Alternative Kulturen für menschlichen pluripotenten Stammzellen Produktion, Wartung und Genetic Analysis

Zusammenfassung

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Zusammenfassung

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Einleitung

Die Kapazität der hPSCs in Richtung multilineage adulten Geweben differenzieren hat neue Wege zur Behandlung von Patienten, die an schweren Krankheiten, Herz-Kreislauf-, Leber-, Pankreas-und neurologischen Systeme beinhalten leiden ^1-4 eröffnet. Verschiedene Zelltypen aus hPSCs abgeleitet würde auch robust Mobilfunk-Plattformen für Krankheit Modellierung, Gentechnik, Arzneimittel-Screening, und toxikologische Prüfungen ^1,4. Die zentrale Frage, die ihre zukünftigen klinischen und pharmakologischen Anwendungen gewährleistet, ist die Erzeugung einer großen Zahl von klinischem hPSCs durch in-vitro-Zellkultur. Allerdings sind die aktuellen Kultur-Systeme entweder unzureichend oder von Natur aus variabel, die verschiedene Feeder und Feeder-freien Kulturen hPSCs als Kolonien ^5,6.

Colony-Typ-Wachstum von hPSCs teilt viele Strukturmerkmale der inneren Zellmasse (ICM) der frühen Säugetierembryos. Das ICM ist anfällig für in die drei Keimblätter zu differenzierenin einem multizellulären Umgebung, weil die Existenz von heterogenen Signalverläufe. So wird die Übernahme von Heterogenität in der frühen embryonalen Entwicklung als eine erforderliche Verfahren zur Differenzierung betrachtet, aber eine unerwünschte Eigenschaft hpSC Kultur. Die Heterogenität in hpSC Kultur wird oft durch übermäßige apoptotische Signale und spontane Differenzierung aufgrund suboptimaler Wachstumsbedingungen induziert. Somit wird in Kolonie-Typ-Kultur, die heterogenen Zellen werden oft in der Peripherie der Kolonien ^7,8 beobachtet. Es hat sich auch gezeigt, dass die Zellen in menschlichen embryonalen Stammzellen (hES) Kolonien zeigen Differential Antworten auf Signalmoleküle wie ^BMP-4-9. Darüber hinaus Kolonie Kulturmethoden produzieren geringe Zellausbeuten als auch sehr niedrige Zellgewinnungsraten von Kryokonservierung aufgrund unkontrollierbarer Wachstumsraten und apoptotische Signalwege ^6,9. In den letzten Jahren sind verschiedene Suspensionskulturen zur Züchtung hPSCs entwickelt, particulArly für die Expansion von großen Mengen von hPSCs in Feeder-und Matrix-freien Bedingungen ^6,10-13. Offensichtlich haben unterschiedliche Kultursysteme ihre eigenen Vorteile und Nachteile. Im Allgemeinen ist die Heterogenität der hPSCs stellt eine der wichtigsten Nachteile in Kolonie-Typ und aggregierte Kulturverfahren, die optimal für die Bereitstellung von DNA-und RNA-Materialien in hPSCs Gentechnik ⁶ sind.

Klar, es ist eine zwingende Notwendigkeit, neue Systeme, die einige Mängel der derzeitigen Kulturmethoden zu umgehen, zu entwickeln. Die Entdeckungen der niedermolekularen Inhibitoren (wie der ROCK-Inhibitor Y-27632 und JAK-Inhibitor 1), die Einzelzellüberleben verbessern ebnen den Weg für dissoziiert-hpSC Kultur ^14,15. Mit der Verwendung dieser kleinen Moleküle, haben wir vor kurzem ein Kulturverfahren auf der Basis nicht-Kolonietyp (NCM) Wachstum von dissoziierten hPSCs ^9. Diese neue Kulturverfahren kombiniert die beiden Single-Cell-Passage und High-Density-Plating Verfahren, so dass wir große Mengen von homogenen hPSCs unter konsistenten Wachstumszyklen ohne große Chromosomenanomalien ⁹ zu produzieren. Alternativ könnte NCM Kultur mit verschiedenen kleinen Molekülen und definierten Matrizen (wie Laminin), um das Kulturverfahren für breite Anwendungen zu optimieren implementiert werden. Hier auf der Basis NCM Kultur, präsentieren wir mehrere detaillierte Protokolle und abzugrenzen detaillierte Verfahren für die Gentechnik. Um die Vielseitigkeit der NCM-Protokolle zeigen, testeten wir auch NCM Kultur mit vielfältigen ROCK-Hemmer und mit der Single Laminin-Isoform 521 (dh, LN-521).

Protokoll

Einzelzell-basierte nicht-Kolonie Typ Monoschicht (NCM) Kultur der hPSCs.

1. Vorbereitungen

1. Machen 500 ml Medium für die Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF): DMEM-Medium mit 10% FBS, 2 mM L-Glutamin und 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren (NEAA) ergänzt.
2. Isolieren embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF-Zellen) aus dem CF1-Stamm nach einer Routine-Protokoll ¹⁶ und Kultur MEFs auf 0,1% Gelatine beschichtete 6-Well-Zellkulturplatte in DMEM-Medium abgeleitet. Alternativ kaufen MEF Aktien bei Passage 3 von kommerziellen Ressourcen.
3. Bereiten Matrigel Platten.
   1. Verdünnen Sie 5 ml hESC qualifizierte Matrigel Lager mit 5 ml DMEM/F12-Medium (bei ~ 4 ° C gekühlt) und speichern 50% Aliquots in einem -20 ° C Gefrierschrank. Tauen Sie das gefrorene Matrigel Lager im Kühlschrank (ca. 4 ° C) O / N und weiter zu verdünnen das Matrigel in kaltem DMEM/F12-Medium (bis zu einer Arbeitskonzentration von 2,5% zu geben).
   2. Mantel 6-well-Zellkulturplatten mit 1,5 ml 2,5% Matrigel pro Well, speichern Sie die beschichteten Platten im Kühlschrank O / N (Hinweis: Verwenden Sie die Matrigel-beschichtete Platte innerhalb von 2 Wochen).
   3. Entfernen Sie die Matrigel Platte aus dem Kühlschrank, damit die Platte bei RT in der Zellkultur Haube für 10 bis 30 min (Anmerkung: nicht die Platte in einem Zellkulturbrutschrank nicht warm) zu wärmen, und saugen DMEM Medium vor hPSCs Beschichtung.
4. Machen 500 ml HES-Medium: 80% DMEM/F12 Medium, 20% KSR, 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 0,1 mM β-Mercaptoethanol und 4 ng / ml FGF-2.
5. Bereiten Sie 10 ml 2X hpSC Gefriermedium: 60% FBS, 20% DMSO und 20 uM Y-27632 in mTeSR1 Medium, durch Filtration sterilisieren und nutzen das Medium innerhalb 1 Woche.

. 2 Protokoll Nr. 1 (Basic): Wachsen hpSC Kolonien auf Feeders

1. Verwenden MEF Passage Zahlen bei 5 oder 6 (als P5 und P6 bezeichnet) für hpSC Kultur, um eine einheitliche Resul bekomments. Mitotisch inaktiviert MEFs durch Behandlung der Zellen mit 10 ug / ml Mitomycin C für 3 h bei 37 ° C, wäscht die Zellen 3x mit 1X Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (D-PBS) und dann dissoziieren MEFs mit 0,05% Trypsin in 0,53 mM EDTA. Alternativ bestrahlen MEFs in einer Dosis von 8000 rad mit einer Röntgenbestrahlungsvorrichtung.
2. Graf Zellzahlen mit Hilfe der Trypanblau-Ausschlussverfahrens Fleck unter dem Mikroskop. Alternativ können Sie eine automatische Zellzähler.
3. Platte bestrahlten MEFs auf 6-Well-Polystyrol-Platten mit 0,1% Gelatine in einer Dichte von 1,88 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung (dh 1,96 × 10 ⁴ Zellen / cm ²⁾ beschichtet. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C und 5% CO ₂ für 24 Stunden.
4. Entfernen Sie die MEF Kulturmedium durch Aspiration mit einer Pasteur-Pipette (Hinweis: keine Waschschritte in dieser Zeit nötig).
5. Man reibt hpSC Kolonien aus früheren Kultur in kleine Klumpen, untersuchen Sie die Klumpen unter dem Mikroskop auf ihre Größen, die fr gewährleistenom 50 bis 100 &mgr; m Durchmesser, und die Platte hpSC Klumpen auf der Oberseite der MEF-Feeder-Schichten in einem Well mit 2 ml hpSC Medium.
6. Ändern hESC Medium täglich für 3 bis 5 Tage, Koloniewachstumsrekord von Fotografie, markieren Sie alle morphologisch veränderten oder differenzierte Kolonien (~ 5%), und von Hand mit einer Pasteurpipette entfernen Sie die markierten Kolonien durch vorsichtiges Absaugen.
7. Spülen der verbleibenden Kolonien auf MEFs zweimal (jeweils mit D-PBS 2 min), und Inkubieren der Kolonien mit 2 ml 1 mg / ml Collagenase IV in hpSC Medium für 10 bis 30 min), und prüft die Ablösung hpSC Kolonien aus der MEF-beschichteten Oberfläche (Hinweis: Verwenden Sie einen Schaber, um die Ablöseprozess helfen nur dann, wenn die Kolonien dicht an der Platte befestigt).
8. 5 ml hpSC Medium zu jeder Vertiefung zur enzymatischen Reaktionen Übertragungs Kolonien auf 15 ml-Röhrchen zu minimieren, damit hpSC Kolonien für 3 bis 5 min bei RT sedimentiert und stellen die Sedimentation von Kolonien durch direkte Visualisierung des cEllen an der Unterseite des Rohres (Anmerkung: nicht die Rohrzentrifuge bei diesem Schritt).
9. Entfernen Sie die Überstände, Rest MEFs und Einzelzellen dissoziiert, suspendieren die Kolonien mit 5 ml Medium hESC und zweimal wiederholen Sie den Schritt Sedimentation.
10. Entfernen Sie die mittlere, verreiben hpSC Kolonien in kleine Klumpen, lagern in 1X hpSC Gefriermedium (oder CryoStore CS10 Einfrieren mittel) für die Kryokonservierung (1 konfluenten gut gefroren pro Flasche) oder Platte auf einem 6-Well-Platte für Zell Passagieren.

3 Protokoll Nr. 2:. Konvertieren hpSC Kolonien von Futtertröge zu NCM

1. Spülen hpSC Pellets in D-PBS einmal brüten die Pellets mit 1 ml 1X Accutase für 10 min, und untersuchen die enzymatische Reaktion unter einem Mikroskop auf Einzelzell Dissoziation zu gewährleisten.
2. Enden die enzymatischen Reaktionen durch vorsichtiges Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium mit 10 mTeSR1 uM Y-27632, gefolgt von Zentrifugation bei 200 · g bei RT für 5 min(Beachten Sie, verwenden Sie keine übermäßige Zentrifugation Kräfte, die Zellschäden verursachen.)
3. 5 ml mTeSR1 Medium zu dem Pellet, das Pellet als Einzelzellen und Filter dissoziierten Zellen durch ein 40 &mgr; m Zellsieb (um restliche Zellaggregate zu entfernen).
4. Seed 1,3-2 x 10 ⁶ hPSCs in ein gut (1,4 bis 2,1 x 10 ⁵ Zellen / cm ²⁾ einer 6-well-Platte mit 2,5% hESC qualifizierte Matrigel beschichtet, fügen mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml, und beinhalten 10 uM Y-27632 im Medium (die ersten 24 h Einzelzell-Beschichtung zu erleichtern). Alternativ nutzen Sie die folgenden kleinen Molekülen bis 10 uM Y-27632 für die Verbesserung Single-Cell-Beschichtung ersetzen: 1 uM Y-39983 (ROCK I-Inhibitor), 1 uM phenylbenzodioxane (ROCK II-Inhibitor), 1 uM thiazovivin (ein Roman ROCK-Inhibitor) und 2 uM JAK-Inhibitor ein.
5. Ersetzen Sie das Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium am nächsten Tag (innerhalb von 24 Stunden), distanzieren Zellen von einem zusätzlichengut, und zählen die Zellzahl auf Einzelzell Plattierungseffizienz bestimmen (Anmerkung: etwa 50 bis 90% der Single-Cell-Beschichtung Effizienz, die in dieser Phase erzielt werden kann).
6. Lassen Sie die Zellen als Einzelzellen-Monoschicht gebildet wird für ein paar Tage mit 3 ml mTeSR1 Medium wachsen. Ändern Medium täglich.
7. Empirisch bestimmen den Zeitpunkt einer Passage angepasst NCM in Abhängigkeit von der Zelldichte. Passage, wenn das Zellwachstum erreicht Zusammenfluss am Tag 3 oder Tag 4 oder im 4 h Zeitpunkt nach dem Verschwinden der Zell-zu-Zell-Grenzen. Distanzieren, die Zellen in 1 ml Accutase, verwenden Sie einen 1 bis 3 Teilungsverhältnis (dh 1 konfluenten gut von Zellen in drei Vertiefungen der 6-Well-Platte plattiert) für Passagieren von Zellen und stabilisieren angepasst NCM von 5 Passagen.
8. Handy Einfrieren
   1. Nutzen Sie ein gut zusammenfließenden (~ 6.5 x10 ⁶ Zellen) für einen Tiefkühlflasche: distanzieren Zellen von einem konfluenten gut mit 1 ml Accutase für 10 min.
   2. Verdünnen Sie with 5 ml Medium und mTeSR1 Zentrifuge Zellen wie oben beschrieben.
   3. Resuspendieren des Pellets in 500 ul Medium mTeSR1 und dann langsam in einem Kryokonservierungsfläschchen fügen 500 ul 2X hpSC Gefriermedium (enthaltend 20 &mgr; M Y-27632). Alternativ Resuspendieren der Zellen in 1X hpSC Gefriermedium, das 2 &mgr; M JAK-Inhibitor 1 oder 1X CryoStor CS10 Medium in Gegenwart von entweder 10 &mgr; M oder Y-27632 2 uM JAK-Inhibitor 1.
   4. Zeigen Fläschchen eingefroren in einem Eis-gekühltes Kryobehälter (mit isopranol Bottom-gefüllt) und übertragen die Kryobehälter zu einer -80 ° C-Gefrierschrank sofort.
   5. Übertragungszellen von dem -80 ° C Gefrierschrank in einem Flüssigstickstofftank (am nächsten Tag) für die Langzeit Kryokonservierung.
9. Handy Auftauen
   1. Nutzen Sie ein Kryokonservierungsfläschchen für die Beschichtung ein Well einer 6-Well-Platte.
   2. Vorwärmen mTeSR1 Medium in einem 37 ° C Wasserbad für 10 Minuten auftauen Zellen in der gleichen Wasserbad für 2 min,tropfenweise in den Zellen 5 ml vorgewärmten mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und Zentrifuge wie oben beschrieben.
   3. Vorsichtig resuspendieren Zellpellets mit 2 ml mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632 und langsam Zellen übertragen, um mit einem gut vorge Matrigel-beschichtete (Hinweis: die Herstellung von Luftblasen zu vermeiden).
   4. Ändern Medium täglich und erwarten hpSC Wachstum Zusammenfluss am Tag 3 oder 4 erreichen.

4 des Protokolls Nr. 3:. Konvertieren hpSC Kolonien auf Matrigel zu NCM Kultur

1. Entfernen einer Matrigel-beschichtete Platte aus dem Kühlschrank wird die Platte in der Gewebekultur Haube für 10 bis 30 Minuten, entfernen Sie das Medium aus jeder Vertiefung der Platte, und 2 ml vorgewärmten Medium mTeSR1 in jede Vertiefung.
2. Über verrieben hpSC Klumpen aus dem Einzug Kultur (Schritt 2.10 der Grund-Protokoll) zu dem oben Matrigel Platte. In mTeSR1 Medium bis zu 2,5 ml Endvolumen in jeder Vertiefung.
3. Medium täglich ändern TAG 3 BIS 4s bis Kolonien erreichen 80 bis 90% Konfluenz.
4. Für Passagieren von Zellen: zweimal spülen Sie die Kolonien mit D-PBS, Behandlung der Zellen mit 1 ml 2 mg / ml Dispase bei 37 ° C für 15 bis 20 min und Sediment-und Durchgangszellen als Klumpen.
5. Für NCM Kultur: wiederholen Sie die Schritte 3,1-3,9 in Protokoll Nr. 2 beschrieben.

5 Protokoll Nr. 4:. NCM Kultur hPSCs auf LN-521

1. Auftauen des rekombinanten LN-521-Lösung bei 4 ° C vor dem Tag der Anwendung und machen die Laminin-Beschichtungslösung (LCS) durch Verdünnen der aufgetauten Laminin mit 1X D-PBS (das Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +),} um eine Endkonzentration von 10 ug / ml.
2. 1 ml der LCS einer Mulde in 6-Well-Platte (Anmerkung: ein Austrocknen während der Beschichtung zu vermeiden).
3. Verschließen Sie die Platte mit Parafilm überzogen, um Verdunstung zu vermeiden, und die Platte im Kühlschrank (4 ° C) O / N (Anmerkung: Verwenden Sie die Platte innerhalb von 1 Woche).
4. Die LCS mit einer Pasteur-Pipette vorsichtig entfernen, ohne zuuching der beschichteten Oberfläche und 2 ml mTeSR1 mittel-bis gut ein.
5. Warm alle Kulturlösungen (einschließlich D-PBS) in einem 37 ° C Wasserbad für 25 min.
6. Konvertieren hpSC Kolonien NCM
   1. Distanzieren Zellaggregate auf einzelne Zellen mit Accutase in Protokoll 2 beschrieben.
   2. Samen 1.3-2 x 10 ⁶ hPSCs in einem gut LN-521 beschichtete (1,4-2,1 × 10 ⁵ Zellen / cm ²⁾ ohne die Anwesenheit von ROCK-Inhibitoren.
   3. Änderungsmedium täglich für 3 bis 4 Tage.
   4. Dissoziation der Zellen in 1 ml Accutase am Tag 3 oder 4 für die nächste Zelle Passagierung mit einem 1 bis 3 Teilungsverhältnis.

. 6 Protokoll 5: NCM Kultur für Plasmid-DNA Transfektion

1. Passen hpSC Kolonien NCM Kultur als in den Protokollen 2 bis 4 beschrieben.
2. Platte dissoziiert hPSCs in 12-Well-Platte mit einer Zelldichte von 7,5 x 10 ⁵ Zellen / Vertiefung in mTeSR1 Medium in Gegenwart von 10 &mgr; M Y-27632.
3. Ersetzen mTeSR1 Medium mit drogenfreie mTeSR1 Medium zwischen 4-8 Stunden nach dem Ausstreichen der Zellen.
4. Für jede Transfektion verdünnen 2,5 ug Expressionsplasmide (zB pmaxGFP) und 5 ul Lipofectamine 2000 in getrennten Eppendorf-Röhrchen in jedem Opti-MEM 125 ul Reduzierte Serum Medium.
5. Nach 5 min, mischen Sie die Reagenzien verdünnt und Inkubation für 20 min bei RT (der Transfektion Komplexe zu bilden).
6. Fügen 250 ul Transfektion Komplexe jede Vertiefung hPSCs in 1 ml mTeSR1 Medium und Inkubation der Zellen bei 37 ° C in einem CO _2-Inkubator für 24 Stunden.
7. Prüft die Transfektionseffizienz unter einem Fluoreszenzmikroskop und fotografieren zufällig für die Berechnung der tatsächlichen Transfektionseffizienz.

. 7 des Protokolls Nr. 6: NCM für Kultur Transfektion von MicroRNAs

1. Distanzieren halbkonfluente hPSCs am Tag 2 unter NCM Bedingungen durch Zugabe von 1 ml pro Vertiefung in Accutase 6 -Well-Platte.
2. 10 ml mTeSR1 mittel-bis enzymatischen Reaktionen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min zu verdünnen.
3. Zellpellet mit mTeSR1 Medium, Samen, die Zellen in einer Dichte von 7,5 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung einer 12-Well-Platte in mTeSR1 Medium mit 10 uM Y-27632, und lassen die Zellen legen für 4 Stunden.
4. Ersetzen Sie das Medium mit Y27632 frei mTeSR1 Medium.
5. Verwenden Sie handelsübliche Micro-RNAs (zB eine nicht-Targeting miRIDIAN miRNA-Transfektion Control mit Dy547 beschriftet). Titriert Konzentrationen im Bereich von 0 bis 160 nM mit den mitgelieferten Reagenzien und folgen Sie den Anweisungen der Hersteller.
6. Optimieren Transfektionseffizienz für jede Konzentration in hpSC Linien durch Abbildung der Dy547 Fluoreszenz der lebenden Zellen unter dem Mikroskop bei 24 Stunden nach der Transfektion.
7. Berechnen Sie die Transfektionseffizienzen basiert auf dem Prozentsatz der positiven Zellen Dy547 über alle Zellen abgebildet.

. tle "> 8 Protokolls Nr. 7: Kultur NCM für Transduktion von Lentivirusvektor

1. Wiederholen Sie die Schritte 7.1 bis 7.4 des Protokolls Nr. 6.
2. Berechnen Sie die Mengen an Viruspartikeln für Übertragung verwendet werden: Verwenden Sie die folgende Formel ein: = TU (MOI x CN) / VT, während TU bezeichnet die Gesamtzahl der Umwandlung Einheiten entspricht MOI die gewünschte Vielfalt der Infektion in der gut (MOI oder TU / Zelle), CN gibt die Anzahl der Zellen in jeder Vertiefung und VT-Lager zeigt virale Titer (TU / ml). Zum Beispiel gegeben, dass die Aktien virale Titer für SMART-shRNA Vektors gleich 1 x 10 ⁹ TU / ml (Umwandlung Einheiten pro ml), 7,5 x 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung bei der Transduktion, und einer erwarteten MOI von 20: 15 zu verwenden ul der Aktienviruspartikel für jeden gut (Anmerkung: Diese Bedingung ist für transiente lentiviralen Induktion empfohlen).
3. Vorwärmen mTeSR1 300 ul Medium mit 10 mg / ml Polybrene für 30 min.
4. In 15 ul Lager Viruspartikel indie vorgewärmten Medium mit mTeSR1 Polybren und vorsichtig die Lösung.
5. Ersetzen des Zellkulturmedium mit 300 &mgr; l vorgewärmtem Medium, das die Viruspartikel enthält.
6. Nach 4 Stunden Inkubation untersuchen turboGFP Fluoreszenz (ein Hersteller für shRNA-Expression) um die Übertragungseffizienz zu bestimmen.
7. In 300 ul zusätzlicher mTeSR1 Medium auf die Wandler gut, wenn die Zellen beginnen, turboGFP auszudrücken.
8. Nach 12-16 h Inkubation denken Turbo-GFP-Expression.
9. Führen gewünschten Follow-up-Experimente mit diesen transduzierten Zellen innerhalb von 72 Stunden.

Ergebnisse

Ein allgemeines Schema der NCM Kultur

Abbildung 1 zeigt eine typische NCM Kultur-Schema, das die dynamischen Änderungen der hPSCs nach der High-Density-Single-Cell-Beschichtung in der Gegenwart des ROCK-Inhibitor Y-27632. Diese morphologischen Änderungen sind interzellulären Verbindungen nach der Plattierung, Zellcluster Bildung und exponentiellen Zellwachstums, gefolgt von Kondensation Zelle (1A). Ein repräsentatives Experiment zeigt WA...

Diskussion

Es gibt zwei große Möglichkeiten, um in vitro Kultur hPSCs: konventionelle Kolonie-Art-Kultur (von Zellen auf Feeder oder extrazelluläre Matrix) und Suspensionskultur von hPSCs als Aggregate ohne Zubringer ^6. Die Grenzen der beiden Kolonie-Typ-und Suspensionskultur Methoden gehören sammelt Heterogenität und vererbbaren epigenetischen Veränderungen. NCM Kultur, basierend sowohl auf Einzelzell Passagieren und High-Density-Zelle Überzug, stellt eine neue Methode zur Kultur hpSC Wachstum ^6,18...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Countess automated cell counter	Invitrogen Inc.	C10227	Automatic cell counting
Faxitron Cabinet X-ray System	Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL	Model RX-650	X-ray irradiation of MEFs
MULTIWELL 6-well plates	Becton Dickinson Labware	353046	Polystyrene plates
DMEM	Invitrogen Inc.	11965–092	For MEF medium
Mitomycin C	Roche	107409	Mitotic inhibitor
Trypsin	Invitrogen Inc.	25300-054	For MEF dissociation
DMEM/F12	Invitrogen Inc.	11330–032	For hPSC medium
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Invitrogen Inc.	31985-062	For hPSC transfection
Heat-inactivated FBS	Invitrogen Inc.	16000–044	Component of MEF medium
Knockout Serum Replacement	Invitrogen Inc.	10828–028	KSR, Component of hPSC medium
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Invitrogen Inc.	14190-144	D-PBS, free of Ca2+/Mg2+
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140–050	NEAA, component of hPSC medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030–081	Component of hPSC medium
mTeSR1 & Supplements	StemCell Technologies	5850	Animal protein-free
TeSR2 & Supplements	StemCell Technologies	5860	Xeno-free medium
β-mercaptoethanol	Sigma	M7522	Component of hPSC medium
MEF (CF-1) ATCC	American Type Culture Collection (ATCC)	SCRC-1040	For feeder culture of hPSCs
hESC-qualified Matrigel	BD Bioscience	354277	For feeder-free culture of hPSCs
Laminin-521	BioLamina	LN521-02	Human recombinant protein
FGF-2 (recombinant FGF, basic)	R&D Systems, MN	223-FB	Growth factor in hPSC medium
CryoStor CS10	StemCell Technologies	7930
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104	1X mixed enzymatic solution
JAK inhibitor I	EMD4 Biosciences	420099	An inhibitor of Janus kinase
Y-27632	EMD4 Biosciences	688000	ROCK inhibitor
Y-27632	Stemgent	04-0012	ROCK inhibitor
Y-39983	Stemgent	04-0029	ROCK I inhibitor
Phenylbenzodioxane	Stemgent	04-0030	ROCK II inhibitor
Thiazovivin	Stemgent	04-0017	A novel ROCK inhibitor
BD Falcon Cell Strainer	BD Bioscience	352340	40 µm cell strainer
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 °C	Thermo Scientific	C6516F-1	“Mr. Frosty” Freezing Container
Lipofectamine 2000	Invitrogen Inc.	11668-027	Transfection reagents
DharmaFECT Duo	Thermo Scientific	T-2010-02	Transfection reagent
Non-targeting miRIDIAN miRNA Transfection Control	Thermo Scientific	IP-004500-01-05	Labeled with Dy547, to monitor the delivery of microRNAs
SMART-shRNA	Thermo Scientific	To be determined	Lentiviral vector
pmaxGFP	amaxa Inc (Lonza)	Included in every transfection kit	Expression plasmid for transfection control
Oct-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-5279	Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1	Santa Cruz Biotechnology	sc-21702	Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4	Santa Cruz Biotechnology	sc-21704	Mouse IgG3, pluripotent marker
Tra-1-60	Santa Cruz Biotechnology	sc-21705	Mouse IgM, pluripotent marker
Tra-1-81	Santa Cruz Biotechnology	sc-21706	Mouse IgM, pluripotent marker
CK8 (C51)	Santa Cruz Biotechnology	sc-8020	Mouse IgG1, against cytokeratin 8
α-fetoprotein	Santa Cruz Biotechnology	sc-8399	AFP, mouse IgG2a
HNF-3β (P-19)	Santa Cruz Biotechnology	sc-9187	FOXA2, goat polyclonal antibody
Troponin T (Av-1)	Thermo Scientific	MS-295-P0	Mouse IgG1
Desmin	Thermo Scientific	RB-9014-P1	Rabbit IgG
Anti-NANOG	ReproCELL Inc, Japan	RCAB0004P-F	Polyclonal antibody
Rat anti-GFAP	Zymed	13-0300	Glial fibrillary acidic protein
Albumin (clone HSA1/25.1.3)	Cedarlane Laboratories Ltd.	CL2513A	Mouse IgG1
Smooth muscle actin (clone 1A4)	DakoCytomation Inc	IR611/IS611	Mouse IgG2a
Nestin	Chemicon International	MAB5326	Rabbit polyclonal antibody
TUBB3	Convance Inc	MMS-435P	Tuj1, mouse IgG2a
HNF4α (C11F12)	Cell Signaling Technologies	3113	Rabbit monoclonal antibody
Paraformaldehyde (solution)	Electron Microscopy Sciences	15710	PFA, fixative, diluted in D-PBS