosforibosyltransfeaz(gpt)genidir, her ikisi de sentetik erken / geç viral promotörden ifade edilir ve daha önce Cordeiro ve ark. ²² Ek olarak, ilgi çekici etiketli füzyon proteininin floresan vardır. Metabolik seçim kaldırıldığında, seçilebilir belirteçler (mCherry ve gpt) çıkarılır, sadece doğru rekombinant virüslerin tanımlanmasına izin veren etiketli genin floresanını bırakır. Seçim işaretleyicilerinin eksizyonu, birden fazla floresan etiketi birleştirme imkanı sağlar ve aynı anda birkaç viral proteini floresan olarak etiketleme yeteneğine sahip virüsler oluşturmamızı sağlar. Önceki çalışmalar, vaksinia virüslü hücrelere transklüzyona bulaşan doğrusal ve dairesel DNA moleküllerinin vaksinia rekombinasyonu için minimum homoloji gereksinimlerini^{belirlemiştir 6}. Gpt-mCherry TDS vektöründeki farklı homoloji uzunluklarındaki kanatlanma kollarının rekombinasyon verimliliklerini vaccinia viral genomuna dahil edilmesi yoluyla belirlemek istedik. TDS vektöründeki 100 bp'lik homolog bölgelerin, homolog rekombinasyon ile rekombinant DNA'nın VACV genomuna yerleştirilmesini hedeflemek ve aracılık etmek için yeterli olduğu belirlenmiştir (Şekil 4). Daha küçük homoloji uzunlukları da rekombinasyona olanak sağlarken, 100 bp homoloji uzunlukları metabolik ve floresan seçimle kolayca tanımlanabilecek yeterli rekombinant virüs sağladı. Bu büyüklükteki DNA parçaları nispeten düşük maliyetle ticari olarak sentezlenebilir ve rekombinant virüslerin oluşturulması için birden fazla vektörün üretimini büyük ölçüde kolaylaştırır. Yan bölgelerin oligonükleotid dizisinin sentez maliyetlerini düşük tutarken daha fazla rekombinasyon sıklığı sağlamak için homoloji uzunluğunu 150 bp'ye çıkarmayı tercih ettik.

Protokol

1. Rekombinasyon Vektörü Oluşturma

1. N veya C-terminally ilgi çekici geni etiketlemek için gereken 150 bp uzunluğundaki homoloji bölgelerini (sol ve sağ kollar olarak adlandırılır) tanımlayın (Bkz. Şekil 1b).
2. Tercih edilen bir çift kısıtlama bölgesi ile ayrılmış 150 bp sol ve sağ kollardan oluşan bir oligonükleotid dizisi tasarlayın. Tüm bu dizi, sentezlendikten sonra TDS vektörüne dahil edilmesine izin vermek için ikinci bir kısıtlama sitesi çifti (ilk çiftten farklı) tarafından da kuşatılmalıdır. Oligonükleotid'i, dizilerin istenen ekleme sitesiyle çerçevede olduğu kısıtlama siteleriyle tasarlarken dikkatli olun.
3. Sentez için oligonükleotid tasarlarken sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama sitelerini dahil edin, bu da tercih edilen floresan etiketin açık okuma çerçevesini kuşatanlarla eşleşmelidir (bkz. Şekil 1b). NotI kısıtlama sitesini sol kol ile floresan etiketin başlangıcı arasında üç amino asit bağlayıcı olarak kullanmak mümkündür.
4. Bu kısıtlama sitelerini PCR ile floresan etiketinin her iki tarafına da dahil edin (bkz. Şekil 1c).
5. Sentezlenen parçayı TDS vektörüne klonla.
6. Floresan etiketi, homolojinin sol ve sağ kol bölgeleri arasındaki kısıtlama alanlarını kullanarak ortaya çıkan rekombinasyon vektörüne klonlama (bkz. Şekil 1d).

2. Rekombinant Virüs Üretimi

1. Şekil 2'yegöre, BS-C-1 hücrelerinin monolayerini serumsuz ortamda vaksinia virüsü ile enfekte edin, Enfeksiyon Çokluğu (MOI) > 1.
2. Enfeksiyon sonrası 1 saat, Dulbecco Modifiye Kartal Orta (DMEM) ile kurtarma hücreleri ve serumsuz ortamda 3:1 oranında rekombinasyon vektör plazmid ve transfection reaktif karışımı ile transfect.
3. 24 saat sonra, DMEM'de fetal sığır serumu (FBS) içermeyen hücreleri kazıyın ve kurtarın ve açık hücreleri kırmak ve virüs parçacıklarını serbest bırakmak için üç donma-çözülme döngüsü gerçekleştirin.
4. Aşağıdaki gibi% 10 FBS DMEM ve GPT seçim reaktifleri mikhenolik asit (25 μg / ml) ve ksantin (250 μg / ml) sıvı kaplaması ile bir plak analizi gerçekleştirin:
   1. BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.
   2. Tek tek plakların yeterli ayrılmasını sağlamak için% 100 birleştiği hücre monolayerlerini, virüs parçacıkları içeren dondurularak çözülmüş hücrelerin seri seyreltmeleriyle enfekte edin.
   3. GPT seçim reaktiflerini içeren DMEM içeren sıvı% 10 FBS ile kaplama - sırasıyla 25 μg / ml ve 250 μg / ml nihai konsantrasyonlarda mikophenolik asit ve ksantin.
5. 24 saat kuluçkadan sonra, sıvı kaplamayı çıkarın ve mCherry'nin TDS vektöründen virüse dahil edilmesine karşılık gelen dağınık kırmızı floresan gösteren plakları aramak için floresan bir mikroskop kullanın. Hedef gen ve seçilen floresan etiketine bağlı olarak, etiketli genin lokalize floresanları da aynı kırmızı plakta görülebilir.
6. Hücreleri bir Eppendorf tüpüne aktarmak için bir pipet ucu ve DMEM içeren% 5 FBS'nin 100 μl'si ile lokalize kazıma yaparak her rekombinant virüs için birden fazla plak seçin, ardından rekombinant virüsleri serbest bırakmak için kazınmış hücrelerin üç tur dondurularak çözülmesi.
7. Büyüme ortamlarındaki GPT seçim reaktifleri ile rekombinant virüsleri güçlendirmek için 12 kuyulu bir plakadaki tek katmanlı hücrelere dondurarak çözülmüş virüs içeren DMEM'i ekleyin. Başarılı amplifikasyonları 24 saat sonra enfeksiyon kazıyın.
8. Kırmızı floresan sergileyen başarıyla yükseltilmiş plakların bir plak testini gerçekleştirin, bu kez agarose kaplama ve GPT seçimi ile aşağıdaki gibi:
   1. BS-C-1 hücrelerinin monolayer ile 6 kuyulu bir plaka tohum.
   2. Rekombinant virüslerin seri seyreltilmesini gerçekleştirin ve FBS içermeyen DMEM'de artan bir virüs seyreltme ile kuyuları enfekte edin.
   3. Enfeksiyon sonrası 1 saat, sıvı ortamı çıkarın ve GPT seçim reaktifleri ile birlikte% 2.5 FBS, 292 μg / ml L-glutamin, 100 U / ml penisilin ve 100 μg / ml streptomisin içeren minimum esansiyel ortamda (MEM)% 0.5 agarose ile her kuyuyu kaplayın.
9. Enfeksiyon sonrası 2-3 gün, hem kırmızı hem de seçilen floresan etiketin rengini gösteren floresan gösteren plakları tekrar yükseltmek için seçin, bu sefer GPT seçimi olmadan.
10. Bir sonraki plak testini, seçimsiz bir agarose kaplama ile gerçekleştirin.
11. Dağınık kırmızı floresanlarını kaybetmiş plakları seçin, ancak tercih edilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyun.
12. mCherry ve gpt seçim genlerini kaybetmiş ancak seçilen etikete karşılık gelen lokalize floresanları koruyan saf bir rekombinant virüs stoğu elde etmek için hiçbir seçim yapmadan plak saflaştırmaya devam edin. Kontrol stokları plak testine göre saftır, tüm plaklar benzer bir plak fenotipine sahip olmalıdır.
13. Viral stokların saf olduğundan emin olmak için genomik DNA'nın PCR taramasını kullanın.
    1. Floresan gen ekleme bölgesini kuşaten astarlar ve eklenen floresan geninin kendisini güçlendiren astarlar tasarlayın. Bu astarların farklı kombinasyonları, gen yerleştirmeyi algılayacak ve saflığı gösterecek PCR ampliconları üretecektir.
    2. BS-C-1 hücrelerinin 12 kuyu plakalı monolayerinin bir kuyusunda PCR olarak taranacak viral stokları güçlendirin.
    3. Enfeksiyon sonrası 24 saat, enfekte hücreleri 250 μl DMEM'e kazıyın.
    4. Santrifüj enfekte hücreler (10 dk, 4 °C için 18.000 x g), %0,1 (v/v) SDS ile 500 μl TE'de (10 mM Tris-HCl ve 1 mM EDTA, pH 8) süpernatant ve resüspend hücre peletini çıkarın. Girdap'dan Iyse hücrelerine.
    5. Karıştırmak için ters çevirin, 500 μl fenol-kloroform-izoamil akohol ekleyin. Santrifüj (4 dk, 4 °C için 18.000 x g). Üst saltanayı al ve tekrar et.
    6. Karıştırmak için ters çevirin, 1 ml 100% etanol (soğutulmuş) ve 50 μl sodyum asetat ekleyerek süpernatant üzerinde bir etanol çökeltisi gerçekleştirin.
    7. Gece boyunca -20 °C veya 1 saat boyunca -80 °C'de bırakın. Santrifüj (30 dk, 4 °C için 18.000 x g), tüm sıvıyı çıkarın ve çökemiş DNA'nın havayla kurumasını bekleyin. 50 μl TE'de yeniden dirildi.
    8. Bunu genomik DNA PCR taraması için bir şablon olarak kullanın.

3. Birden Fazla Etiket Taşıyan Rekombinant Virüslerin Üretimi

1. Çift veya üç etiketli virüsler oluşturmak veya Protokol 1'den prosedürü tekrarlamak için floresan rekombinant virüslerle aynı hücre monolayerini farklı bir etiketle coinfect edin.
2. Virüsleri plak fenotipine veya virüs izole genomik DNA'sının PCR taramasına dayanarak arındırın.

Sonuçlar

Şekil 1, bu yordam için gerekli olan ve sentezlenen (Şekil 1b ve 1c) veya klonlama adımlarıyla oluşturulan çeşitli yapıları listeler (Şekil 1d). Şekil 2, seçim sürecinin her adımı için gösterilen bir A3-GFP rekombinant VACV'nin temsili floresan plak görüntüleri ile deneysel prosedürün bir taslağını sağlar. Şekil 3'te, sırasıyla iç virüs çekirdeği²³ ve dış zarf^24'ünbir parçası olan viral yapısal proteinler A3 ve F13'ü hedefleyen floresan belirteçlerle etiketlenmiş proteinleri ifade eden rekombinant vaksinia virüsleri gösterilmiştir. Oluşturulan rekombinant virüslerin her biri için viral plakların ve enfekte hücrelerin gözlemleri tasvir edilir. Vektörlerin VACV genomuna homolog rekombinasyonunun verimliliği test edilmiş ve sonuçlar Şekil 4'tetasvir edilmiştir. 100 bp homoloji içeren vektörlerle rekombinasyondan yapılan viral plakların tanımlanmasının göreceli başarısı, 150 bp uzunluğundaki sol ve sağ homoloji kollarını hedef gen haline sentezlemeyi seçmenin arkasındaki nedendi.

Şekil 1. Geçici Dominant Seçim (TDS) rekombinasyon vektörü. (a) GPT ve mCherry seçim işaretleyicileri ile TDS vektörü. (b) Homolojinin sol ve sağ kolları, homoloji kollarının arasında ve yanında belirli kısıtlama bölgeleri ile tasarlanmıştır. Bu yöntemde kullanılan sol ve sağ kollar arasındaki kısıtlama bölgeleri NotI ve BamHI, NotI sitesi de gen ve floresan etiketi arasında bir bağlayıcı olarak kullanılmaktadır. (c) Bu yöntemle uyumlu floresan etiketler ilgili kısıtlama siteleri tarafından kuşatıldı. Kullanılan bazı etiketler GFP (yeşil floresan protein), RFP (kırmızı floresan protein), Cerulean (EKFP üzerinde bir gelişme, bir camgöbeği floresan proteini, haline yönlendirilmiş mutagenezi²⁵tarafından) ve aydınlatma^26'daEM tarafından çözülebilir bir ürün oluşturan GFP'den tasarlanmış bir floresan protein olan mini SOG'dir. (d) Son TDS rekombinasyon vektörün üretilmesinde rol oynayan adımları klonlama. Sol ve sağ yan kolları içeren sentezlenmiş oligonükleotid ilk olarak TDS vektörüne klonlanır. Bu, sol ve sağ kollar arasında bulunan kısıtlama sitelerine klonlanarak herhangi bir seçim etiketinin içeri ve dışarı mekik dokuyabileceği bir rekombinasyon vektörü sağlar. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 2. Rekombinant vaksinia virüsü oluşturmak için deneysel prosedürün ana hatları. Genetik ve hücresel düzeyde meydana gelen olaylar, A3-GFP etiketli floresan vaksinia virüsünün oluşturulmasını takip eden adımları özetleyen temsili plak görüntüleri ile birlikte tasvir edilir. (A) Vaksinia virüsü ile enfekte olan hücreler TDS rekombinasyon vektörü ile transkriptörlenir. (B) Bu şekilde, yalnızca sol rekombinasyonun sonucu gösterilmiştir ve örnek GFP'yi tercih edilen floresan etiketi olarak kullanır. Sağ el rekombinasyonu, tüm TDS plazmidinin genoma benzer şekilde dahil edilmesine neden olur, ancak etiket ara adımda, yani C adımında tüm hedef genle kaynaşır. Rekombinasyon karışımı ile bir hücre monolayer üzerinde plak tahlili yapılır ve GPT seçimine tabi tutulur. (C) Sırasıyla mCherry ve GFP ekspresyonlarına karşılık gelen hem kırmızı hem de yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir. Seçim kaldırıldıktan sonra, gpt ve mCherry genlerinin(D)kaybına karşılık gelen kırmızı floresan kaybı olacaktır ve sadece yeşil floresan sergileyen plaklar toplanır ve yükseltilir (E). Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 3. TDS rekombinasyon sisteminin temsili sonuçları. Görüntüler, 48 saat sonra(a, c, e; ölçek çubuğu 100 μm) hücreleri enfekte eden rekombinant VACV'nin tüm plaklarını, karşılık gelen rekombinant virüsün 8 saat sonra enfekte ettiği tek bir hücrenin görüntüsü eşliğinde(b, d, f; ölçek çubuğu 10 μm) tasvir eder. Virüs parçacıklarını görselleştirmek için virion lokalize proteinlere karşılık gelen genler seçildi. A3, vaksinia virionunun (a, b) çekirdek proteinidir ve F13 (c, d) viral bir zarf proteinidir. Hem floresan olarak A3 hem de F13 (e, f) etiketli çift etiketli bir virüs de gösterilir. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 4. Rekombinant vektörler ile VACV genomları arasındaki rekombinasyon verimliliklerinin nicel analizi. BS-C-1 monolayerleri VACV ile enfekte oldu ve VACV genomuna 500 bp, 100 bp veya 70 bp homoloji bölgeleri içeren üç rekombinasyon vektörü ile enfeksiyon sonrası 1 saat trans enfekte oldu. Her vektör ayrıca gpt ve mCherry seçim genlerinden oluşan TDS kasetini de içeriyordu. Hücreler enfeksiyondan 24 saat sonra kurtarıldı ve oluşan rekombinant virüsleri serbest bırakmak için lysed edildi. GPT seçim ortamı ile hücre lysates üzerinde plak tahlilleri yapıldı ve mCherry floresan gösteren plaklar başarılı rekombinantlar olarak sayıldı. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Şekil 5. Birden çok klonlama sitesini gösteren gpt-mCherry TDS vektörün haritası. Vektör daha önce²² olarak tanımlanmıştır ve vektör haritası Zhang Lab Group'tan (SCU) EZ Plasmid Map v1.9 yardımıyla oluşturulmuştur. Daha büyük resmi görüntülemek için burayı tıklatın.

Tartışmalar

Bu teknik, floresan etiketli viral proteinleri ifade eden rekombinant virüslerin oluşturulması için etkili ve modüler bir protokolü açıklar. Yöntem, viral genomdaki tek değişikliğin, geride seçim işareti bırakmadan bir etiket veya işaretleyici eklenmesi olmasını sağlar. Homolog rekombinasyon için gereken kısa kol uzunluğu, doğrudan sentezini sağlar, pcr ve klonlamanın birkaç zaman alıcı turunu ortadan kaldırırken, mCherry ve metabolik GPT seçiminin floresanları viral rekombinasyon aralarını izole etmek için kullanılır. Bu ara ürünler, seçimin kaldırılmasını takiben, etiketli bir gene sahip bir virüse veya ebeveyn tipine geri çözülebilir. Hem floresan hem de metabolik seleksiyon kullanımını içeren benzer bir yöntem daha önce²⁷ olarak tanımlanmıştır, ancak bu çalışmada kullanılan yöntem homolojinin daha kısa, sentezlenmiş bölgelerini kullanarak, ilgi çekici etiketli genin floresanını görüntüleyerek istenen rekombinant virüsün tanımlanmasını sağlar. Bu ikincil seçim sadece bir plak testinde yeterli floresan üreten yüksek oranda ifade edilen viral genlerin etiketlenmesi için geçerlidir. Alternatif olarak, örneğin güçlü bir viral promotör altında floresan bir protein gibi tam bir ifade kasetinin yerleştirilmesini öngörebilirim. Bu durumda sol ve sağ kollar etiketlenecek viral gen yerine ekleme noktasını tanımlar.

Deneysel prosedür sırasında yararlı olduğu kanıtlandı bazı önemli adımlar vardır. Yukarıda açıklanan adım 2.3.3'teki sıvı kaplama, kırmızı/yeşil floresan plakların tespiti ve izolasyonu için çok önemli olduğunu kanıtladı. GPT seçim reaktifleri ve agarose kaplamasının kombinasyonunun rekombinant virüslerin büyümesini caydırdığını ve bu nedenle transfeksiyondan sonra virüsleri güçlendirmenin ilk adımı için sıvı bir kaplamaya geçtiğini inanıyoruz. Sol kol rekombinasyonundan kaynaklanan ara ürünler, sol kolda da bir promotör dizisi içeriyorsa plaklarda gözlenen yaygın floresan ile sonuçlanabileceğinden, zenginleştirme ve saflaştırma için lokalize etiket rengi floresan gösteren floresan plakların seçimi de önemlidir. TDS vektöründeki mCherry işaret geni de gfpile değiştirilebilir , örneğin, mCherry'nin floresan etiketi olarak kolayca birleştirilmesine ve seçilmesine izin vermek için.

Yukarıda açıklanan bazı teknikler, rekombinant vaksinia virüsü oluşturmanın yerleşik yöntemlerinden biraz farklılık gösterir. Örneğin, rekombinant oluşturmak için kullanılan virüsün MOI'si normalde^{1 28}'den azdır , ancak daha yüksek MOI'lerin kullanımı bu yöntemle rekombinant vaksinia virüsünün oluşturulması için yeterli olmuştur. GPT seçim reaktiflerinin kullanımı normalde hücrelerin seçim reaktifleri¹⁸ile önkökasyonunu gerektirir , ancak enfeksiyon sonrası kurtarma aşamasında eklenmesi, özellikle floresan seçim işaretleyicisinin varlığı nedeniyle hala istenen rekombinantların yeterli seçimini sağladı.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu tekniğin sınırlamalarından biri, ikincil floresan seçim adımının, bir plak testinde gözle algılanmasını sağlayan bir düzeyde, ilgi çekici etiketli proteinin yüksek oranda ifade edilmesine dayanmasıdır. Bu olmadan, sadece mCherry floresan sergileyen virüsleri arındırmak mümkün olacaktır, bunlardan en az% 50'si, yukarıdaki adım 2.12'de açıklanan PCR gibi moleküler stratejilerle tanımlanabilecek istenen rekombinant virüsleri içerecektir. Diğer bir sınırlama, etiketlemelerinin bir sonucu olarak bazı proteinlerin inaktivasyonu olabilir. Floresan etiketi mutasyona uğrayabilir veya zaman içinde geçen rekombinant virüs tarafından eksantasyona uğrayabilir. Bu nedenle rekombinant virüs stoklarının mikroskopi ve PCR ile düzenli örneklemesi önerilir. Son olarak, tek bir virüse dahil edilebilen floresan etiketli proteinlerin sayısının bir sınırı olabilir. Bunun bir yönü, hepsini aynı anda görselleştirme yeteneğidir; mevcut floresan etiketlerin emisyon spektrumunun çakışan doğası göz önüne alındığında, minimum spektral kanama sağlamak için bunları dikkatlice seçmek önemlidir. Ek olarak, GFP ve Cerulean gibi yakından ilişkili etiketlerin kullanılması, rekombinant genomdaki konumlarına bağlı olarak ikisi arasında yeniden birleştirme olasılığını açar.

Bu tekniğin modüler yapısı, floresan etiketlerin diğer boyama ve/veya etiket seçenekleriyle uyumluluğa dayalı olarak basit bir şekilde değiştirilmesini sağlar. Seçilebilir belirteçleri uyararak, TDS yöntemi çeşitli floresan proteinlerin seri olarak eklenmesine veya fenotipik analizler için TDS tabanlı gen silme ile TDS tabanlı etiketlemenin kombinasyonuna izin verir²⁹. Bu yaklaşımın yararı için bir örnek olarak, virüs çekirdeklerini ve WV zarını etiketleyen çift etiketli bir floresan virüs oluşturuldu. Bu virüsle yapılan görüntüleme çalışmaları, virüs replikasyon sırasında virüsün hareketini, morfogenezini ve sarılmasını incelemek için kullanılabilir. Henüz keşfedilmemiş vaksinia viral proteinleri de bu teknikle etiketlenebilir ve incelenebilir.

Vaksinia virüsü, canlı hücreli mikroskopiye elverişli olan virüsün birçok özelliği nedeniyle görüntüleme çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Floresan etiketler viral genomdan ifade edilir, transfeksiyon ihtiyacını ortadan kaldırır, enfekte hayvanlardan veya dönüştürülemez hücrelerden elde edilen birincil hücrelerin kolayca analiz edilmesine olanak tanır. Başlangıçta, floresan VACV'ler virüs hareketinin basit hücre altı takibi için kullanıldı³⁰, ancak daha yeni yaklaşımlar FRET çalışmaları³¹, tek virüs parçacıklarında FRAP³², promotör muhabirleri³³, intravital görüntüleme³⁴ve yapısal çalışmalar^35-37'yi içerecek şekilde yardımcı programını genişletti. Tüm bu teknikler, rekombinant floresan virüsler oluşturma yöntemi ile birlikte daha kolay ve daha yakın ulaşılabilir olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mycophenolic acid	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent	Promega	E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)