Metodologia para a Geração Eficiente de Proteínas do Vírus da Vaccinia marcadas fluorescentes

Resumo

Um protocolo rápido e modular para a geração de vírus recombinantes de vaccinia expressando proteínas fluorescentes marcadas simultaneamente usando o método de seleção dominante transitória é descrito aqui.

Resumo

A marcação de proteínas virais com proteínas fluorescentes provou ser uma abordagem indispensável para promover nossa compreensão das interações vírus-hospedeiros. O vírus da vaccinia (VACV), a vacina viva usada na erradicação da varíola, é particularmente favorável à microscopia de células vivas fluorescentes devido ao seu grande tamanho de virion e à facilidade com que pode ser projetada no nível do genoma. Informamos aqui um protocolo otimizado para a geração de vírus recombinantes. Foram determinados os requisitos mínimos para recombinação homóloga direcionada durante a replicação da vaccinia, o que permite a simplificação da geração de construções. Isso permitiu que a aliança de seleção dominante transitória (TDS) com um repórter fluorescente e seleção metabólica fornecesse uma abordagem rápida e modular para rotular fluorescentemente proteínas virais. Ao simplificar a geração de vírus recombinantes fluorescentes, somos capazes de facilitar aplicações a jusante, como análise avançada de imagem de muitos aspectos da interação entre vírus-host que ocorre durante a replicação do vírus.

Introdução

O vírus da vaccinia (VACV) é o varívido prototípico e altamente relacionado ao vírus variola, o agente causador da varíola. Ambos os vírus são membros do gênero ortopéxi que inclui outros patógenos notáveis, como o macacopox e o vírus ectromélia (mousepox)¹. Ortooxivírus têm grandes genomas de DNA de dupla vertente (180-220 kb) que codificam acima de 200 quadros de leitura aberto previstos^2,3. A replicação desses vírus envolve a formação de uma fábrica de vírus perinucleares, onde são feitos vírus maduros (MV), e a rede trans-Golgi, onde um subconjunto de MV adquire duas membranas adicionais para gerar vírus embrulhados (WV) (revisados por Roberts e Smith⁴). Os genomas ortoxixos são altamente favoráveis à manipulação genética devido ao alto grau de recombinação genética que é uma característica da replicação do genoma VACV e é mediado pela polimerase de DNA viral⁵. A geração de vírus recombinantes baseia-se na recombinação homóloga e moléculas de DNA lineares com homólogos de até 12 bps sendo suficientes para mediar a recombinação em células infectadas pelo vírus da vaccinia⁶. A rotulagem fluorescente do vírus da vaccinia pode produzir partículas de vírus extremamente brilhantes devido ao grande tamanho das partículas de ortopócio, o que permite a incorporação de muitas proteínas fluorescentes por virion⁷. A vaccinia tem a capacidade de transportar grandes fragmentos de DNA estrangeiro⁸ e, além disso, a falta de simetria rígida de capsídeos pode permitir um grau de flexibilidade ao expressar fusões genéticas de proteínas virais de seu loci endógeno⁹. A marcação fluorescente das proteínas VACV tem se mostrado inestimável para o estudo das interações hospedeiro-patógeno no nível subcelular, particularmente no campo da entrada do vírus¹⁰, transporte^11-13, e morfogênese, particularmente de virions embrulhados⁷.

Os vírus recombinantes podem ser selecionados pelo resgate de um fenótipo de crescimento atenuado^14,15, seleção metabólica^16-18, ou pela expressão de um gene marcador (por exemplo, X-gal¹⁹ ou proteína fluorescente^13,20). Aqui descrevemos a seleção de vírus fluorescentes usando uma poderosa combinação de seleção fluorescente e metabólica. Os vetores de seleção dominante transitória (TDS), desenvolvidos por Faulkner e Moss (1990)^21,permitem que os marcadores sejam integrados juntamente com o gene de interesse fluorescente desejado. Quando a seleção metabólica é removida, pode ocorrer um evento secundário de recombinação que excise os genes de seleção, mas deixa a proteína do vírus fluorescente intacta. A Figura 2 abaixo fornece uma visão geral do procedimento experimental. Os genes de seleção utilizados neste estudo são o gene mCherry e o gene Escherichia coli guanine phosphoribosyltransferase(gpt),ambos expressos de um promotor viral sintético precoce/tardio e utilizado anteriormente por Cordeiro et al. ²² Além disso, há fluorescência da proteína de fusão marcada de interesse. Quando a seleção metabólica é removida, os marcadores selecionáveis(mCherry e gpt) são extirpados, restando apenas a fluorescência do gene marcado, que permite a identificação dos vírus recombinantes corretos. A excisão dos marcadores de seleção oferece a possibilidade de combinar múltiplas tags fluorescentes, permitindo-nos criar vírus com a capacidade de rotular fluorescentemente várias proteínas virais simultaneamente. Estudos anteriores determinaram os requisitos mínimos de homologia para a recombinação da vaccinia de moléculas de DNA lineares e circulares transfectadas em células infectadas pelo vírus da vaccinia⁶. Queríamos determinar a eficiência de recombinação de diferentes comprimentos de ritologia de braços flanqueados no vetor GPT-mCherry TDS através de sua incorporação ao genoma viral da vaccinia. Foi determinado que regiões homólogas de 100 bp no vetor TDS são suficientes para atingir e mediar a inserção de DNA recombinante no genoma vacv por recombinação hologous(Figura 4). Enquanto comprimentos de emologia menores também permitiriam a recombinação, os comprimentos de 100 bp de homologia forneceram vírus recombinantes suficientes que poderiam ser facilmente identificados com a seleção metabólica e fluorescente. Fragmentos de DNA deste tamanho podem ser sintetizados comercialmente a um custo relativamente baixo e facilita muito a produção de múltiplos vetores para a criação de vírus recombinantes. Optamos por aumentar o comprimento da homologia para 150 bp para proporcionar maior frequência de recombinação, mantendo os custos de síntese da sequência de oligonucleotídeos de regiões de flanqueamento.

Protocolo

1. Criando o Vetor de Recombinação

1. Identificar regiões de ladeamento de 150 bp de longa mente (conhecidas como braços esquerdos e de direita) necessárias para rotular o gene de interesse viral (Ver Figura 1b).
2. Projete uma sequência de oligonucleotídeos que compõe os braços esquerdo e direito de 150 bp separados por um par de locais de restrição de escolha. Toda essa sequência também deve ser flanqueada por um segundo par de sites de restrição (diferentes do primeiro par) para permitir a incorporação no vetor TDS uma vez sintetizado. Tome cuidado ao projetar o oligonucleotídeo com locais de restrição que as sequências estão em quadro com o local de inserção desejado.
3. Incorpore os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito ao projetar o oligonucleotídeo para síntese, que deve coincidir com aqueles que flanqueiam o quadro de leitura aberto da tag fluorescente de escolha (ver Figura 1b). É possível usar um local de restrição NotI como um linker de três aminoácidos entre o braço esquerdo e o início da tag fluorescente.
4. Incorpore esses mesmos locais de restrição em ambos os lados da tag fluorescente por PCR (ver Figura 1c).
5. Clone o fragmento sintetizado no vetor TDS.
6. Clone a tag fluorescente no vetor de recombinação resultante usando os locais de restrição entre as regiões do braço esquerdo e direito da homologia (ver Figura 1d).

2. Geração de vírus recombinantes

1. De acordo com a Figura 2,infecte uma monocamada de células BS-C-1 com vírus de vaccinia em mídia livre de soro em uma Multiplicidade de Infecção (MOI) > 1.
2. 1 hora pós-infecção, células de resgate com O Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco e transfecção com uma mistura de plasmídeo vetorial de recombinação e reagente transfecção em uma proporção de 3:1 em mídia livre de soro.
3. Após 24 horas, raspe e recupere células no DMEM sem soro bovino fetal (FBS) e realize três ciclos de congelamento para quebrar células abertas e liberar partículas de vírus.
4. Realize um ensaio de placa com uma sobreposição líquida de 10% FBS DMEM e reagentes de seleção GPT ácido micfenólico (25 μg/ml) e xanthine (250 μg/ml) da seguinte forma:
   1. Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.
   2. Infecte moncamas celulares 100% confluentes com diluições seriais das células congelantes contendo partículas de vírus para garantir a separação adequada de placas individuais.
   3. Sobreposição com FBS líquido 10% contendo DMEM contendo os reagentes de seleção GPT - ácido mycofenólico e xanthine nas concentrações finais de 25 μg/ml e 250 μg/ml, respectivamente.
5. Após uma incubação de 24 horas, remova a sobreposição líquida e use um microscópio fluorescente para procurar placas que expuseram fluorescência vermelha difusa correspondente à incorporação de mCherry do vetor TDS no vírus. Dependendo do gene alvo e da tag fluorescente escolhida, a fluorescência localizada do gene marcado também pode ser observada na mesma placa vermelha.
6. Escolha várias placas para cada vírus recombinante por raspagem localizada com uma ponta de pipeta e 100 μl de 5% de FBS contendo DMEM para transferir células para um tubo Eppendorf, seguido por três rodadas de congelamento de células raspadas para liberar vírus recombinantes.
7. Adicione o DMEM contendo vírus descongelado por congelamento a uma monocamada de células em uma placa de 12 poços para amplificar vírus recombinantes com reagentes de seleção de GPT na mídia de crescimento. Raspe amplificações bem sucedidas 24 horas após a infecção.
8. Realize um ensaio de placas com sucesso amplificadas exibindo fluorescência vermelha, desta vez com uma sobreposição de ágarose e seleção gpt, da seguinte forma:
   1. Semente uma placa de 6 poços com uma monocamada de células BS-C-1.
   2. Realize uma diluição serial dos vírus recombinantes e infecte poços com uma diluição crescente de vírus no DMEM livre de FBS.
   3. 1 hora pós-infecção, remova a mídia líquida e sobreponha cada poço com 0,5% de agarose em meio essencial mínimo (MEM) contendo 2,5% FBS, 292 μg/ml L-glutamina, 100 penicilina U/ml e 100 μg/ml estreptomicina, juntamente com os reagentes de seleção GPT.
9. 2-3 dias após a infecção, escolha placas exibindo fluorescência que é tanto vermelha quanto a cor da tag fluorescente escolhida para amplificar novamente, desta vez sem seleção gpt.
10. Realize o próximo ensaio da placa com uma sobreposição de agarose sem seleção.
11. Escolha placas que perderam sua fluorescência vermelha difusa, mas mantenham a fluorescência localizada correspondente à tag de escolha.
12. Continue a purificar a placa sem seleção para obter um estoque puro de vírus recombinantes que perderam os genes de seleção mCherry e gpt, mas mantêm a fluorescência localizada correspondente à tag escolhida. Os estoques de verificação são puros por ensaio de placa, todas as placas devem ter um fenótipo de placa semelhante.
13. Use a triagem PCR de DNA genômico para garantir que os estoques virais sejam puros.
    1. Projete primers que flanqueiam o local de inserção de genes fluorescentes e primers que amplificam o próprio gene fluorescente inserido. Diferentes combinações desses primers produzirão amplicons PCR que detectarão a inserção genética e indicarão pureza.
    2. Amplie as ações virais para serem rastreadas em um poço de uma monocamada de placa de 12 poços de células BS-C-1.
    3. 24 horas após a infecção, raspe as células infectadas em 250 μl de DMEM.
    4. Centrífugas infectadas (18.000 x g por 10 min, 4 °C), removem pelotas de células supernascidas e resusgaspendas em 500 μl TE (10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA, pH 8) com 0,1% (v/v) SDS. Vórtice para células de lise.
    5. Adicione 500 μl de fenol-clorofórmio-isoamil acohol, inverter para misturar. Centrífuga (18.000 x g para 4 min, 4 °C). Pegue o supernatante e repita.
    6. Realize uma precipitação de etanol no supernasal adicionando 1 ml 100% etanol (refrigerado) e acetato de sódio de 50 μl, inverter para misturar.
    7. Deixe a -20 °C durante a noite ou -80 °C por 1 hora. Centrífuga (18.000 x g por 30 min, 4 °C), remova todo o líquido e permita que o DNA precipitado seque. Resuspend em 50 μl TE.
    8. Use isso como um modelo para a triagem genômica de DNA PCR.

3. Geração de vírus recombinantes carregando mais de uma tag

1. Coinfecte a mesma monocamada celular com vírus recombinantes fluorescentes para criar vírus duplos ou triplos ou repetir o procedimento do Protocolo 1) com uma tag diferente.
2. Purificar vírus com base no fenótipo de placa ou na triagem pcr do DNA genômico do vírus isolado.

Resultados

A Figura 1 lista os vários construtos necessários para este procedimento, que são sintetizados(Figuras 1b e 1c) ou criados por etapas de clonagem(Figura 1d). A Figura 2 fornece um esboço do procedimento experimental com imagens representativas de placa fluorescente de um VACV recombinante A3-GFP retratado para cada etapa do processo seletivo. Na Figura 3,vírus recombinantes da vaccinia expressando proteínas marcadas com marcadores fluorescentes direcionados às proteínas estruturais virais A3 e F13, que fazem parte do núcleo do vírus interno²³ e envelope externo^{24, respectivamente,}são mostrados. Observações de placas virais e células infectadas para cada um dos vírus recombinantes criados são retratadas. A eficiência da recombinação homóloga de vetores com o genoma VACV, contendo até 70 bp regiões de homologia, foi testada e os resultados são retratados na Figura 4. O relativo sucesso da identificação de placas virais feitas a partir da recombinação com vetores contendo 100 bp de homologia foi o raciocínio por trás da escolha de sintetizar 150 bp de comprimento braços esquerdo e direito da homologia ao gene alvo.

Figura 1. Vetor de recombinação transitória (TDS). (a) Vetor TDS com marcadores de seleção gpt e mCherry. (b) Os braços esquerdo e direito da homologia são projetados com locais de restrição específicos entre e flanqueando os braços da homologia. Os locais de restrição entre os braços esquerdo e direito utilizados neste método foram NotI e BamHI, o site NotI também sendo usado como um linker entre o gene e a tag fluorescente. (c) As tags fluorescentes compatíveis com este método são flanqueadas por locais de restrição correspondentes. Algumas tags empregadas são GFP (proteína fluorescente verde), RFP (proteína fluorescente vermelha), Cerulean (uma melhoria no ECFP, uma proteína fluorescente ciano, por mutagênese²⁵) e mini-SOG, uma proteína fluorescente projetada a partir de GFP que cria um produto solucionável pela EM na iluminação²⁶. dEtapas de clonagem envolvidas na geração do vetor final de recombinação TDS. O oligonucleotídeo sintetizado contendo os braços de flanco esquerdo e direito é primeiro clonado no vetor TDS. Isso fornece um vetor de recombinação no qual qualquer tag de escolha pode ser transportada para dentro e para fora, clonando nos locais de restrição incorporados entre os braços esquerdo e direito. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 2. Esboço do procedimento experimental para criar um vírus de vaccinia recombinante. Eventos ocorridos nos níveis genético e celular são retratados, juntamente com imagens representativas de placas delineando os passos após a criação de um vírus de vaccinia fluorescente rotulado a3-GFP. (A) As células infectadas com o vírus da vaccinia são transfeinadas com o vetor de recombinação TDS. (B) Nesta figura, apenas o resultado da recombinação da mão esquerda é retratado e o exemplo usa GFP como a tag fluorescente de escolha. A recombinação da mão direita resultaria em todo o plasmídeo TDS sendo incorporado ao genoma de forma semelhante, exceto que a tag seria fundida a todo o gene alvo na etapa intermediária, ou seja, passo C. Um ensaio de placa é realizado em uma monocamada celular com a mistura de recombinação e submetido à seleção gpt. (C) Placas que exibem fluorescência vermelha e verde, correspondentes à expressão mCherry e GFP, respectivamente, são colhidas e amplificadas. Uma vez removida a seleção, haverá perda de fluorescência vermelha correspondente à perda dos genes gpt e mCherry (D)e placas que exibem fluorescência exclusivamente verde são colhidas e amplificadas(E). Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 3. Resultados representativos do sistema de recombinação TDS. As imagens mostram placas inteiras de VACV recombinante infectando células após 48 horas (a, c, e; barra de escala 100 μm), acompanhadas por uma imagem de uma única célula infectada pelo vírus recombinante correspondente após 8 horas (b, d, f; barra de escala 10 μm). Genes correspondentes a proteínas localizadas em virion foram selecionados para visualizar partículas de vírus. A3 é uma proteína central da vaccinia virion (a, b) e F13 (c, d) é uma proteína envelope viral. Um vírus de marca dupla com ambos fluorescente rotulados A3 e F13 (e, f) também é mostrado. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 4. Análise quantitativa das eficiências de recombinação entre vetores recombinantes e o genoma VACV. As monocamadas BS-C-1 foram infectadas com VACV e transfeinadas de 1 hora pós-infecção com três vetores de recombinação contendo regiões de homologia de 500 bp, 100 bp ou 70 bp para o genoma do VACV. Cada vetor também continha o TDS composto por genes de seleção gpt e mCherry. As células foram recuperadas 24 horas após a infecção e liberadas para a liberação dos vírus recombinantes formados. Ensaios de placa foram realizados em lises celulares com mídia de seleção de GPT e placas mostrando fluorescência mCherry foram contados como recombinantes bem sucedidos. Clique aqui para ver imagem maior.

Figura 5. Mapa do vetor GPT-mCherry TDS mostrando o local de clonagem múltipla. O vetor foi descrito anteriormente²² e o mapa vetorial foi criado com a ajuda do EZ Plasmid Map v1.9 do Zhang Lab Group (SCU). Clique aqui para ver imagem maior.

Discussão

Esta técnica descreve um protocolo eficiente e modular para a criação de vírus recombinantes que expressam proteínas virais marcadas fluorescentemente. O método garante que a única mudança no genoma viral é a adição de uma tag ou marcador, deixando para trás nenhum marcador de seleção. O curto comprimento do braço necessário para a recombinação homólogoa permite sua síntese direta, eliminando várias rodadas demoradas de PCR e clonagem, enquanto a fluorescência de mCherry e seleção de GPT metabólico são usadas para isolar intermediários de recombinação viral. Esses intermediários podem ser resolvidos, após a remoção da seleção, para um vírus com um gene marcado ou de volta ao tipo parental. Método semelhante envolvendo o uso de seleção fluorescente e metabólica foi descrito anteriormente^27, embora o método utilizado neste estudo utilize regiões mais curtas e sintetizadas da homologia, permitindo a identificação do vírus recombinante desejado por meio da imagem da fluorescência do gene de interesse marcado. Esta seleção secundária só é aplicável para marcar genes virais altamente expressos que produzem fluorescência suficiente em um ensaio de placa. Alternativamente, pode-se imaginar a inserção de um de expressão completa, por exemplo, uma proteína fluorescente sob um forte promotor viral. Neste caso, os braços esquerdo e direito definiriam o ponto de inserção em vez do gene viral a ser marcado.

Existem algumas etapas-chave que se mostraram úteis durante o procedimento experimental. A sobreposição líquida na etapa 2.3.3 descrita acima mostrou-se crucial para a detecção e isolamento de placas fluorescentes vermelhas/verdes. Acreditamos que a combinação dos reagentes de seleção de GPT e a sobreposição de agarose dissuadiu o crescimento de vírus recombinantes e, portanto, mudou para uma sobreposição líquida para o primeiro passo de amplificação de vírus após a transfecção. Também é importante escolher placas fluorescentes mostrando fluorescência de cores localizadas para enriquecimento e purificação, pois intermediários resultantes da recombinação do braço esquerdo podem resultar em fluorescência difusa observada em placas se o braço esquerdo também contiver uma sequência de promotores. O gene marcador mCherry no vetor TDS também pode ser substituído por gfp, por exemplo, para permitir a fácil incorporação e seleção de mCherry como uma tag fluorescente.

Algumas técnicas descritas acima variam ligeiramente de métodos estabelecidos de criação do vírus da vaccinia recombinante. Por exemplo, o MOI do vírus usado para criar recombinantes é normalmente inferior a¹²⁸, no entanto, o uso de MOIs mais elevados tem sido suficiente para a criação de vírus recombinantes de vaccinia por este método. O uso de reagentes de seleção de GPT normalmente requer a pré-insubtação das células com reagentes de seleção^18,porém adicioná-los durante a fase de resgate pós-infecção ainda forneceu seleção suficiente de recombinantes desejados, particularmente devido à presença de um marcador de seleção fluorescente também.

Como mencionado anteriormente, uma das limitações dessa técnica é que a etapa de seleção de fluorescência secundária depende da proteína marcada de interesse ser altamente expressa, em um nível que permite sua detecção de olho em um ensaio de placa. Sem isso, seria possível purificar vírus que apenas exibiam fluorescência mCherry, dos quais pelo menos 50% conteriam os vírus recombinantes desejados, que poderiam ser identificados por estratégias moleculares como a PCR descrita na etapa 2.12 acima. Outra limitação pode ser a inativação de certas proteínas como resultado de sua marcação. A tag fluorescente pode sofrer mutações ou ser excisada pelo vírus recombinante com a passagem ao longo do tempo. Portanto, recomenda-se a amostragem regular de estoques de vírus recombinantes por microscopia e PCR. Finalmente, pode haver um limite para o número de proteínas fluorescentes marcadas que podem ser incorporadas em um único vírus. Um aspecto disso é a capacidade de visualizá-los simultaneamente; dada a natureza sobreposta dos espectros de emissões das etiquetas fluorescentes disponíveis, é importante selecioná-las cuidadosamente para garantir o sangramento espectral mínimo. Além disso, o uso de tags intimamente relacionadas, como GFP e Cerulean, abre a possibilidade de recombinação entre os dois, dependendo de suas localizações no genoma recombinante.

A natureza modular desta técnica permite a simples substituição de tags fluorescentes com base na compatibilidade com outras opções de coloração e/ou tag. Ao extirer marcadores selecionáveis, o método TDS permite a adição serial de várias proteínas fluorescentes ou a combinação de marcação baseada em TDS com exclusões genéticas baseadas em TDS para análises fenotípicas²⁹. Como exemplo para a utilidade dessa abordagem, foi gerado um vírus fluorescente de marca dupla que rotula núcleos de vírus e a membrana WV. Estudos de imagem com esse vírus podem ser usados para estudar movimento, morfogênese e embrulho de vírus durante a replicação do vírus. Ainda não caracterizadas, as proteínas virais de vacina também podem ser marcadas e estudadas por essa técnica.

O vírus da vaccinia tem sido amplamente utilizado em estudos de imagem devido a muitas características do vírus que são favoráveis à microscopia de células vivas. As etiquetas fluorescentes são expressas a partir do genoma viral, eliminando a necessidade de transfecção, permitindo que células primárias derivadas de animais infectados ou células não transmissíveis sejam facilmente analisadas. Inicialmente, foram utilizados VACVs fluorescentes para rastreamento subcelular simples do movimento do vírus³⁰, mas abordagens mais recentes expandiram sua utilidade para incluir estudos FRET³¹, FRAP em partículas de vírus únicos^32,repórteres^{promotores 33,}imagens intravitais³⁴e estudos estruturais^35-37. Todas essas técnicas poderiam estar cada vez mais próximas, juntamente com este método de criação de vírus fluorescentes recombinantes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mycophenolic acid	Sigma-Aldrich	M3536-50MG	Dissolve in 0.1 N NaOH
Xanthine	Sigma-Aldrich	X0626-5G	Dissolve in 0.1 N NaoH
FuGENE HD transfection reagent	Promega	E2311
Fluorescence microscope fitted with Chroma filters 31001, 31002	Olympus, Chroma	BX51 (Olympus); 31001, 31002 (Chroma)