İnsan Pluripotent için alternatif Kültürleri Hücre Üretim, Bakım ve Genetik Analizi Kök

Özet

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Özet

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Giriş

Multilinaj yetişkin dokulara doğru ayırt etmek hPSCs kapasitesi kardiyovasküler, hepatik, pankreatik ve nörolojik sistemleri ^1-4 içeren ciddi hastalıklardan muzdarip hastaların tedavisinde yeni yollar açtı. HPSCs türetilen çeşitli hücre tipleri de hastalık modelleme, genetik mühendisliği, ilaç tarama ve toksikolojik test ^1,4 için sağlam hücresel platformlar sağlayacaktır. Onların gelecekteki klinik ve farmakolojik uygulamaları sağlayan temel konu, in vitro hücre kültürü yoluyla klinik dereceli hPSCs çok sayıda nesil. Ancak, mevcut kültür sistemleri koloniler ^5,6 olarak hPSCs çeşitli besleyici ve besleyici ücretsiz kültürleri içeren, yetersiz ya da doğal olarak değişken ya vardır.

HPSCs erken hisse memeli embriyoların iç hücre kütlesinin (ICM) birçok yapısal özelliği de koloni tipi büyüme. ICM üç germ-tabaka halinde ayırt eğilimliheterojen olması nedeniyle sinyal degradelerin varlığının bir çok hücreli bir ortamda. Bu nedenle, erken dönemde embriyo gelişimi içinde heterojenite edinimi farklılaşması için gerekli bir süreç olarak kabul edilir, ancak hPSC kültür istenmeyen bir özelliktir. HPSC kültür içinde heterojenite nedeniyle genellikle optimal büyüme koşulları aşırı apoptotik sinyallerin ve kendiliğinden farklılaşma tarafından indüklenir. Bu nedenle, koloni tipi kültür, heterojen hücreleri genellikle kolonilerin ^7,8 periferinde gözlenmektedir. Aynı zamanda, insan embriyonik kök hücre (HESC) in hücreleri, ^{BMP-4, 9} gibi sinyal moleküllerine sergi farklı yanıtlar kolonilerinin gösterilmiştir. Ayrıca, koloni kültürü yöntemleri nedeniyle kontrol edilemeyen büyüme oranları ve apoptotik sinyal ^6,9 yolaklar düşük hücre verimi yanı sıra kriyokorunması çok düşük hücre kurtarma oranları üretmek. Son yıllarda çeşitli süspansiyon kültürleri, kültürleme hPSCs için Partikül geliştirilmiştirbesleyici-ve matris içermeyen koşullar ^6,10-13 içinde hPSCs büyük miktarda genişletilmesi için as ı. Açıkçası, farklı kültür sistemleri kendi avantajları ve dezavantajları var. Genel olarak, hPSCs heterojen doğası genetik mühendisliği ⁶ hPSCs içine DNA ve RNA malzemeleri bırakmak için optimal olan koloni tipi ve toplanmış kültür yöntemleri en önemli dezavantajları, birini temsil eder.

Açıkçası, mevcut kültür yöntemleri bazı eksikliklerini aşmak yeni sistemler geliştirmek için bir zorunluluk ihtiyaç vardır. Tek hücre canlılığını artırmak (örneğin ROCK inhibitörü Y-27632 ve JAK inhibitörü 1 gibi) küçük molekül inhibitörleri keşifler ayrışmış-hPSC kültür ^14,15 için yol açmıştı. Bu küçük moleküllerin kullanımı ile, son zamanlarda non-koloni Çeşidi ayrışmış-hPSCs ⁹ (NCM) büyüme göre bir kültür yöntemi geliştirdik. Bu yeni kültür yöntemi tek hücreli pasajlanmasını ve yüksek yoğunluklu hem birleştiriryöntemleri kaplama bize majör kromozom anomalili ⁹ olmaksızın tutarlı bir büyüme çevrimleri altında homojen hPSCs büyük miktarlarda üretmek için izin. Seçenek olarak ise, NCM kültür geniş uygulamalar için kültür yöntemi optimize etmek amacıyla, farklı küçük moleküller (örneğin laminins gibi) gibi tanımlanmıştır matrisler ile uyarlanabilir. Burada, biz NCM kültürüne dayalı birçok ayrıntılı protokoller sunmak ve genetik mühendisliği için detaylı prosedürler tasvir. NCM protokollerin yönlülüğünü göstermek için, biz de farklı ROCK inhibitörleri ile ve tek laminin izoformlu 521 (yani, LN-521) ile NCM kültürü test.

Protokol

HPSCs tek hücre tabanlı olmayan koloni tipi tek tabaka (NCM) kültürü.

1.. Hazırlıklar

1. % 10 FBS, 2 mM L-glutamin, ve 0.1 mM temel olmayan amino asitler (NEAA) ile takviye edilmiş DMEM ortamı: fare embriyonik fibroblastlar (MEF'ler) ve kültür ortamının 500 ml olun.
2. Fare embriyonik fibroblastlar DMEM ortamı içinde% 0.1 jelatin kaplı 6 oyuklu hücre kültürü plakasının üzerinde rutin bir protokol ¹⁶ ve Kültür MEF'ler sonra CF1 suşundan türetilmiş (MEF'ler) hücreleri izole edin. Alternatif olarak, ticari kaynaklardan pasaj 3'de MEF hisse senedi satın.
3. Matrigel tabak hazırlayın.
   1. Bir -20 ° C dondurucu içinde% 50 küçük parçalar halinde 5 (~ 4 ° C'de soğutulmuş) DMEM/F12 ortamı ml ve mağaza ile HESC nitelikli Matrigel stoklar 5 ml seyreltin. Bir buzdolabı (~ 4 ° C) O / N donmuş Matrigel stok çözülme ve daha fazla (% 2.5 'çalışma konsantrasyonuna neden vermek üzere), soğuk DMEM/F12 ortamı içindeki Matrigel seyreltin.
   2. oyuk başına 1.5 ml 2.5% 'si Matrigel ile kaplayın 6 oyuklu hücre kültürü plakaları, soğutma O / N kaplanmış plakalar saklamak (Not: 2 hafta içinde Matrigel kaplı plaka kullanın).
   3. Plaka 10 ile 30 dakika boyunca hücre kültürü kaputu (Not: Bir hücre kültürü inkübatör plaka sıcak değil) içinde oda sıcaklığında ısıtın, buzdolabından Matrigel plakasını çıkarın ve aspirat DMEM orta önce hPSCs kaplama için.
4. 500 ml HESC orta edin:% 80 DMEM/F12 ortamı,% 20 KSR, 2 mM L-glutamin, 0.1 mM temel olmayan amino asitler, 0.1 mM β-merkaptoetanol ve 4 FGF-2 ng / ml.
5. ,% 60 FBS,% 20 DMSO ve mTeSR1 ortamı içinde 20 uM Y-27632, filtrasyon ile sterilize ve 1 hafta içinde ortamını kullanmak: 2X hPSC dondurma ortamı 10 ml hazırlayın.

. 2. Protokol 1 (Temel): yemlikler üzerine hPSC Kolonileri büyütün

1. Tutarlı resul almak için hPSC kültür için 5 veya 6 (P5 ve P6 olarak adlandırılan) at MEF pasaj numaraları kullanınts. Mitotik 37 ° C'de 3 saat boyunca 10 ug / ml mitomisin C ile hücrelerin işlemden geçirilmesi ile MEFS inaktive, yıkama hücreler, 1X Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS) ile 3 kez ve daha sonra 0.53 mM% 0.05 tripsin ile MEFS ayırmak EDTA. Alternatif olarak, bir X-ışını ışınlama ile 8000 rad bir dozda MEFS ışın.
2. Mikroskop altında Trypan Blue leke çıkarma yöntemi kullanılarak hücre sayısı sayılır. Alternatif olarak, otomatik bir hücre sayacı kullanmak.
3. 6-yuvalı polistiren plakaları üzerine Plate ışınlanmış MEF'ler oyuk başına 1.88 x 10 ⁵ hücre (örneğin, 1.96 x 10 ⁴ hücre / ^cm2) bir yoğunlukta% 0.1 jelatin ile kaplanmıştır. 37 ° C'de inkübe edin ve hücreleri,% 5 _CO2 24 saat karıştırıldı.
4. Pasteur pipeti (: bu zamanda gerekli hiçbir yıkama adımları Not) aspirasyon ile MEF kültür ortamı çıkarın.
5. Küçük öbekler halinde önceki kültürden öğütün hPSC koloniler, fr değişen boyutlarını sağlamak için mikroskop altında incelemek topaklarom 50 çaplarda um ila 100, ve de hPSC ortamının 2 ml birinde MEF besleyici tabakalarının üstüne hPSC kümeleri plaka.
6. Herhangi bir morfolojik değişmiş veya farklılaşmış kolonileri (~% 5) işaretlemek, fotoğraf tarafından 3 ila 5 gün, kayıt koloni büyüme için HESC orta günlük değişim, ve elle bir Pasteur pipeti ile hafifçe aspirasyon ile işaretlenmiş koloniler çıkarın.
7. Iki MEF'ler kalan koloniler (2 dakika D-PBS ile her biri) yıkayın ve 2 ml 1 mg / 10-30 dakika boyunca hPSC ortamı içinde ml kollajenaz IV) ile inkübe koloniler ve ikinci hPSC kolonilerin kopmasını incelemek MEF-kaplanmış yüzey (Not: koloniler sıkıca plakasına bağlı olan yalnızca dekolmanı sürecine yardımcı olmak için bir kazıyıcı kullanın).
8. , Bir 15 ml tüp enzimatik reaksiyonlar, transfer koloniler en aza indirmek hPSC koloniler oda sıcaklığında 3-5 dakika boyunca tortu olanak sağlar ve c doğrudan görselleme yoluyla kolonilerin tortulaşmayı sağlamak için her bir oyuğa hPSC orta 5 mltüpün altındaki arşın (Not: Bu aşamada tüp santrifüj değil).
9. Kalıntı MEFS içeren süpernatantlar çıkarın ve tek hücreler ayrışmış, HESC 5 ml ortam ile tekrar süspansiyon koloniler ve iki kez sedimantasyon adımı tekrarlayın.
10. Hücre geçiş için bir 6-plaka üzerine (1 de dondurulmuş vialde konflüent) ya da levha dondurulması için orta (veya CryoSTORE CS10 donma orta) dondurma 1X hPSC küçük topaklar, mağaza içine orta, çiğnemek hPSC koloniler çıkarın.

3 Protokol 2:. NCM'ye için hPSC Kolonileri yemlikler dönüştürme

1. , Bir kere daha D-PBS içinde hPSC pelet, 10 dakika boyunca çalkalayın 1X Accutase 1 ml ile inkübe granül ve tek hücreli ayrışmasını sağlamak için bir mikroskop altında enzimatik reaksiyonu inceleyin.
2. Yavaşça Y-27632, 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 200 x g'de santrifüj ile ve ardından 10 uM içeren mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri asılı enzimatik reaksiyonları sonlandırma(Hücre hasarına neden aşırı santrifüj kuvvetleri kullanmak istemiyorum, Not).
3. Topağa mTeSR1 orta 5 ml, tek bir hücre olarak pelet tekrar süspansiyon ve filtre, bir 40 mikron hücre süzgecinden (herhangi bir artık hücre birikimlerin çıkması için) üzerinden hücreleri ayrışmış.
4. Bir kuyu içine tohum 1.3-2 x 10 ⁶ hPSCs% 2.5 HESC nitelikli Matrigel ile kaplanmış bir 6-yuvalı plakanın (1.4-2.1 x 10 ⁵ hücre / cm ^2), 2,5 ml kadar mTeSR1 orta ekleyin ve 10 uM içerir bir ortam içinde Y-27632 (ilk 24 saat, tek hücreli bir kaplama kolaylaştırmak için). 1 uM Y-39983 (I inhibitör ROCK), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitörü), 1 uM thiazovivin (yeni bir ROCK inhibitörü): Seçenek olarak ise, geliştirme, tek hücreli bir kaplama için 10 uM Y-27632 değiştirmek için aşağıdaki küçük moleküller kullanmaktadır ve 2 uM JAK önleyici 1.
5. (24 saat içinde), bir sonraki gün ilaçsız mTeSR1 ortam ile orta yerine, ilave bir ila hücreleri ayırmakiyi ve tek hücreli kaplama etkinliğini belirlemek için, hücre sayısını (Not: yaklaşık olarak bu aşamada elde edilebilir, tek hücreli bir kaplama verimliliğinin 50-90%).
6. Hücreler mTeSR1 ortam 3 ml ile bir kaç gün için tek hücreli bir şekillendirilmiş tek katman olarak çoğalmıştır izin verin. Günlük orta değiştirin.
7. Ampirik hücre yoğunluğuna bağlı olarak adapte NCM pasaj yapmak için takvimi belirlemek. Hücre büyümesi 3 gün veya günde 4 izdiham, ya da hücre-hücre sınırlarının kaybolması sonra 4 saat zaman noktasında ulaşır Passage. Bir 1-3 bölme oranını (örneğin, 6 oyuklu plakanın yuvaları içinde plaka 3 hücrelerinin konfluent 1) hücre geçiş için kullanın Accutase 1 ml hücreleri ayırmak ve 5 kısım tarafından adapte NCM stabilize.
8. Hücre dondurma
   1. Bir dondurulmuş şişe için, bir konfluent kuyu (~ 5-6 x10 ⁶ hücre) kullanmaktadır: de, 10 dakika boyunca Accutase 1 ml bir konfluent hücreler çözülür.
   2. W sulandırmakith 5 yukarıda tarif edildiği gibi mTeSR1 orta ve santrifüj hücre ml.
   3. MTeSR1 ortamının 500 ul pelet yeniden süspanse edin ve daha sonra yavaş yavaş, bir kriyokoruma şişe içinde (20 uM Y-27632 ihtiva eden) 2X hPSC dondurma ortamı içinde 500 ul ekleyin. Seçenek olarak ise, 10 uM Y-27632 ya da 2 ya da uM JAK önleyici 1 varlığında, 2 uM JAK inhibitörü 1 veya 1X CryoStor CS10 ortam içeren 1X hPSC dondurma ortamı içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
   4. Bir buz soğutulmuş cryocontainer (isopranol ile alt-dolu) içine dondurulmuş şişeleri yerleştirin ve hemen -80 ° C dondurucu cryocontainer aktarın.
   5. Uzun süreli dondurulması için (bir sonraki günde) bir sıvı azot tankına -80 ° C dondurucu transfer hücreleri.
9. Hücre çözdürme
   1. 6-plaka 1 kuyu kaplama için bir dondurulması flakon yararlanın.
   2. 2 dakika için aynı su banyosu içerisinde 10 dakika, erime hücreler için bir 37 ° C su banyosu içinde önceden sıcak mTeSR1 ortamı,damla damla 10 uM Y-27632 içeren önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamın 5 ml hücreleri ekleyin ve yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj.
   3. Yavaşça 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortam 2 ml hücre topakları tekrar süspansiyon ve yavaş yavaş da iyi Matrigel ile önceden kaplanmış hücreleri transferi (Not: hava kabarcıkları üretmek kaçının).
   4. Günlük orta değiştirin ve hPSC büyüme günde 3 veya 4 de izdiham ulaşmasını bekliyoruz.

4 Protokol 3:. NCM Kültür Matrigel hPSC Kolonileri dönüştürün

1. , Buzdolabı bir Matrigel kaplı plaka çıkarmak 10-30 dakika boyunca doku kültürü kaputu levhayı, plakanın her gelen orta kaldırmak ve de her bir önceden ısıtılmış mTeSR1 ortamının 2 ml ekleyin.
2. Aktarım Yukarıdaki Matrigel plakasına besleyici kültür (temel protokol Adım 2.10) için hPSC kümeleri ezilerek karıştırıldı. Her bir 2.5 ml nihai hacme kadar mTeSR1 orta ekleyin.
3. 3-4 gün için her gün ortam değiştirmekoloniler kadar s% 80-90'ını izdiham ulaşmak.
4. Hücre geçirilmesi için: iki kez D-PBS ile durulayın kolonileri 15-20 dakika boyunca 37 ° C 'de 2 mg / ml dispase 1 ml ile hücrelerin tedavi ve topaklar halinde sediment ve geçiş hücreleri.
5. NCM kültürü için: 3,1-3,9 Protokol 2'de anlatılan adımları tekrarlayın.

5 Protokolü 4:. Üzerine hPSCs NCM Kültür LN-521

1. Kullanım bir gün önce, 4 ° C 'de rekombinant LN-521 çözeltisi çözülme ve bir son konsantrasyon için (Ca ^{2 +} / ^{Mg2 +} ihtiva eden) 1X D-PBS ile çözülmüş laminin seyrelterek laminin kaplama çözeltisi (LCS) yapmak 10 ug / ml.
2. (: Kuru-out kaplama işlemi sırasında önlemek not) 6 oyuklu bir plaka içerisinde birine LCS 1 ml ilave edilir.
3. Buharlaşmasını önlemek ve buzdolabında (4 ° C) O / N (: 1 hafta içinde plaka kullanmak notu) olarak plaka saklamak için Parafilm ile kaplanmış plaka mühür.
4. Yavaşça olmadan bir Pasteur pipeti ile LCS çıkarınkaplanmış yüzeyi uching ve iyi birine mTeSR1 orta 2 ml ekleyin.
5. 25 dakika için bir 37 ° C su banyosunda (D-PBS dahil) tüm kültür çözümler ısıtın.
6. HPSC koloniler NCM'ye dönüştürme
   1. Protokol 2 de tarif edildiği gibi Accutase ile tek bir hücre için hücre agregatları ayrıştırmaları.
   2. Bir tohum içine 1.3-2 x 10 ⁶ hPSCs iyi LN-521 kaplı (1.4-2.1 x 10 / cm ^{2 5} hücreleri) ROCK inhibitörlerinin varlığı olmadan.
   3. 3-4 gün boyunca her gün ortam değiştirin.
   4. Bir 1-3 bölme oranını kullanarak bir sonraki hücre geçiş için günde 3 ya da 4 ° C'de Accutase 1 ml hücreleri ayırmak.

. 6 Protokol 5: Kültür NCM Plasmid DNA Transfeksiyonu için

1. 4 Protocols 2'de tarif edildiği gibi kültüre NCM hPSC koloniler uyum.
2. Levha 10 uM Y-2763 mevcudiyetinde mTeSR1 ortamı içinde ⁵ hücre / oyuk 10 x 7.5 'lik bir hücre yoğunluğunda 12 oyuklu bir plaka içerisinde hPSCs ayrışmış2.
3. Hücreleri kaplama yapıldıktan sonra 4-8 saat arasında ilaç içermeyen mTeSR1 orta mTeSR1 orta yerine.
4. Her bir transfeksiyon için, (örneğin, pmaxGFP) ekspresyon plazmidleri 2.5 ug seyreltilmiş ve 125 ul Opti-MEM her ayrı Eppendorf tüpleri içinde Lipofectamine 2000 5 ul serum Orta azalır.
5. 5 dakika sonra, seyreltilmiş reaktifleri karıştırmak ve oda sıcaklığına (transfeksiyon kompleksler oluşturmak üzere) 20 dakika boyunca inkübe edin.
6. 1 ml mTeSR1 ortam içinde içeren her hPSCs için 250 ul transfeksiyon kompleksi ilave edin ve 24 saat boyunca bir _CO2 inkübatör içinde 37 ° C'de hücreleri inkübe edin.
7. Flöresanlı bir mikroskop ve gerçek transfeksiyon verimliliğinin hesaplanması için rasgele fotoğraf altında transfeksiyon verimi inceleyin.

. 7 Protokol 6: NCM Kültür microRNA Transfaksiyon için

1. 6'da oyuk başına Accutase 1 ml ilave etmek suretiyle NCM koşullar altında 2 gün yarı-birleşik hPSCs ayrıştırmaları Oyuklu plaka.
2. 5 dakika boyunca 200 x g enzimatik reaksiyonlar ve santrifüj seyreltilmesi mTeSR1 ortamı 10 ml ilave edilir.
3. , MTeSR1 orta hücre pelletini 10 uM Y-27632 içeren mTeSR1 ortamı içinde bir 12-çukurlu plaka içinde gözenek başına 7.5 x 10 ⁵ hücre yoğunluğunda hücreler tohum ve hücreler, 4 saat boyunca birleşmeye izin verin.
4. Y27632-ücretsiz mTeSR1 orta orta yerine.
5. Piyasada mevcut microRNA (örneğin, Dy547 ile etiketlenmiş olmayan bir hedefleme miRIDIAN miRNA Transfection Denetimi) kullanın. Sağlanan reaktifler kullanılarak 0-160 nM arasında değişen konsantrasyonlarda titre ve üreticinin talimatlarını izleyin.
6. Transfeksiyondan 24 saat sonra bir mikroskop altında canlı hücre Dy547 flüoresan görüntüleme ile hPSC çizgilerle her bir konsantrasyonu için transfeksiyon verimi optimize.
7. Görüntülenen tüm hücreleri üzerinde Dy547 pozitif hücrelerin yüzdesi göre transfeksiyon verimliliği hesaplayın.

. tle "> 8 Protokol 7: Lentiviral Vector İletim için NCM Kültür

1. Tekrar Protokol'ün 6 7,1-7,4 adımları.
2. Transdüksiyon için kullanılacak viral parçacıkların miktarda hesaplayın: aşağıdaki formül kullanılır: TU = TU birimlerinin dönüşüm toplam sayıları temsil eder, oysa (MOI CN x) / VT, MOI kuyunun (İB veya enfeksiyon arzu edilen çok sayıda eşittir TU / hücre), her bir oyuğa CN hücrelerin sayısını belirtir ve VT stok viral titreler (TU / ml) göstermektedir. Örneğin, SMART-shRNA vektörü için hazır viral titresi (bir ml için dönüştürme birimleri) 1 x 10 ⁹ TU / ml eşit olduğu göz önüne alındığında, 7.5 x 10 ⁵ transdüksiyon anda oyuk başına hücre ve 20 beklenen bir MOI: 15, kullanımı her bir kuyu için stok viral parçacıkların ul (not: Bu durum geçici Lentiviral indüksiyon için tavsiye edilir).
3. 30 dakika boyunca polibren 10 mg / ml 'lik mTeSR1 ortamının önceden sıcak 300 ul.
4. Stok viral parçacıkların 15 ul içine ekleyinönceden ısıtılmış mTeSR1 orta polybrene ihtiva eden ve çözelti yavaşça karıştırın.
5. Viral parçacıkları içeren, önceden ısıtılmış ortam 300 ul hücre kültür ortamı değiştirin.
6. 4 saat inkübe edildikten sonra, iletim etkinliğini belirlemek için turboGFP floresan (shRNA ekspresyonu için bir yapıcı) inceleyin.
7. Hücreler turboGFP ifade başladığınızda iyi Transdükleme ek mTeSR1 orta 300 ul ekleyin.
8. 12-16 saat inkübasyondan sonra, turbo-GFP ifade yeniden gözden.
9. 72 saat içinde bu transdüksiyona hücrelerle istenen takip deneyler.

Sonuçlar

NCM kültürünün genel bir şema

Şekil 1, bu ROCK inhibitörü Y-27632 varlığında, yüksek yoğunluklu tek hücreli sonra kaplama hPSCs dinamik değişiklik gösteren tipik bir NCM kültür şemasını temsil etmektedir. Bu morfolojik değişiklikler, hücre kümeleri oluşumu kaplama ve hücre yoğunlaştırma ile ve ardından üssel hücre büyümesi (Şekil 1A) sonra hücreler arası bağlantıları vardır. Temsili deney 1. günde ...

Tartışmalar

Konvansiyonel (besleyiciler veya hücre dışı matrisler üzerinde hücrelerin) koloni tipi kültür ve besleyiciler ⁶ olmadan agrega olarak hPSCs süspansiyon kültürü: in vitro kültür hPSCs iki ana yolu vardır. Koloni tipi ve süspansiyon hem kültür yöntemleri sınırlamalar birikmiş heterojenliği ve kalıtsal epigenetik değişiklikleri içerir. NCM kültür, tek hücreli bir pasaj ve yüksek yoğunluklu bir kaplama her iki hücre göre, ^6,18 hPSC büyüme için yeni bir kül...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System	Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL	Model RX-650	X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates	Becton Dickinson Labware	353046	Polystyrene plates
DMEM	Invitrogen Inc.	11965–092	For MEF medium
Mitomycin C	Roche	107409	Mitotic inhibitor
Trypsin	Invitrogen Inc.	25300-054	For MEF dissociation
DMEM/F12	Invitrogen Inc.	11330–032	For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Invitrogen Inc.	31985-062	For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS	Invitrogen Inc.	16000–044	Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement	Invitrogen Inc.	10828–028	KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140–050	NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030–081	Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements	StemCell Technologies	5850	Animal protein-free
TeSR2 & Supplements	StemCell Technologies	5860	Xeno-free medium
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Component of hPSC medium
MEF (CF-1) ATCC	American Type Culture Collection (ATCC)	SCRC-1040	For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel	BD Bioscience	354277	For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521	BioLamina	LN521-02	Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)	R&D Systems, MN	223-FB	Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I	EMD4 Biosciences	420099	An inhibitor of Janus kinase
Y-27632	EMD4 Biosciences	688000	ROCK inhibitor
Y-27632	Stemgent	04-0012	ROCK inhibitor
Y-39983	Stemgent	04-0029	ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane	Stemgent	04-0030	ROCK II inhibitor
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer	BD Bioscience	352340	40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C	Thermo Scientific	C6516F-1	“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000	Invitrogen Inc.	11668-027	Transfection reagents
DharmaFECT Duo	Thermo Scientific	T-2010-02	Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control	Thermo Scientific	IP-004500-01-05	Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs
SMART-shRNA	Thermo Scientific	To be determined	Lentiviral vector
pmaxGFP	amaxa Inc (Lonza)	Included in every transfection kit	Expression plasmid for transfection control
Oct-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-21702	Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-21704	Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60	Santa Cruz Biotechnology	sc-21705	Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81	Santa Cruz Biotechnology	sc-21706	Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8020	Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein	Santa Cruz Biotechnology	sc-8399	AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9187	FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)	Thermo Scientific	MS-295-P0	Mouse IgG1
Desmin	Thermo Scientific	RB-9014-P1	Rabbit IgG
Anti-NANOG	ReproCELL Inc, Japan	RCAB0004P-F	Polyclonal antibody
Rat anti-GFAP	Zymed	13-0300	Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)	Cedarlane Laboratories Ltd.	CL2513A	Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)	DakoCytomation Inc	IR611/IS611	Mouse IgG2a
Nestin	Chemicon International	MAB5326	Rabbit polyclonal antibody
TUBB3	Convance Inc	MMS-435P	Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)	Cell Signaling Technologies	3113	Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA, fixative, diluted in D-PBS