Nöronal Ateşleme Oranlarının Manipülasyon tarafından Astrositik reseptörleri Plastisite Inducing

Özet

Burada astrositik G-protein bağlı reseptörlerin plastisite çalışma için nöronlarda homeostatik plastisite indüklemek için kullanılan protokol bir uyarlama tarif eder. En son astrositik grubu çocuk farelerde I mGluR'leri değişiklikleri incelemek için kullanılan yöntem, in situ ve in vivo olarak erişkin farelerden dokuda çeşitli astrositik GPCRs ölçekleme ölçülmesi ve astrositik reseptörlerinin duyarlılığının daha iyi takdir elde etmek için uygulanabilir nöronal aktivite değişikliklere.

Özet

Araştırmanın iki yıl yakın in situ ve in vivo olarak astrositleri nöronal serbest bırakılan verici tarafından teşvik edilebilir çok sayıda G protein-eşli reseptörü (GPCR'ler) ifade eden oluşturmuştur. Ancak nöron aktivitesi değişikliklere yanıt olarak plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği çok az dikkat çekmiştir. Burada küresel büyütmek veya Astrositik grup aşağı ben akut beyin dilimleri glutamat reseptörleri (mGluR'ler) metabotropik için kullanılabilecek bir model sistemi tanımlar. Dahil çift yönlü floresan Ca ^{2 +} göstergesi ile nöronal aksiyon potansiyeli frekansı, yük astrositleri ve astrocyte süreçlerini işlemek, uzun vadeli dilim inkübasyon için uygun odaları oluşturmak, parasagital hipokampal dilimleri hazırlamak ve kayıt ile Astrositik Gq GPCR'dir aktivite değişikliklerini ölçmek için nasıl yöntemler konfokal mikroskopi kullanılarak spontan ve uyarılmış astrocyte Ca ^{2 +} olaylar. Aslında, bir "kalsiyum roadmap "astrositik Gq GPCRs esnekliğini ölçmek için nasıl sağlanmaz. Astrositlerin çalışma için tekniğin uygulamaları tartışılmıştır. Astrositik reseptör sinyal nöronal aktivitedeki değişimlere etkilenir nasıl bir anlayış olması hem normal sinaptik fonksiyonu yanı sıra işlemler altta yatan nörolojik bozukluklar ve nörodejeneratif hastalık için önemli etkileri vardır.

Giriş

Astrositler ^{2 +} astrositik Gq GPCRs aktivasyonundan hemen hemen tamamen edilen Sitoplazmik Ca artışlar nöronlar ya da nöronal aksonlarının uyarılmasından saniye içinde yanıt verir. Örneğin muskarinik asetilkolin reseptörleri ^1, kanabinoid reseptörleri ^2, α _1A adrenerjik ^{reseptörler, 3, 4,} ve Grup I mGluR'ler (aşağıya bakınız) akut nöron aktivitesi yanıt her astrositik Gq GPCR alt-tipleridir. Astrositik Grup I mGluR'leri aktivasyonu (örneğin, akut hipokampal dilimler gibi) in situ nöronal glutamaterjik sinirlerin uyarılmasıyla ^5-7, hem de in vivo olarak yetişkin fare korteksteki sensor uyarılması ⁸ takip ediyor, en yaygın olarak gösterilmiştir. Biyoloji ve astrositlerde, nöronlar, ya astrosit nöron etkileşimlerinin fizyolojisi üzerinde sinyalizasyon astrositik Gq GPCR'nin aktivasyonu sonucu tartışma ^9-12 meselesi olmuştur. Bu s olacaknöron-to-astrosit reseptör sinyalizasyon işlevi önce ome zaman tam olarak takdir edilmektedir.

Bu nöronlar deneysel protokolleri kullanarak Astrositik reseptörleri aktive açıktır iken, yeterince anlaşılamamıştır kalması nöron-to-astrosit reseptör iletişim yönleri vardır. Birincisi, astrositik Gq GPCR'ler etkinleştirmek için gerekli nöronal aktivitenin gerçek miktarı iyi tanımlanmış değildir, ve ikinci, kullanım-bağımlı plastisite sergilemek astrositik reseptörlerinin yeteneği az ilgi gördü. Bu soruları başlamak için, biz son zamanlarda nöronal hareket potansiyelinin uzun vadeli değişiklikler (AP)-bağımlı sinaptik aktivite cevaben Astrositik grubunda akut çocuk hipokampal dilimleri ben mGluR'ler iki yönlü ölçekleme ikna etmek için bir protokol geliştirmiştir. I mGluR'leri fo büyütmek nöronal iyonotropik glutamat reseptörlerinin, ^{13, 14,} astrositik grubunun çift yönlü homeostatik plastisite için keşfedilmiştir ne benzerllowing nöronal hareket potansiyelinin abluka ve nöronal aksiyon potansiyeli frekansı ¹⁵ arttığında küçültün. Astrositik reseptörleri bu telafi edici değişiklikler kendiliğinden kaydederek ölçülür ve astrocyte Ca ^{2 +} transientleri uyarılmış ve kontrol koşullarında astrositlerden olanlara bu olayların özelliklerini karşılaştırarak edilebilir. Bu yazıda, astrosit reseptör ölçekleme uyardığı akut hipokampal dilimleri, inkübasyon koşullarının hazırlanması da dahil olmak üzere, bu protokolün kullanımı için tam bir metodoloji tarif astrosit Ca ^{2 +} göstergesi boya yükleme, Ca ^{2 +} görüntüleme konfokal mikroskopi kullanılarak teknikleri ve beklenen etkiler astrocyte Gq GPCR aktivite. Astrosit üzerinde öngörülebilir etkileri ^{Ca2 +} sinyali özellikleri - Gq GPCRs farklı ekspresyon seviyeleri ile transfekte edilmiş kültürlenmiş hücrelerde daha önce kaydedilmiş eşleşen - olarak değişiklikler için tahlil sonraki çalışmalarda kullanılabilecek bir "yol haritası" sağlartrocytic GPCR ifade. Bu tekniğin kullanımı için etkileri ve potansiyel uygulamalar, sağlıklı ve hastalıklı beyin astrosit-nöronal etkileşimlerinin anlaşılmasına katkıda bulunacaktır.

Protokol

Takip işlemleri Riverside Kaliforniya Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmıştır.

1.. Kuluçka Odası ve Dilim Tutucu İnşaatı

1. Inkübasyon odası oluşturma: toksik olmayan bir malzemeden inkübasyon odası oluşturun. Odacık hava sirkülasyonunu kontrol emin olun, yüzer bir dilim için tutucu ACSF yeterli miktarda tutar ve oksijen hatları gaz dispersiyonu oluşur sırasında dilim tutucu bölmenin bir ucunda yüzer böylece yeterince büyük diğer ucu. , Hava geçirmez bir kapak (Şekil 1A), bir pipet ile saklama kabının çekmece kısmı, güzel bir şekilde, bu kriterlere uyar.
   1. Yaklaşık 1 ¼ üstten ve ¼ olarak taraftan kabın tarafında küçük bir delik delin. Delikten esnek bir boru parçası monte (Şekil 1B). Kapak kapalı olduğunda boru o çözüm üzerinde yani henüz yeterince yüksek, sıkıştırılmış olmayacak şekilde yeterince düşük delmek için dikkatli olun.
   2. Oksijen hattı ve odası arasında su geçirmez bir mühür oluşturmak için silikon dikiş sızdırmazlık maddesi ("akvaryum dikiş mühürleyen") uygulayın.
   3. Bir erkek Luer uydurma kullanılarak bir gaz tankı (% 95 oksijen,% 5 karbon dioksit) için boru "dış" ucunu. Özel bir uyum için, cut-to-uygun bir doğal eğimli 200 ul pipet (Şekil 1C).
   4. Bir bir-altı hattı plastik manifolda boru "içeriden" ucunu. Cut-to-fit, her manifoldu girişine (Şekil 1D) altı 20 ul Eppendorf Microloader pipet uçları. Microloaders en ince açma küçük baloncuklar bir akışı üretmek için idealdir.
   5. Havalandırma sağlamak için, kabın (Şekil 1E) kapağının üzerine iki küçük delik açın.
2. Dilim h İnşasıEski: dilim tutucu bir Yüzer kabarcık Rack (Şekil 1F) yapılır.
   1. Kabarcık rafın alt "bacaklar" Kaldır ve yaklaşık 1 ¾ inç için üst kesim
   2. Sekiz kuyu dilim tutucu (Şekil 1G) oluşturmak için siyanoakrilat tutkal (örneğin standart Krazy Glue gibi) kullanarak yuvarlak rafın altına Naylon örgü malzeme bir parça yapıştırın. Her iyi tek bir fare hipokampal dilim sığabilir.
   3. Bir kuluçka odacığın bir ucuna ve diğer uçta da Microloader-kollektör cihazı da dilim tutucuyu monte edin. Microloader ipuçları odası katta (Şekil 1H) dinlenmek için izin verin. Bu kurulum üst ve akut hipokampal dilim alt hem yeterli oksijenasyonu sağlamak için, ve kabarcıklar dilim ajitasyon en aza indirmek ve hipokampal dilimleri ile baloncuklar direkt temasını engellemek amacıyla doğrudan dilim tutucu aşağıda gelen önlemek için tasarlanmıştır.
   4. Inkübasyon hücrelerine bir durulayınHer deneyde sonra GKD ₂ O ile iyice d dilim sahipleri ve haftalık% 70 EtOH ile dekontamine. Farklı çözümler dilimleri kuluçka durumunda, birden çok odalar / dilim sahipleri gerekli olacaktır.

2. Çözümler ve İlaçlar

1. Yapay serebrospinal akışkan (ACSF): 125 NaCl, 2.5 KCl, 2.5 _CaCl2, 1.3 _MgCl2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26.0 NaHCO _3, 15: (mM olarak) şu kullanılarak GKD ₂ O standart ACSF 4 L hazırlayın glukoz ve 0.1 Trolox. Bir osmometre kullanılarak solüsyonun osmolaritesini ölçmek; o ~ 310 mOsm gelmelidir. Deneysel koşullar için ACSF bileşimler (Protokol: 3) aşağıda tarif edilmiştir. Otoklava cam şişelerin içine 0.22 mikron şişe üstü filtre kullanarak tüm çözümleri filtre. Solutions bir aya kadar, 4 ° C de stabildir.
2. Dilimleme Tamponu: 125 NaCl, 2.5 KCl, 3.8 MGC: (mM olarak) ihtiva eden bir tadil edilmiş ACSF ile dilimleri hazırlamakl _2, 1.25 NaH ₂ PO _4, 26.0 NaHCO _3, 15 glukoz ve 1.3 askorbik asit. Bir osmometre kullanılarak solüsyonun osmolaritesini ölçmek; o ~ 310 mOsm gelmelidir. Dilimleme tamponunda _MgCl2 ile CaCl ₂ yedek dilim sağlığını geliştirir.
3. Sülforodamin 101 (SR-101, 1 uM), akut hipokampal dilimlerde astrositler tanımlamak için kullanılır. 125 NaCl, 2.5 KCl, 0.5 _CaCl2, 6 _MgCl2, 1.25 NaH _2: (mM olarak), aşağıdaki gibi hazırlanan bir tadil edilmiş, düşük kalsiyum ACSF 100 ml 60.67 mg SR-101 seyreltilerek SR-101, 1 mM stok yapmak PO _4, 26.0 NaHCO _3, 15 glukoz ve 1.3 askorbik asit. Düşük kalsiyum ACSF ozmolaritesi ~ 310 mOsm olduğunu doğrulayın. Yükleme için modifiye düşük Ca ^{2 +} ACSF 1 mM SR-101 Stoku 1.000 kez sulandırmak. 4 ° C 'de son SR-101 çözeltisi saklama ve deney için gerekli olana kadar ışıktan korunur.

3. L ManipülasyonAkut Hipokampal Dilimleri Fiyatlara Atış ong Dönem Nöronal

Uzun süreli nöronal ateşleme oranlarını manipüle ayrı deneylerde iki inkübasyon protokollerden birini kullanın:

1. Nöronal ateşleme inhibe: tetrodotoxin (TTX, 1 mM) inkübe: DİKKAT: yeterli miktarda yutulduğunda ölümcül olabilir gibi dikkatle TTX tutun. Eldiven ve koruyucu gözlük kullanılması tavsiye edilir. TTX tamamen akut dilimleri AP-odaklı nöronal ateşleme ortadan kaldırmaktadır. 3.5 mM K ⁺ ACSF dilimleri inkübe artı deney durumda 1 uM TTX. Kontrol durumda, TTX, 3,5 mM K ⁺ ACSF dilimleri inkübe edin. İki durum arasındaki karşılaştırma Astrositik Gq GPCR'dir aktivite yukarı ölçekleme etkisini ortaya koymaktadır. TTX tedavinin etkisini maksimize etmek için (2.5 mM K ⁺ söylemek karşıt olarak) 3.5 mM K ⁺ ACSF kontrol koşulu olarak hizmet vermektedir.

- VEYA -

2. Yukarıda nöronal ateşleme artırınbazal oyu: yüksek potasyum inkübe: Artan ekstrasellüler K ⁺ konsantrasyonu nöronlar depolarize ve bazal atış hızını artırır. 5.0 mM K ⁺ ACSF inkübasyon anlamlı 2.5 mM K ⁺ ACSF ¹⁵ ile karşılaştırıldığında nöronal aksiyon potansiyeli frekansını yükseltir. Deneysel durum için 5,0 mM K ⁺ ACSF dilimleri inkübe ve kontrol durum için, standart 2.5 mM K ⁺ ACSF dilimleri inkübe edin. İki durum arasındaki karşılaştırma Astrositik Gq GPCR'dir aktivitesinde aşağı ölçekleme etkisini ortaya koymaktadır.

4. Akut Hipokampal Dilim Hazırlık

1. Sıcak kurtarma odasını kurma:
   1. 35 ° C su banyosu ısıtın, daha sonra içinde hazırlanan inkübasyon odaları yerleştirin. Kuluçka odalar (Şekil 1G) içindeki ACSF yüksekliğine kadar su ile su banyosu doldurun.
   2. % 95 O _2,% 5 C ile deney ve kontrol ACSF oksijenO _2. Microloader-kollektör cihazdan yayılan kabarcıklar küçük ve bol ama aynı zamanda nazik olmalı, odasının içinde ACSF görünür bir hareket olmamalıdır.
2. Buz-soğuk diseksiyon odasını kurma:
   1. Buz iki kova alın. Buz bir kovaya dilimleme tampon, yaklaşık 300 ml'lik bir şişe yerleştirin ve% 95 _O2, 20 dakika boyunca% 5 _CO2 ile oksijenli tutun. Hemen buz yüzeyinin altına, diğer bir buz kovası 100 mm Petri kabı, daldırın. Petri kabı yan buz ile doğrudan temas içinde olduğundan emin olun. Petri kabı içine bazı dilimleme tampon dökün ve o da oksijenli tutmak.
   2. En fazla 1 dakika için Petri kabındaki buz gibi soğuk tampon maddesi dilimleme içine daldırarak tek kenarlı bir jilet kesici kenarı soğutun.
3. Vibratome kurulumu:
   1. Vibratome açın ve drenaj kapalı olduğundan emin olun.
   2. Vibratör yılında kesme odasını Güvenlicilt ve kesme odasının etrafında buzla. 0-4 ° C'ye kadar da ön soğutma
   3. Fabrika 5 dakika boyunca% 70 EtOH içine nemlendirici ve ardından ddH2O ile durulama çift kenar jilet greslerini çıkarın. (Bıçak bükmeyin) ve kesme blok üzerine bir yarım bıçak monte dikkatlice yarıya içine kesti.
4. Fare beyin Çıkarma:
   1. Kimwipe veya pamuk içine batırılmış 0.5 ml izofluran ile yüklenmiş bir küçük odasında bir 12-18 gün eski C57BI/6J fare anestezisi. Yavaşça hiçbir ağrı refleks olmadığından emin olmak için hayvanın ayak tutam.
   2. Keskin bir makas kullanarak fareyi Decapitate, daha sonra küçük forseps kullanarak derisini çıkarın. Uzunlamasına fissür boyunca koku ampuller serebellumdan kafatasını kesmek için küçük kemik makas kullanın. Küçük forseps kullanarak kranial kapaklarını çıkarın. Bir spatula ile hafifçe beyin kaldırmak ve Petri kabındaki buz oksijenli dilimleme tampon içine daldırın.
   3. BisecSoğutma ve oksijen için daha fazla yüzey alanı sağlamak için Petri kabındaki soğutulmuş jilet ile fare beyin t. Bisected hemisfer 2-3 dakika buz dilimleme tampon oturalım. Beyin tamamen serin ve daha sağlam hale gelmelidir.
5. Vibratome platformda siyanoakrilat yapıştırıcı ince bir tabaka uygulayın. Ileriye dönük koku ampul ile, platformu kesimli yan-aşağı ve yan tarafları kadar her iki yarımkürede Tutkal. Kesme odası içindeki bir platform elde edin, daha sonra buzlu soğuk ile iyi bir oksijenli dilimleme tampon kesme odasını doldurmak.
6. Vibratome kullanarak 300 mikron kalınlığında dilimler parasagital hazırlarken kesme odasını oxygenating devam edin. 85 Hz bir frekansta dilim kesme, 0.20 / s mm ve 1.40 mm lik bir genlik bir ileri hız. NOT: Sağlıklı akut hipokampal dilim hazırlanmasında tek ve en önemli değişken vibratome kalitesi olduğunu bulduk. Bizim laboratuvar Leica VT 1200 S mıknatıs kullanıric "z" titreşimi azaltmak için vibrocheck ile Vibratome sürücü.
7. Dilimleme sonra, keskin forseps kullanarak her parasagital dilim dışarı hipokampus ve komşu entorinal korteksi teşrih. Vibratome kesme odasında buz gibi soğuk, bol oksijenli dilimleme tamponda bu yordamı gerçekleştirin. Bu dilimleri işlenmesini en aza indirir gibi forseps netlik dilim sağlığı için çok önemlidir.
8. Bir cam Pasteur pipet uzun ucu kopan ve bir pipet ampul ile kırık parçasını tepesi ile bir transfer pipet olun. Bu dilimleri aktarmak için pipet büyük sonu kullanımını sağlar. (Malzemeler tabloya bakınız) geniş sonunda pamuk fişi olmadan pipetler sipariş emin olun. Dilimleri steril olmayan koşullarda hazırlanır gibi, yeni hazırlanmış bir pipet ve her bir deney için kullanılmalıdır, ancak, bu, kullanımdan önce pipet otoklav için gerekli değildir.
9. 35 ° C su içinde kuluçka odalarına her hipokampal dilim aktarmabanyo, dilim sahibinin her bir kuyunun içine ACSF içine transfer pipet daldırma ve dilim aspire. Bu işlem sırasında dilim hareketini en aza indirecek. Yavaş yavaş sıcaklığını yukarı "yokuş" daha kaliteli dilimler halinde sıcak kuluçka banyo sonuçlarına dilimleri doğrudan transferi.
10. Hipokampal dilimler şu şekilde kırılmış 45 dakikalık bir toplam için sıcak su banyosu içinde geri izin verin: yok (düşük kalsiyum ACSF aktarmak, sonra düşük kalsiyum ACSF seyreltildi 1 uM SR-101 in 20 dakika boyunca inkübe edin dilimleri SR-101) 10 dakika boyunca karıştırılır. Daha sonra, sıcak inkübasyon kalan 15 dakika için kontrol etmek için dilim ya da deneysel ACSF aktarın.
11. 45 dakika sıcak kurtarma sonra, dikkatli bir şekilde, tezgah üstüne 35 ° C su banyosu arasındaki kuluçka odaları hareket eder ve daha sonra dilimler bolus-yükleme başlamadan önce 3 saat bir toplam kuluçka süresi oda sıcaklığında inkübe devam etmesine izin protokolü (aşağıya bakınız).

5. Ca ^{2 +} Göstergesi ile Astrositler bolus Yükleniyor

1. Hazırlama Ca ^{2 +} göstergesi bolus yükleme boya:
   1. Boya (50 mg), her şişe, taze dimetil sülfoksit (DMSO) ve iyice vorteks 3.87 ul ekleyin. DMSO tazelik iyi yükleme için önemlidir ve bu nedenle, yeni bir ampul her zaman açık çatlak.
   2. İyice% 20 pluronik asit ve girdap 9 ul karıştırın. 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu için, uygun deney ya da kontrol ACSF ve de vorteks 100 ul boya karıştırın.
   3. Bir santrifüj filtre tüp kullanarak çözüm Filtre. Bu adım, boyanın ejeksiyon sırasında tıkanma gelen yükleme pipet engeller.
   4. Boya çözeltisi ile dolu olduğunda yaklaşık 1.3 MQ arasında bir dirence çekilmiş bir borosilikat cam kılcal bir pipet hazırlayın.
2. Mikroskop ile kullanım için tasarlanmış bir kayıt odasına bir hipokampal dilim koyunve sürekli olarak (1.5 ml / dakika) inkübe edildi, aynı bileşimin oksijen ACSF serpmek. Deney ve kontrol koşulları arasında alternatif bir hipokampal dilim seçilmesi.
3. Sağlıksız görünümlü hipokampal dilimleri atın. Dilimleri kalitesi bile, belirli bir deney içinde değişir. Dilim sağlığını ölçmek için bir dizi kriter vardır, bu nedenle dilim sağlık belirlenmesi subjektif ve çoğunlukla deneyime dayalı olduğunu.
   1. Genel olarak konuşursak, pürüzsüz görünen yüzeyi ve sağlıklı CA1 piramidal hücrelerinde yüksek bir yüzdesini (Şekil 2A) var dilimleri tutmak. CA1 piramidal hücreler bir dilim kabul etme veya reddetme için yararlı bir kriter olabilir bu yüzden sağlıklı CA1 piramidal nöronların büyük bir yüzdesini (≥% 75) sahip olan, özellikle hassas ve CNS hakaret açıktır.
   2. Yaklaşık>% 25 ölü nörona sahip dilimleri atın. Ölü nöronlar kızarmış yumurta gibi bir görünüm (Şekil 2B) var. NOT: Biz hakesme açısı nöronlar sağlıklı veya görünür olsun önemli bir rol oynadığını görülmektedir ettik. Nöronal dendritler (dilimin dışında) yukarı doğru çıkıntı varsa, o zaman nöronlar çoğunlukla ölü olacaktır. Nöron hacminin bu kadar büyük bir kısmı dendritik ağaç içinde ihtiva edildiği için bu kesilmesi dendrit hücreleri için öldürücü olduğu, muhtemelen bir. Dendritler dilim yüzeyinden aşağıya doğru bir açı ile ya da paralel olarak çıkıntı eğer Öte yandan, sağlıklı nöronların oranı yüksek olacaktır. Bazı durumlarda, bu nedenle, nöronlar çoğunlukla dilimin bir tarafında ölü ve diğer tarafta ideal sağlıklı olacaktır.
4. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik kullanılarak boyutu, morfolojisi ve yere göre 40-70 mikron dilim yüzeyinin altında sr astrositlerde uygun bir alan bulun.
5. Boya çözeltisi ile cam pipet yükleyin ve standart yama kelepçe mikroelektrodlu holde kullanarak bu alana yukarıda dilim yüzeyine düşürmekr. Dilim yüzeyinde pipet ile, çıkartma boya başlatmak için pipet geri basınç uygulanır. Boya Fırlatma DIC optik ve böyle bir yeşil boya için 488 hattı olarak uygun bir lazer hem de altında görülebilir.
6. Yavaşça yaklaşık 40 um bir mikro manipülatörü kullanıma dilim yüzeyinin altında pipet alt ve boya, yaklaşık 45-60 saniye boyunca çıkarmak için izin verir. Ardından, pipet ek 35 mikron (dilim yüzeyinin altında 75 mikron) düşürmek ve yaklaşık 45-60 saniye boyunca boya çıkarma. Yavaşça dilim pipet çekin. Uzun enjeksiyon kaydın sinyal-gürültü oranını azaltır arka yükleme, artma eğilimi ise kısa enjeksiyon süresi yetersiz boya yükleme sonuçlanması muhtemeldir.
7. Astrositlerde sayıda boya alma emin olmak için, kısa bir mesafe uzaklıkta ikinci bir boya bolus enjekte genellikle yararlı olur. Geri dilim yüzeyine pipet yükseltmek, pipet tıkalı olmadığından emin olun, daha sonra mostratum radiatumunun merkezi boyunca, yaklaşık 80-100 um uzakta ilk enjeksiyon yerinde pipet ettik. Bu sitede bolus enjeksiyonu tekrarlayın.
8. Boya alma astrositlerde için görüntüleme öncesi ve azaltmak için plan sinyali için 30-45 dakika bekleyin. Bu süre boyunca perfüzyon odasına dilim bırakın. Bu inkübasyon süresi Deneyin toplam 4 saat muamele yerleşik olduğundan emin olun. Sonraki dilim ve tekrar 5,2-5,8 adımları edinin.

6. Hipokampal Dilimleri kayıt Spontan ve Gq GPCR'dir Agonist-uyarılmış Astrositik Ca ^{2 +} Aktivite

1. Görüntüleme için konfokal mikroskop ayarlama:
   1. Yüksek maruz kalma ağartma ve / veya fototoksisite boya yol açabilir gibi lazer ışığına maruz dilim sınırlama, büyük önem taşımaktadır. Yüksek optik büyütme ya da artan bir yakınlaştırma ayarı kullanarak görüntülü alana ışık maruz kalma olasılığını artırır. Bu nedenle, yüksek foto-setting için her lazer için varsayılan değerleri ayarlayıng, 1x kazanç ve% 0.5 lazer çıkış gücü.
   2. Astrosit süreçlerin daha iyi görüntülenmesi için bir 1.5x zoom uygulayın.
   3. Alan çözünürlüğü 512 x 512 piksel olarak ayarlayın.
   4. ~ Tek yönlü tarama modunu kullanarak tarama başına 1.2 saniye olduğu, mümkün olan en hızlı Tarama hızını ayarlayabilirsiniz.
   5. 488 nm lazer için 503-548 nm ve 559 nm lazer için 624-724 nm bant geçiren filtreler kullanılarak emisyon spektrumları toplayın. Bu ayarlar astrocyte hücre gövdeleri ve ana süreçleri gözlemlemek için yeterli bir çözünürlükte nispeten hızlı bir hızda ~ 5-8 astrositlerde bir alanın görüntüleme sağlar. İdeal olarak, bu alanda astrositler açıkça görülecek kadar parlak, ancak herhangi bir piksel doyma olmadan olacaktır.
   6. ⁺ 559 nm lazer kullanarak SR-101 colabeling görselleştirerek astrositler olarak boya ^Ca2 yüklü hücre kimliğini teyit edin.
2. Kayıt astrocyte Ca ^{2 +} aktivite:
   1. Ilgi bölgeler üzerinde görüntü elde etme yazılımı (RO kullanarak kutuları çizmekAstrosit hücre gövdeleri üzerinde, bu durumda, hücre içinde) 'dir. Kutuları mümkün olan en iyi sinyal-gürültü oranı elde etmek için, arka plan piksel içermemelidir. Referans olarak arka plan üzerinde bir kutu çizin.
   2. Deneyin geri kalan kısmı boyunca deney ACSF ve 1 uM TTX (Abcam) için perfüzyon geçin. Bu, herhangi bir olası nöronal AP-odaklı astrosit kalsiyum yanıtları ortadan kaldırır. Astrositik ^{Ca2 +} konsantrasyonundaki artışlar sonra kalan nedeniyle quantal veziküler serbest, konstitütif (bazal) GPCR aktivitesi, veya her iki mekanizma bir kombinasyonu olacaktır.
3. Tüm ROI'ler zaman içinde rekor floresan. Taban floresansta herhangi bir artış sitoplazmik ^{Ca2 +} konsantrasyonu ¹⁶ artış gösterir ve astrositler ^{10, 17, 18} bu nedenle GPCR faaliyet. TTX tarafından Astrositik reseptörleri üzerindeki olası erken ölçeklendirme etkileri önlemek için, 40 dk fr içinde tam deneyleriom süresi 1 mcM TTX perfüzyon başladı.
   1. Spontan Ca ^{2 +} aktivitesinin taban kaydının 10 dk elde edildikten sonra, ardışık, artan konsantrasyonlarda (örneğin, DHPG gibi) söz konusu agonist uygulanır. Mümkün reseptör duyarsızlaştırma azaltmak için uygulamalar arasında 5 dakikalık bir minimum bırakın.
   2. Kaydın sonunda, sağlam astrositik Gq GPCR sinyal yolları için bir pozitif kontrol olarak diğer astrositik Gq GPCRs için agonistler bir kokteyl uygulanır. Agonist kokteyli bileşenleri, söz konusu alıcı bağlıdır. Gq GPCR her birinden 10 uM [H1R], muskarinik asetilkolin reseptörleri [mAChR] ve purinerjik reseptörlerin [P2YR] sırasıyla, yaygın olarak kullanılan bir agonist kokteyl histamin H1 reseptörlerini uyarmak için histamin, karbakol ve 2Na-ATP agonistleri.
4. Post-deney görüntü elde etme:
   1. Ca ^{2 +} kayıt bitiminde, 488 nm ve 559 nm lazerler, f ile fotoğraf çekmekveya astrocyte kimlik ve ROI yerleştirme sonra onay. (Şekil 2A) verileri etkileyen lazer ışık yoğunluğu ile ilgili bir endişe artık olduğu gibi lazer güç ve HV ayarları, ko için optimal bir görüntü elde etmek için bu noktada serbestçe değişmiş olabilir.
5. Tekrar yaklaşık 8 dilimleri ve / grup 40 astrositlerde toplam 6,1-6,3 adımları. Dilimler 3 farklı farelerin az gelmelidir.

7. Astrosit Ca ^{2 +} Faaliyet Analizi

1. Ca ^{2 +} yükselmesi Tanımlanması: ^{2 +} transientleri Ca tanımlanmasında Standardizasyon sıkıca bilimsel topluluk içinde kurulmamıştır. Aşağıda temel gürültü üzerinden yanlış pozitif olayların tespiti sınırlandırarak hassasiyetini maksimize tipik bir protokoldür.
   1. Başka bir laboratuvar üye körü körüne onları analiz etmek için her dilim sayısal bir kod atamak var. Analizin sonunda, her bir dilim deşifre eder.
   2. Çevrimdışı görüntüleme analiz yazılımı kullanılarak spontan ve uyarılmış astrocyte Ca ^{2 +} cepheler analiz. Yeniden çizmek ve / veya büyüklüğü, şekli ve istediğiniz gibi İB'nin yerini ayarlayın.
   3. Bir ^{Ca2 +} yükselmesi olarak taban fazla flüoresan yoğunluğundaki artışı skorlar en yüksek amplitüdü en az iki ardışık numune noktası için ortalama bir taban floresans 30 saniye ortalamasından iki standart sapma (SD) daha büyük ise. Özellikle gürültülü kayıtları (sinyal-gürültü düşük), bu kriterler ortalama bazal floresan üzerinde 3 SD için ayarlanması gerekebilir. Floresan yoğunluğu ortalamasından bir standart sapma aşmadan önce, son olarak her bir veri noktası Ca ^{2 +} yüksekliği başlangıcını tanımlar.
   4. Multipeak vs ardışık tek tepe olayları arasındaki ayrım. Floresan yoğunluğu ve için (ortalama başlangıç ​​değeri +2 SD'nin) başlangıca geri vermiyor, "multipeak" gibi bir olay Skor# 8804; zirveleri arasında 9 ardışık veri noktaları (10.8 sn). Böylece, tek bir pik olaylar arasındaki onları 10 veya daha fazla ardışık temel veri noktası olacaktır.
   5. Floresan yoğunluğu en az 3.6 saniye tepe genliği (tepe değerin ±% 10) tutar zaman "plato" tipi cevapların gibi olayları sınıflandırır.
2. Spontan ve agonist-uyarılmış kalsiyum Transientlerin genlik, frekans, ve kinetik analiz.
   1. ("Multipeak" tepkilerin durumlarda ilk tepe kullanımı, Şekil 2B, bakınız), en yüksek yoğunluk değeri ile veri noktası olarak Ca ^{2 +} yüksekliği tepe genliği tanımlar.
   2. Tepe genlik karşılık gelen tepki başlangıcı ve süresi arasındaki fark olarak yükselme süresini hesaplayın. NOT: 0 ile% 100 artış süresi bir zaman değeri elde etmek için veri noktaları yeterli sayıda olması için kullanılması gerekebilir; hız burada önemli bir değişkendir tarayın.
   3. Gecikme süresi olarak hesaplayıntepki başlangıcı için agonist perfüzyon başlangıcı arasında. Zaman uzun yıkama-in saatleri tepki gecikmeleri hesaplanmasında bir bulandırabilir oluşturmak, beyin dilimleri daha yararlı bir önlem olabilir Rise.
3. Öğrencinin bağımsız t-testi kullanılarak her bir parametre için iki grup arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar olup olmadığını belirlemek. 'N' olarak astrositlerde sayıda kullanın. Kontrol ve tedavi grupları arasında Ca ^{2 +} etkinlik örnekleri karşılaştırmak için Pearson ki-kare testi kullanın. Kontrol ve tedavi grupları arasında belirli Ca ^{2 +} aktivite desenlerinin yüzde karşılaştırmak Fisher 2-kuyruk testi kullanın. * P <0.05, ** p <0.01 olarak farklılıkları ifade eder, ve *** p <0.001.

Sonuçlar

Şekil 3 'de temsil edici sonuçlar sr astrosit Ca ^{2 +} aktivite 4-6 saat boyunca TTX akut fare hipokampal dilimler inkübasyon etkisini göstermektedir. Veri ACSF artı ttx vs kontrol ACSF kuluçkaya dilim kendiliğinden Ca ^{2 +} transientleri ve DHPG-uyarılmış grup I mGluR'daki Ca ^{2 +} tepkilerini, hem de içerir. Temel karakteristik morfolojik özellikleri, stellate süreci montaj ve küçük soma boyutu (~ 10 mikron) dışında, astrositler seçici astrosit işaretleyici SR-101 ^{19 20} ile (Ca ^{2 +} göstergesi KGB-01:00 arasında yayılmasıyla sr tanımlanmıştır Şekil 3A). Astrosit hücre organları üzerinde numaralandırılmış kutular Şekil 3B'de gösterildiği zaman izleri üzerinden numaralı flüoresans tekabül. Grup 1 mGluR agonisti (RS)-3.5-DHPG astrositlerde grup 1 mGluR'leri üzerindeki spesifik ölçekleme etkilerini belirlemek için uygulanır. Fizik arasında ayırımcılıkDiğer Gq GPCRs karşı grup 1 mGluR'lere ölçekleme etkisinin spesifikliği bakımından iology, agonistlerinin bir kokteyl her deney sonunda uygulanır. Burada histamin, karbamilkolin klorür (karbakol) ve adenozin 5'-ATP disodyum (Na-ATP) agonistleri 10 uM Gq GPCR her kullanılır. Agonist kokteyl, aynı zamanda, bu belirli astrositler DHPG bir yanıt ortaya çıkarmak için, reseptörün yeterli miktarda ifade yoktur, çünkü muhtemelen hücreler, DHPG yanıt olmayan durumlarda uygulanabilir, duyarlı astrositler tanımlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet vermektedir.

Biz, astrositik Grup I mGluR'leri değişiklikleri ortaya yardımcı olmak için 5 uM ve 15 uM (Şekil 3B) ve 30 uM ve 50 uM (Şekil 4A) de dahil olmak üzere DHPG farklı konsantrasyonlarda, kullanılır. Hücresel ^{Ca2 +} tepkileri ve Gq GPCR ekspresyon düzeyleri arasındaki ilişki, daha önce in vitro ^21-24 incelenmiştir. İlk olarak,Belirli bir agonist konsantrasyon yanıt için eşik her bir hücre tarafından ifade reseptörlerinin yoğunluğuna bağlıdır. Bir hücre popülasyonunda, daha fazla hücreler hücre reseptörlerinin yüksek yoğunlukları ile transfekte edilir agonistin belirli bir konsantrasyona kadar bir ^{Ca2 +} yükselmesi ile yanıt verir. TTX dilimleri inkübasyondan sonra, popülasyondaki yüzde astrositlerin agonist artar sabit bir konsantrasyonunun (Şekiller 3B ve 3C) yanıt. Bu 30 ve 50 uM DHPG 5,0 mM K ⁺ 'e karşı kontrol tedavi edilen grup I mGluR cevapları karşılaştırmak için gerekli olan ise 5 uM ve 15 uM DHPG, kontrol ve tedavi edilen hücreler arasında TTX duyarlı astrositlerin yüzdesinde belirgin farklılıklar ortaya bulduk hücreleri (Şekil 4A).

Astrositik Ca ^{2 +} yanıtı desen ve agonist konsantrasyonu arasındaki ilişki de yerinde incelenmiştir. Agonist artırılmasıkonsantrasyonu, tek bir tepe noktası Ca ^{2 + 2 +} yükseltiler yükseltiler ^25-27 Ca multipeak ve yayla için ideal astrositlerde Ca ^{2 +} tepkisinin desen kaydırır. Bu önceki bulgulara dayalı olarak, reseptör ekspresyon seviyesinde bir değişiklik olup olmadığını agonistinin tek bir konsantrasyonu için, yanıt modeli kayacak öngördü. Bu durumda, iki ölçekleme yöntemler (ki nöronal iltihaplanmayı önleyen veya artan) da kullanılmaktadır bağlı olarak, özel bir yanıt biçimine üretmek için gerekli agonist konsantrasyonu artırmak veya azalacaktır. Örneğin, TTX kuluçkaya astrositler daha plato-tipi ^{Ca2 +} yükselme için kendi DHPG uyarılmış Ca ^{2 +} yanıt biçimine kayması ve astrositler (Şekil 3C) kontrol ile karşılaştırıldığında daha düşük agonist konsantrasyonu yanıt. Dikkate alarak daha önce yapılan çalışmalar, bu gözlemler, grup I mGluR astrositlerde reseptör ekspresyon seviyeleri artmış olduğunu göstermektedir.

Ca ^{2 +} yükselme süresi ve başlangıç ​​(gecikme) Rise doğrudan kültürlenmiş hücrelerde ^22-24 Gq GPCR ekspresyon düzeylerinde değişikliklere ilişkili olduğu gösterilmiştir. Reseptör yoğunluğu azalma tersi bir etki üretir iken yüksek reseptör ekspresyon seviyeleri daha kısa tepki gecikmeleri ve hızlı yükselme zamanları neden. TTX, Ca kuluçkaya astrositlere için DHPG uygulaması ile uyarılmış ^{2 +} transientler kontrol ACSF (Şekil 3D) kuluçkaya astrositlere karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha hızlı yükselmeye süreleri var. Agonist ile uyandırılmış ^{Ca2 +} tepkilerinin Daha önce de belirtildiği gibi, genlik bağımsız olarak agonist konsantrasyonu ya da ölçekleme modeli ¹⁵ (Şekil 3D) değişmeden kalır.

Doğrudan aktive edici grubunu tarafından gözlenen değişikliklere ek olarak I mGluR'leri DHPG ile, spontan astrosit Ca ^{2 +} aktivitesi önemli ölçüde bu manipülasyon etkilenir. Biz gözlemlemekkontrolüne karşı TTX kuluçkaya kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde da 2.26 kat artış. Bu astrositler (Şekil 3E) kuluçkaya TTX 42,1% 'e soma spontan aktivite sergileyen kontrol astrositlerin sadece% 12,9' den bir artıştır. Bilindiği için bu agonistin ^{21, 26, 28,} yokluğu ve reseptör ekspresyon seviyelerinin arttırılması ile bu iç kaynaklı bir etkinlik düzeyi yükseldikçe, bu veriler, in GPCR'ler sergi "içsel" ya da kurucu etkinlik bu astrositik Gq GPCR'ler yoğunluğu arttıkça nöronal aksiyon potansiyeli ateş uzun vadeli azalma takip. Agonist ile uyarılan yanıtlar benzer şekilde, kendiliğinden Ca ^{2 +} yükselmeler yükselişi zamanlar da (Şekil 3E) artmıştır.

İkinci protokol, yüksek hücre dışı potasyum (5.0 mM) içinde inkübasyon kullanılarak Örnek veri, Fi gösterilmiştirGüre 4. Hücre dışı K ⁺ bazal CA3 nöron hareket potansiyeli frekansı ¹⁵ önemli bir artış olarak 2.5-5.0 mM sonuçlarından bir artış. DHPG (30 uM ve 50 uM) Daha yüksek konsantrasyonları yüksek potasyum (Şekil 4A ve 4B) içinde kuluçkalanmıştır astrositlerden Grup I mGluR ^{Ca2 +} tepkilerini uyarılması amacıyla gerekli bulunmaktadır. Bu nöronal aksiyon potansiyellerinin uzun süreli artış aşağıdaki astrositlerde Grup I mGluR yanıt azaltılmış bir seviyesi ile tutarlıdır. Buna ek olarak, DHPG bir sabit konsantrasyonuna karşı tepkisi model zayıf tek tepe tepkiler (Şekil 4B) plato-benzeri yanıtlardan geçer. İki potasyum koşullarda kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesini incelenmesi, yüksek K ⁺ kuluçkaya az astrositler kontrol koşulu (Şekil 4C) ile karşılaştırıldığında kendiliğinden etkin olduğunu ortaya koymaktadır. Bu etki, buna zıt olanSpontan Ca ^{2 +} yükseltiler sergileyen astrositlerin yüzdesi artar edildiği TTX durumun e yönü. Son iki uyarılmış ve kendiliğinden olan ^{Ca2 +} yükselme kontrol koşulu (Şekil 4C ve 4D) karşı yüksek K ⁺ kuluçkaya astrositlerde yavaş bir yükselme süresine sahip. Genel olarak bu veriler, astrositik Gq GPCR ekspresyon seviyeleri iki-yönlü şekilde uzun bir süre boyunca hareket potansiyeli nöronal aktivitenin seviyesine bağlı olarak ölçeğe düşündürmektedir.

Şekil 1. Dilim inkübasyon odası imalat ve ayarlayın. (A), hava geçirmez bir kapak ile birlikte bir Brinkmann pipet saklama kabının çekmece kısmı dilim inkübasyon odası oluşturmak için kullanılır. (B) Düst kabın yaklaşık 1 ¼ tarafında bir delik ve dere ¼ olarak taraftan. Esnek bir boru parça olarak monte edin. (C), esnek boru iç ucuna Microloader-manifold tertibatı bağlayın. Not cut-to-fit doğal 200 ul pipet ucu (beyaz ok). (D) Altı 20 ul Eppendorf microloaders cut-to-fit olan bir bir-altı satır manifolduna bir Microloader-kollektör cihazı oluşturmak için. (E) kapağı üzerinde iki küçük delik açın. (F) dilim tutucu yapmak için bir Yüzer Kabarcık Raf. (G) naylon örgü malzeme parçası tabanına yapıştırıldı, böylece kayan kabarcık rafın alt "bacaklar" kaldırılır. (H) ACSF yeterli bir miktarı ile inkübasyon odası doldurun dilim tutucu yüzer böylece. Microloaders uçları odasının katında bir köşesinde dinlenme böylece boru uzunluğunu ayarlayın. Inkübasyon odası yerleştirirkensu banyosu, banyo içindeki su seviyesi odası içindeki ACSF ile aynı seviyede olması gerekir. büyük resim görüntülemek için.

Şekil 2. Dilim sağlık Tahmini. (A) diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik kullanan sağlıklı görünümlü hipokampal dilim. Sağlıklı dilimler pürüzsüz, kadifemsi bir görünüm ve sağlıklı CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi var. Stratum radiatumunun merkezi içine çıkıntı apikal dendrit edin. Burada gösterilenler gibi bakmak nöronların Patch-kelepçe birkaç spontan aksiyon potansiyelleri ile standart 2.5 mM K ⁺ ACSF düşük istirahat membran potansiyeli (-61 -62 mV) ortaya koymaktadır. Membran potansiyeli ve ateşleme hızları eski bir fonksiyonu olarak değişirekstrasellüler K ⁺ (Xie et al. ^15). Oklar varsayılan astrositlere etmektedir. Kısaltmalar: sr, stratum radiatum; s.py., stratum pyramidale. Ölçeği bar, 10 mikron. (B) Sağlıksız dilim kızarmış yumurta (beyaz oklar ölü nöronların çekirdekleri işaret - kızarmış yumurta "yumurta sarısı") olarak görünüme sahip ölü CA1 piramidal nöronlar yüksek bir yüzdesi, sahip olacaktır. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Şekil 3,. Gq GPCR aktivitesi amplifiye edilmiş ve TTX kuluçkaya bırakılır, nöronal AP uzun süreli önlenmesi sonra uyarılmış Grup I mGluR ^{Ca2 +} tepkileri kayıt. (A) kayıt alanında hücre Örnek görsel c inkübeontrol Oregon Yeşil-BAPTA 01:00 Ca ^{2 +} Gösterge boya (sol panel) ve SR-101 (orta panel) almış koşulları (üst panel) veya ttx (alt paneller) içinde. Ölçek çubuğu 10 mikron. Her iki sinyallerin Yerleşimi ("birleştirme") Ca ^{2 +} göstergesi olduğunu astrositlere yükü gösterir. Kutular astrositlerde Ca ^{2 +} etkinliğini izlemek için yeşil kanal zamanla floresan yoğunluğu kaydetmek için bireysel astrocyte soma üzerine çizilir. Astrositlerde Ca ^{2 +} aktivitesinin A kayıt kutularından (B) Örnek izleri). Yanıtın desen değişiklikler ile kanıtlandığı gibi TTX göstermek kuluçkaya Astrositler spontan aktivite artar ve daha sağlam bir uyarılmış grup I mGluR ^{Ca2 +} tepkileri. Tek bir tepe (daire), multipeak (dikdörtgen), ve plato (noktalı dikdörtgen) örnekleri Ca ^{2 +} transientler gösterilmiştir. Cevap desenler (C) değişiklikler, farklı konsantrasyonu derişimi kullanılarak, özellikle belirgindirgrup I mGluR'daki agonist DHPG rasyonlarına. Daha multipeak ve yayla yanıtları belirli bir agonist konsantrasyonu kontrol grubuna kıyasla TTX inkübasyondan sonra belirgindir. Genlikleri (alt panel) değişiklik yok iken (D) "ya hep ya hiç" yanıtı genliklerinin göstergesi, kontrol (üst panel) göre ttx kuluçkaya astrositlerde hızlı DHPG-uyarılmış Ca ^{2 +} tepkilerin kez edilmektedir Rise kez cevap eşik ulaşıldı. (E) kendiliğinden astrosit süreleri Rise Ca ^{2 +} geçici popülasyondaki astrositlerin yüzdesi kendiliğinden Gq GPCR Ca ^{2 +} etkinliği artar (alt panel) sahip iken, astrositler (üst panel) kuluçkalanmıştır aynı zamanda daha hızlı olarak kontrol TTX genel kuluçkalanmıştır. Daha büyük resmi görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4. Yüksek bir hücre dışı potasyum kuluçkaya bırakılır, nöronal AP için uzun süreli kayıt artarak azalan astrositik Gq GPCR aktivitesi ve uyarılmış Grup I mGluR ^{Ca2 +} tepkileri. (A) 5.0 mM K ⁺ ACSF kuluçkalanmıştır kesitlerden astrosit Ca ^{2 +} kayıtların Örnek izleri nöronlar depolarize ve ACSF (2.5 mM K ⁺ ACSF) kontrol karşılaştırıldığında bazal atış oranını artırmak için. 5.0 mM K ⁺ ACSF sergi daha az spontan somatik Ca ^{2 +} geçici ve zayıf DHPG ile kuluçkaya Astrositler kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere göre tepkiler. (B) DHPG birden konsantrasyonlarda uyarılmış yanıtların kalıplarının karşılaştırılması nöronal AP uzun vadeli yükselişin ardından daha zayıf tepki türleri ortaya koymaktadır. Po astrositlerin yüzdesi olarak (C) bir azalmaspontan aktivite yükselmesi kat daha yavaş (alt panel) olmak ise kendiliğinden Ca ^{2 +} aktivite sergileyen pulation, yüksek K uzun süreli kuluçkadan sonra gözlenen ⁺ ACSF (üst panel) kontrol etmek için karşılaştırılır. (D) DHPG değişik konsantrasyonlarda uyarılmış astrosit süreleri Ca ^{2 +} tepkileri Rise kontrol ACSF kuluçkaya astrositlere kıyasla 5.0 mM K ^+, tedavi sonrasında daha yavaş olur. resmi büyütmek için buraya tıklayın.

Tartışmalar

Tarif ölçeklendirme modelleri Astrositik grup mGluR'lerinin uzun vadeli plastisite araştırmak için pratik yöntemleri temsil eder. Görüntüleme spontan ve uyarılmış Ca ^{2 + olaylar,} sağlam kanıtlar astrosit Ca ^{2 +} yükselmeler Gq GPCR'dir aktivasyon ¹⁰ mansap IP ₃ R-duyarlı mağazalardan salıverilmesinin ardından meydana tespit edildiği gibi, Astrositik Gq GPCR'dir aktivite değişiklikleri ölçmek için hassas bir tahlil sağlar ^{12, 17, 18.} Nüfus astrositlerin yüzdesi grup I mGluR agonisti ve bu ^{Ca2 +} tepkilerinin desen yanıt astrositler tarafından Grup I mGluR'leri değişiklikleri rapor etmektedir.

Ca ^{2 +} göstergesi ile astrositler yüklemek için kullanılan özel teknik, astrositik Gq GPCR aktivitedeki değişiklikler için deney tasarımında önemli bir husustur. Bolus-yükleme veya toplu yükleme birden astrositleri, veya pBireysel astrositlerin atch klemp yükleme astrositlerde görüntü Ca ^{2 +} geçici için kullanılabilir. Her yaklaşımın bazı avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Doğrudan yama kelepçe ile Ca ^{2 +} göstergeli astrositler doldurma gibi SR-101 gibi sekonder bir marker için gerek kalmadan bir astrosit olarak hücrenin açık belirlenmesini sağlar. Göstergenin Patch-kelepçe teslimat da hücreler sağlıklı dilim ve sinapsların (mevcut lazer gücüne bağlı olarak) daha sağlam etkileşimler ile potansiyel derin gür ince süreçlerin, dahil olmak üzere küçük Astrositik bölmelerden Ca ^{2 +} aktivite kayıt sağlar. Veriler her seferinde bir hücre toplanır Ancak, patch-clamp yükleme düşük verim uğrar. Bulk-yükleme, aksine, astrositlerin, çok sayıda Ca ^{2 +} göstergesi ile yüklenir ve aynı anda görüntülü sağlar. Ancak, astrositler yüzeye yakın dilimin (<20 um) bağlı bir endişe ile yüklenirhücre sağlığı ve sağlam sinapsların hakkında s.

Burada sunulan backpressureyi bolus yükleme protokolü nispeten yüksek verim ve dilim (40-75 mikron) içindeki derin Ca ^{2 +} etkinliğini izlemek için yeteneği ile, bir orta yol sunuyor. Bolus yükleme tekniği kullanılarak kendiliğinden aktif astrositlerin yüzdesinde önemli bir artış ve nöronal sinapsların, astrositik proseslerde arasındaki bağlantı ¹⁵ daha eksiksiz olduğunu düşündürmektedir, kütle-yük ile karşılaştırıldığında görülmektedir. Iyi bir yükleme ile, sık sık 2-foton mikroskopi kullanılarak astrositler (veriler gösterilmemiştir) veya potansiyel olarak daha da küçük bölmelerin ana işlemlerinde Ca ^{2 +} etkinliğini izlemek için. Ancak, bakım sınırları spesifik olmayan arka plan boyama içine karıştırmak gibi, belirli bir astrosit için küçük süreçleri atama icra edilmesi gerekir. Kütle-yük ya da yükleme bolus prosedürlerin kullanılması ile ek bir sorun, bir ikinci mar için ihtiyaçastrosit tanımlanması için ker. Bu, tercihen astrositler Ca ^{2 +} göstergeleri AM ester almak birçok yıldan beri bilinmektedir olsa da, ikinci işaretleyici SR-101, genellikle astrositler olarak yüklenmiş hücreler doğrulamak için kullanılır. SR-101 kendi nöronların ^29'un iç heyecanlanma değiştirebilir. SR-101 kullanımı sinirsel uyarıların mümkün SR-101 etkilerini sınırlamak için ttx tüm astrocyte Ca ^{2 +} ölçümleri gerçekleştirmek için ihtiyaç corroborates. Kontrol ve deney grubu hem de SR-101 dahil olduğu varsayılarak, tek başına markör nöronal aksiyon potansiyellerinin, uzun süreli manipülasyona aşağıdaki astrosit Ca ^{2 +} sinyal gözlenen etkilerin hesaba olmamalıdır. O 2,5 mM K ⁺ vs arasındaki farkı azaltabilir olarak SR-101, ancak, yüksek K ⁺ deneylerde bir endişe daha fazla olabilir 5.0 mM K ⁺ bazal ateşleme hızı orantılı değilse.

Ca ^{2 +} sunmak için çok umut verici bir yaklaşım Astrositlere gösterge Ca ^{2 +} boyalar kullanarak daha geleneksel yaklaşımlara cazip bir alternatif sunduğu son zamanlarda ortaya çıkmıştır. Önemli gelişmeler astrositlere ^30-32 hedeflenen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GeCIS) ile son yıllarda yapılmıştır. GeCIS hipokampus gibi ilgi konusu bir beyin bölgesine adeno-ilişkili viral vektörler in vivo mikroenjeksiyon ile astrositler teslim edilebilir. GeCIS ekspresyonu viral enfeksiyon ³² takip eden yaklaşık iki hafta sonra elde edilir. Astrositlerde GeCIS kullanılmasıyla sunulan pek çok avantajı vardır. İlk olarak, vektör, bir astrosit-özgü promoteri kullanılarak astrositleri hedef, bu etiketlenmiş hücrelerin astrosit ³² vardır. İkincisi, sinyal-gürültü ama şimdi hücrede ³² bir yama pipet geçirdiğine invaziflik olmadan, boya yama kelepçe teslim kullanılarak elde edilebilir ne karşılaştırılabilir görünüyor. Üçüncü olarak, göstergeler del olabilirivered ve toplu yükleme dağıtım yöntemlerini kullanarak sorunlu yetişkin doku olarak ifade edilmiştir. Ayrıca, ifade birden astrositlere arasında ayrım yeteneği sunan mozaik olduğunu. Aynı zamanda soma ve ince branchlets kayıt Böylece, çeşitli potansiyel olarak astrositler, eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu nedenle, potansiyel olarak tek bir tekniği büyük ölçüde verimliliği artırarak, astrositik Gq GPCRs ölçekleme aktivitesini kaydetmek için üç ayrı teknikler (toplu yükleme, bolus-yükleme ve patch-kelepçe yükleme) yerine kullanılabilir.

Astrositlere Ca ^{2 +} göstergelerin viral aracılı teslim kullanarak bir potansiyel dezavantajı dilim sağlık ³² olası etkisidir. GeCIS sunmak için kullanılan adeno-ilişkili viral vektörler astrositlerin ³³ arasında reaktif gliozis neden olduğu daha önce gösterilmiştir. Genel olarak beyin dilimleri hazırlanması muhtemel enf sürümü de dahil olmak üzere patoloji erken aşamalarında başlatırlammatory ¹⁰ molekülleri. Bu nedenle, GeCIS kullanımı viral vektörler kullanılarak teslim astrositik reseptörlerinin ölçekleme indüklemek için gerekli olan uzun inkübasyon süreleri, deney ile birlikte bu tür dilim sağlık bağlamında ek dikkate almak gerekir.

Bu protokolü kullanarak, bu bir yanıt üretmek için agonist için uygulama süresi reseptör durumu bir fonksiyonu olarak değişir akılda tutmak önemlidir. Agonistin, belirli bir konsantrasyonu için, uygulama süresi reseptörleri küçültülmüş ve daha kısa olması durumunda reseptörlerin bir Ca ^{2 +} üretmek için yeterli reseptörleri aktif hale getirmek için yeterli bir doku konsantrasyonu elde etmek üzere, ilaç için, yukarı ölçeklenmiş daha uzun olması gerekir yanıtı. Bu nedenle, ilaç uygulama süreleri ve potansiyel konsantrasyonları, ölçekleme amaçlanan yönüne bağlı olarak ayarlanması gerekebilir. Örneğin, agonist konsantrasyonu c düşürülebilir gerekebilirTTX ve ase yanıtları doyurarak önlemek, ve hatta bir yanıt görmek için yüksek K ⁺ dilimleri beklettikten sonra artmış. Özel olarak, DHPG konsantrasyonu 5-15 uM genellikle güvenilir yanıtları üretmek için çok düşük olduğu gibi, ^{Ca2 +} cevabı desen çalışması için 5.0 mM K ⁺ tedavi sonrası 30-50 uM TTX tedavi sonrası 5-15 uM kaymıştır grup mGluR'lerinin küçültmeden sonra astrositlere.

Astrosit Ca ^{2 +} faaliyet kaydı plazma zarına veya ikinci reseptör ekleme ya da interne etme doğrudan bir kanıt sağlar. Ancak, Gq GPCR'dir ifade seviyeleri ve spontan arasında doğrudan bir ilişki incelenmiş ve Ca ^{2 +} geçişlerini ^21-24, Ca ^{2 +} değişikliklerin en mantıklı yorumunu uyarılmış vitro önceki çalışmalarından elde edilen veriler ile veri olağanüstü benzerliğe göre sinyal astrosit yüzey reseptör ekspresyon seviyeleri olmasıdırdeğiştirdi. Bir Ca ^{2 +} aktivitesi üzerindeki etkisi mahaline hakkında ek delil sağlamak istiyorsa bir tamamlayıcı bir yaklaşım önemli bir husus olabilir. Biz kullanılan bir strateji Astrositik MrgA1R farelerin hipokampal dilimleri TTX inkübasyon etkisini araştırmaktır. Bu transgenik fareler, sadece astrositlerde yabancı Gq GPCR (MrgA1R) ifade eder. Bu reseptör beyne yerel olduğu için, aktivitesi düzeylerini değiştirmek için mevcut herhangi bir endojen nörotransmiter yoktur. Önceki çalışmalar bu reseptör aynı astrositler ³⁴ endojen Grup I mGluR'leri olarak sinyal molekülleri ile aynı hücre içi angaje önerdi. TTX in MrgA1R farelerden dilimlerinin sonra uzun süreli inkübasyon, yavru kontrole kıyasla agonist ile uyarılan MrgA1R yanıtlarında bir fark, dilimler astrosit üzerindeki etkisi Ca ^{2 +} aktivitesi yüzey reseptörüne lokalize değişiklikler nedeniyle olduğuna dair kanıt sağlayacak kuluçkalanmıştır Özellikle grup I mGluR'daki cevapları hala anlaml iseicantly aynı astrositler geliştirilmiştir. Alternatif bir, belki daha fazla yer strateji sürece bir membran fraksiyonu yüzey reseptör ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler için analiz edilebilir olarak, Western blot analizi için kesitlerden izole astrositler olacaktır bile. Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) veya akım sitometri burada yararlı olabilir.

Nöronların çalışma için bu tekniğin olası uygulamaları, astrositler ve astrosit-nöronal etkileşimleri çoktur. Deneylerde, sadece DHPG uyarılmış grup I astrositik ^{Ca2 +} tepkileri çocuk farelerden izole, akut hipokampal dilimlerde, mGluR çalışıldı. Bu hazırlık, sağlam afferentleri (Schaffer kollateral), ama aynı zamanda onları (CA3 piramidal hücreler) doğuran nöronlar vardır mümkün postsinaptik hücreleri (CA1 piramidal hücreleri) üzerine bu Glutamaterjik nöronların ateşleme oranlarını manipüle yapma ve sadece olan işlemler associat stratum radiatum astrositlerBu sinapsların ile e. Akut hipokampal nöronlarının dilim diğer tip ateşleme oranlarını değiştirmek için en iyi preparat olabilir, bununla birlikte, pek çok afferentler onlara yol nöronların koparılır. Bununla birlikte, diğer astrositik Gq GPCR alt tiplerinin plastisite gözlemlemek için bazı slice preparatlarda mümkün olabilir. Örneğin, dilim sağlam hipokampta bazal ön beyin kolinerjik nöronlarının ve projeksiyonları ile hazırlanabilir. TTX veya yüksek K ^+, bu dilimlerin Kuluçka kolinerjik giriş ¹ önemli bir kısmını almak stratum Oriens'in astrositlerde, içinde mAChRs'sini ölçeklendirilmesidir açan, kolinerjik nöronlar bazal ateşleme oranlarını etkileyecektir. Alternatif bir ölçekleme oluşur, TTX bir salıverilme plast implantasyonu ile elde edilir bir in vivo model kullanmak olabilir bozulmamış tüm bağlantıları ile beynin belirli bir alanda astrositik reseptör ölçekleme, çalışma henüz denenmemiş bir yaklaşımic polimer Elvax 40W ilgi ³⁵ bölge üzerindedir. Bu yaklaşım nöronal ölçekleme bir çalışmada daha önceden kullanılmış olan ama aynı zamanda Astrositik ölçekleme için geçerli olmalıdır. Son olarak, uygun okuma ile, gelecekteki çalışmalarda G _ler ya da G _i GPCRs değişiklikler dahil olmak üzere diğer GPCR'dir aileleri, incelemek olabilir. Bir _i GPCR'ler lokal olarak herhangi bir dilim hazırlık içinde GABA internöronlardan projelendirme ateş engellenmesi aşağıdaki etkilenecek Astrositik GABA _B G tahmin olabilir. Böyle ikinci haberci cAMP bir gerçek zamanlı gösterge olarak diğer sinyal molekülleri hedefleyen yeni göstergeler geliştirilmesi, nöron-to-astrosit reseptör iletişim araştırma tamamen yeni bir alan açmak istiyorum.

Bazal nöron atış oranları manipülasyonu ile astrositik mGluR'lerin Çift yönlü ölçekleme nörotransmitter AP-aracılı serbest bırakmak için astrositlerin duyarlılık bir ölçüsünü sağlar. Astrositler görünüşte kendiliğinden APleri ve glutamat hissedebiliyorumekstrasellüler K ⁺ fizyolojik bir aralıkta olsa Schaffer kollateral-CA1 piramidal hücre sinapslarında te bırakma. TTX akut uygulama kendiliğinden astrosit sıklığını astrositik reseptörleri AP dedektörleri olduğuna dair kanıtlar temin Ca ^{2 +} aktivitesi ^{18, 36, 37, 36} olur ilintisiz popülasyondaki astrositler arasındaki Ca ^{2 +} aktivitesi, azaltmaz iken. Bu astrocytes hiçbir genel Ca ^{2 +} aktivite üzerindeki etkisi ile spontan nöronal APleri anlamda düşündürmektedir. Bu yaygın IP ₃ hücre içi konsantrasyonları tespit edilebilir bir ^{Ca2 +} yükselmesi yol açmak için yeterli IP ₃ Rs teşvik etmek için bir eşik seviyesine ulaşmak için ihtiyaç olduğu kabul edilmektedir. Spontan nöronal AP ölçülebilir Ca ^{2 +} yükselmeleri üretmeden Astrositik GPCR'ler aktive misiniz? Gelecek çalışmalar Floresan Rezonans Enerji Transferi (FRET) veya benzer bir techn kullanmak olabilir alıcısına G protein bağlama (reseptör aktivasyonunun bir ölçütü) ve iç depolar Ca ^{2 +} bırakılması arasındaki ilişkinin incelenmesi için (örneğin, BRET gibi) ique. Bu teknoloji, bozulmamış doku preparasyonlarda kullanıma hazır olmadan önce bir süre olabilir, ancak BRET, G protein-to-GPCR kuplajı ^38, in vitro olarak tespit etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu Astrositik Gq GPCR'ler çok daha sık mevcut Ca ^{2 +} görüntüleme araçlarını kullanarak kaydedilebilir daha aktive ediliyor mümkündür. Aksiyon potansiyelleri algılama ek olarak, astrositik Gq GPCR'ler da bir çalışmada ³⁹ de belirtildiği gibi nörotransmiter minyatür quantal salınımını tespit etmek mümkün olabilir. Burada anlatılan iki yönlü ölçekleme yöntemi Astrositik Gq GPCR'ler kuluçka protokolde bafilomisin A1 dahil ederek nörotransmiter quantal veziküler salınımını tespit ölçüde bir ölçü sağlamak için gelecekteki çalışmalarda kullanılabilir.

Astrositik reseptör ölçekleme de yetişkin farelerden elde edilen doku kaynaklı olabilir eğer ntent "> Bugüne kadar, ölçeklendirme protokolleri sadece çocuk farelerin (p12-p18) hipokampal dilimleri kullanılmıştır. Dolayısıyla halen bilinmemektedir. bir zorlayıcı yeni bir çalışma astrositlerde grup I mGluR'daki ifade çağın ilk haftadan sonra önemli ölçüde azalır ve yetişkin astrositlerde ⁴⁰ reseptör ifadesi çok düşük seviyelerde, yetişkinliğe kadar azalmaya devam ediyor. Bu nedenle Astrositik mGluR'ler aşağıdaki büyütmek olmadığını belirlemek için ilginç olacağını gösteriyor uzun genç farelerin astrositlerde görülen yaklaşan düzeylere yetişkin fare hipokampal dilimleri nöronal ateşleme süreli engellenmesi. Bu bulgu Astrositik reseptör ifadenin belirli bir yaşta statik değil, nöronal aktivitenin seviyelerine bağlı olarak hızla değişebilir öneririz. aksine yetişkin farelerde grup mGluR'lerinin azaltılmış ifadesi, delil dahil & # o adrenerjik reseptörleri ortaya çıkıyor945; _{1A, 2A} α ve β alt tipleri _1, ağırlıklı olarak, yetişkin beyin ^{3, 4 ve} astrositler tarafından ifade edilmiştir. Α _1A adrenerjik Gq GPCR'dir bu reseptörlerin adrenerjik nöron ateşleme hızlarındaki değişikliklere duyarlı olup olmadığı dahil nöron-to-astrosit iletişimin gelecekteki çalışmalar için çekici bir hedef olabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chamber Supplies
Brinkmann pipette storage container	Fisher Scientific	03-491	Use the drawer portion as the incubation chamber
Electrical drill
Flexible tubing	Tygon	R-3603
Silicone seam sealant			Also called aquarium seam sealer
Gas tank			95% oxygen, 5% carbon dioxide
Natural beveled pipette tip	USA Scientific	1111-1000	Cut-to-fit to connect oxygenate lines
One-to-six lines manifold	Warner Instruments	64-0210 (MP-6)	For the microloader-manifold apparatus
Microloader	Eppendorf	5242 956.003	For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit
Floating Bubble Rack	Bel Art Scienceware	F18875-0400	For slice holder
600 µm Sefar Nitex Nylon mesh	ELKO Filtering Co.	06-600/51	For slice holder
Krazy Glue			For slice holder
Reagents
Isoflurane	Baxter	1001936060
NaCl	Fisher	S271-3
KCl	Fisher	P333-500
CaCl2	Fisher	C79-500
MgCl2	Fisher	M33-500
NaH2PO4	Fisher	S369-500
NaHCO3	Fisher	S233-500
Glucose	Fisher	Fisher
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)	Acros Organics	53188-07-1
Ascorbic acid	Acros Organics	401471000
Tetrodotoxin citrate (TTX)	Abcam	ab120055
Sulforhodamine 101 (SR-101)	Sigma-Aldrich	284912
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D128-500
Pluronic Acid F-127	Invitrogen, Molecular Probes	P6867
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)	Invitrogen, Molecular Probes	O6807
(RS)-3,5-DHPG	Abcam	ab120020
Histamine	Sigma-Aldrich	H7125
Carbamoylcholine chloride (Carbachol)	Sigma-Aldrich	C4382
Adenosine 5’-ATP disodium (Na-ATP)	Sigma-Aldrich	A7699
Dissection Tools
Single-edge razor blade	GEM	62-0161	For bisection
Double edge razor blade	TED PELLA, INC.	121-6	For cutting slices
Mayo Scissors, supercut	WPI	14010-15	For decapitation
Fine iris scissors, straight	Fine Science Tools	14094-11	For cutting the skull
Iris forceps, curved	WPI	15915	To remove the skin and skull
Small spatula			To remove/transfer the brain
Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps	Fine Science Tools	11295-10	For hippocampus dissection
Glass Pasteur pipette	Fisher	13-678-20B	For transferring brain slices
Pasteur pipette rubber bulb	Fisher	03-448-22	For transferring brain slices
Polystyrene 100 mm tissue culture dishes	Corning	25020
Vibratome	Leica	VT 1200S
Water bath	Fisher	ISOTEMP 210	For warm incubation
Micropipette puller	Narishige	PC-10	For bolus-loading pipette
Confocal microscope	Olympus	Olympus Fluoview 1000
Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform	Warner Instruments	RC-26GLP	diamond bath with low profile
Borosilicate glass pipette	World Precision Instruments	TW150F-4	For bolus-loading pipette
Micromanipulator	Sutter Instrument	ROE-200	For bolus-loading pipette
Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 µm cellulose acetate	Costar	8161