İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Özet

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

Özet

İnsan makrofajlar bulaşıcı hastalıklardan kansere kadar değişen patolojik süreçlerin bir bolluk katılmaktadırlar. Böylece bu hastalıkların altında yatan mekanizmaları anlamak için değerli bir araç oluşturmaktadır. Bu nedenle, yüksek makrofaj ürün veren bir farklılaşma olarak hazırlandı buffy kat insan monositleri, izolasyonu için basit bir protokol mevcut. Tekniği yaygın olarak bulunan laboratuar ekipmanları çoğunlukla dayanır ve böylece insan makrofaj büyük miktarlarda elde etmek için bir maliyet ve zaman etkin bir yol sağlar. Kısaca, sağlıklı kan vericilerden ince beyaz kat periferal kandan hasat monositleri bir çifte yoğunluk dereceli bir santrifüj işlemine tabi tutulur. Bu monositler, makrofaj koloni uyarıcı faktör (M-CSF) varlığında, flor ile birleştirilmiş etilen propilen (FEP), teflonlanmış hücre kültürü poşetlerde kültürlenir. Farklılaşmış makrofajlar kolaylıkla hasat ve ileri çalışmalar ve fonksiyonel için kullanılabilirdiyor. Kalite kontrol ve izolasyon ve farklılaşma adımları doğrulama için önemli yöntemler protokol çerçevesinde vurgulanır. Özet olarak, burada açıklanan protokol rutin ve tekrar edilebilir maliyet yoğun bir araca ihtiyaç olmaksızın, insan makrofajlarını izole etmek için bilim adamları sağlar. Ayrıca, hastalık modelleri sıçangil makrofaj kullanımını engellemeyi genden insan sistemi içinde ileri incelenebilir.

Giriş

Makrofajlar - - monositik soy ve terminal olarak farklılaşmış hücreler türevi, gelişme, doku tamiri ve bağışıklık ¹ gibi çeşitli süreçlerinde yer yol biyolojik işlevi açısından çarpıcı bir plastisite sergiler. Ikincisi kendi fagositik ve doğal ve adaptif immün yanıtı ² arasındaki kavşakta makrofajlar yerleştirir antijen sunan yeteneği nedeniyle. Ancak, özelliği sitokinler, kemokinler, büyüme faktörleri, diğer sinyal molekülleri ve salgılamak için ^1, bağışıklık-modüle edici bir fonksiyonu artmakta, fakat aynı zamanda ek işlevler için bir temel olarak hizmet etmekle kalmamakta,. M1 ve M2 kategoride ³ sonuçlanmıştır non-mikrobiyal kaynaklı durumların bağlamında, bu çeşitli etkinleştirme adımlarını ayna dener. Bu sınıflandırma tam değil iken, makrofaj biyolojisinde temel bir anlaşılmasına olanak vermektedir.

Bu çok yönlü yetenekleri nedeniyle bu makrofajlar bir şekilde doku değişiklikleri veya inflamasyon dahil pek çok koşul ile ilişkili olması sürpriz olarak gelir. Işgalci patojenlere ^4-6 tanınması ve temizlik onların temel rolünün yanında, makrofajlar giderek ateroskleroz, fibrozis, obezite ve kanser ^7-10 odak haline gelmiş. Insan makrofaj üretimi için bir yöntem, yeniden üretilebilir, bu patolojilerin anlaşılması için çok önemlidir. Burada, daha önce tarif edildiği gibi ^11, çift yoğunluk gradyan santrifüj yöntemi ile sağlıklı donörün periferal kanından insan monositlerinde izolasyonu dayanan bir yöntem sunulmaktadır. Makrofaj farklılaşması doğru kolaylaştırmak için, izole edilmiş monositik hücreler, M-CSF ve ¹² normal insan serumu düşük konsantrasyonlarının varlığında inkübe edilir. Kullanımı daha da kolaylaştırmak ve hücre hasat etmek için, gaz geçirgen bir farklılaşma FEP içinde gerçekleştirilmektedirHidrofobik bir yüzeyde ^12-15 teflonlanmış hücre kültürü torba. Yine de ya bir M1 veya M2-benzeri bir şekilde yanıt yeteneğine sahip olarak elde edilen dinlenme makrofajlar deneyleri geniş tabi tutulabilir. Manyetik aktive hücre sıralama (MACS) veya santrifüj elutrasyonun (CCE) karşı akışlı olarak monosit izolasyonu ve sonraki farklılaşma alternatif yöntemler gerekli verimi, maliyet ve zaman açısından bazı sınırlamalar var. Burada tarif edilen protokolü özel reaktifler (örneğin, manyetik boncuklar Mac) ya da aygıtları (örneğin, CCE cihazı) için gerek kalmadan standart laboratuar ekipmanı ile gerçekleştirilir ve hücrelerin büyük miktarlarda işleme izin verir edilebilmesi avantajını sunar.

Protokol

Steril insan AB serumu hazırlanması 1.

1. Taze donmuş plazma (TDP) 4-5 çanta toplayın. -20 ° C'de saklayın torbaları yeterince çanta toplanıncaya kadar.
2. Çanta çözülme ve tamamlayıcıyı inaktive ve fibrin çıkarmak için bir su banyosu içinde 56 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
3. İyice torbaların dış dezenfekte ve 50 ml'lik tüplere için plazma aktarın.
4. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüje çökeltilerin ve artık trombositlerin kurtulmak için.
5. Tüm Süpernatantlar havuzu ve pelet atın.
6. Serum kısım 15 ml tüpler içinde, örnekler ve mağaza -20 ° C'de ilave edildi.
   Not: Alternatif olarak, ticari olarak temin edilebilen ısı ile inaktive edilmiş normal insan AB serumu kullanılabilir.

Monositler 2. izolasyonu

Santrifüj dengelenmesini sağlamak için, iki paralel ince beyaz kat işleme sokulması tavsiye edilmektedir. Bununla birlikte, ca almakhücrelerin karışımı her donör için farklı malzemeler kullanmak olup yeniden. Durumda, ince beyaz kat kolayca elde edilemez, heparinize edilmiş periferal kan 400 mi yerine kullanılabilir.

1. Dikkatle buffy kat içeren plastik torba dezenfekte ve iki 50 ml'lik tüplere her buffy coat içeriğini aktarmak.
2. Her buffy coat boyunca 15 ml Ficoll çözeltisi (1.077 g / ml) ile üç adet 50 ml tüpler doldurun. Ficoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır.
3. Katman ilk yoğunluk gradyanı için Ficoll çözeltisinin üzerinde çok ince beyaz tabaka kan 30-35 mi. Her iki katmanları karıştırma önlemek için yavaş ve dikkatli bunu yapmak için dikkatli olun.
4. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 400 x g'de santrifüjleyin.
5. Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), beyaz halka toplar.
6. Toplam 40 ml'ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun.
7. Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
8. Süpernatant aspire ve 40 ml PBS-EDTA (1 mM) ile, tekrar pelet yıkayın.
9. Her bir vericinin bir havuz için, fenol kırmızı +% 10 FCS olmaksızın, 20 ml RPMI-1640 içinde peletler.
10. İkinci yoğunluk gradyanı için izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi hazırlayın: iki donör 23.13 mi Percoll çözeltisi karışımı için (yoğunluk: 1.131 g / ml), 50 ml bir tüp içinde 10 ml ile 1.87-kat PBS ile yıkandı. Sonra yeni bir 50 ml'lik tüpe Bu çözeltinin 23 ml sevk ve% 46 izo-ozmotik bir Percoll çözeltisi elde etmek üzere fenol kırmızı +% 10 FCS ile 27 mi RPMI-1640 ekleyin. Percoll hazırlanması için oda sıcaklığında olmalıdır.
11. 50 ml'lik bir tüpe hazırlanan Percoll çözeltisi her defasında 25 mi verici transferi için ve Percoll çözeltisi üzerine 2.9 hazırlanan çözelti PBMC) tabakası. Çok yavaş bir bunu yapmak için dikkatli olund dikkatle, her iki tabaka kolayca karıştırmak için eğilimindedir. Eğer doğru yapılırsa iki faz nedeniyle renk onların farkı ayırt edilebilir.
12. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca fren yapmadan 550 x g'de santrifüjleyin.
13. Her bir gradyan için bir 50 ml tüp plastik bir Pasteur pipeti ve transfer ile, iki faz arasında yer alan monositlerin beyaz halka toplar.
14. Toplam 50 ml'ye kadar PBS EDTA (1 mM) ile, her bir tüp doldurun.
15. Oda sıcaklığında frensiz 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj.
16. Süpernatan aspire ve fenol kırmızı +% 10 FCS, 20 ml RPMI-1640 içinde tekrar süspansiyon pelet.

Makrofajlar monositlerin 3. Farklılaşma

1. Tripan mavisi 1:10 seyreltme izole monosit sayısını belirler. Sadece monositlerdir büyük, genellikle düzensiz şekilli hücreler, saymak. Lebfositleridir küçük, yuvarlak şekilli hücreler sayılmaz.
   NOT: Monosit sayılar sadece hücrelerin farklılaşması için kullanılacak kaç FEP Teflon kaplı olan (küçük veya büyük) çantalar hakkında bir ipucu verir, çünkü çok doğru bir tespit gerekmez.
2. Bir donörden 1,0-1,5 ⁸ x 10 monositler için, büyük bir FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba malzeme için 174 ml RPMI 1640 (Bölüm 1'deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (180 mL toplam hacim) 'den oluşan bir kültür ortamı hazırlar.
   1. Bir donörden 3.0-5.0 x 10 ⁷ monositler için, küçük bir Teflon kaplı bir hücre kültürü torbaya hücreleri tohum. Her bir torba için kültür ortamı, 28.5 mi RPMI-1640 (Bölüm 1'deki gibi hazırlanan),% 2 insan AB serumu,% 1 penisilin / streptomisin, ve 2.5 ng / ml M-CSF (30 ml toplam hacim) 'den oluşan hazırlar.
      NOT: örneğin, 8.0 x 10 ⁷ monositler elde edilirse, biz tw onları tohum tavsiye4.0 x 10 ⁷ hücreleri her biri O küçük hacimli torba. Bunun yerine M-CSF, monositler alternatif olarak aynı konsantrasyonda (2.5 ng / ml), granülosit makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) ile ayırt edilebilir.
3. Hazırlanmış ortamın hücre süspansiyonu (20 mi) ilave edin ve iyice karıştırın. Iki torba tek bir donörden alınmış ise, hücre süspansiyonu, 20 ml RPMI-1640 ekleyin ve daha sonra her bir orta hazırlanması süspansiyonun yansının eklenmesi.
4. İsteğe bağlı: monosit preparasyonu, steril kalırsa, belirlemek için, kan agar plakası üzerine, hücre süspansiyonunun bir damla gözyaşı ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe etmek.
5. FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torbanın tıpası üzerine şırınga Perfüzör 50 ml kılıfı Sıkma ve hazırlanan hücre süspansiyonu ile doldurun.
6. Şırınga çıkarın ve çanta dışarı kalan havayı itin. Bir kapanış koni ile çanta kapatın.
7. 37 ° C'de 6-7 gün boyunca çanta inkübe76,% 5 _CO2 ile soğutuldu.

4. Makrofaj Hasat

1. Hücrelerin ayrılmasına (en fazla 3 saat mümkün bir enkübasyon) sağlamak için en az 1 saat boyunca buz üzerinde farklı makrofajları ile FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba yerleştirin. Torbanın bütün yüzeyi buzla kaplı olduğundan emin olun.
2. Bir masa / kurulu kenarına minimal basınç 10x ile çanta çekin.
3. Dikkatlice torbanın dışında dezenfekte ve kapanış koni çıkarın.
4. Torbanın tıpa üzerindeki bir 50 ml şırınga Sıkma, hücre süspansiyonu çıkarın ve 50 ml'lik tüplere aktarın.
5. Hücreleri yavaşlamalarını, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
6. Süpernatan aspire ve toplam 10 ml RPMI-1640 +% 10 FCS içinde bir torba elde edilen taneler bir araya getirirler.
7. Bir hemositometrede hücre sayısını belirlemek (1: 4-1: tripan mavisi 10 seyreltme). Sadece büyük yuvarlak hücreleri saymak.
   Not: FEP teflonlanmış torbalarda makrofajları ayırt edilmesinden sonra, artık hücreler verici ve monosit izolasyon kalitesine bağlı olarak, lemfositler, örneğin olabilir.
8. FEP Teflon kaplı bir çanta tekrar kullanmak için, kalan hücrelerin çıkarılması için% 70 etanol ile iki kere yıkayın. 50 mL% 70 etanol ile doldurun ve bir gece boyunca inkübe edilir. Çanta, steril PBS ile 3 kez sterilizasyon kağıdı sarılmasıdır, ve standart prosedürler kullanılarak bir otoklav içinde sterilize yıkayın.
   NOT: Hücre kültürü çanta makrofaj verimlerinde herhangi bir kayıp olmadan birkaç kez tekrar edilebilir. Ancak, biz onlar sızıntı başlamadan önce 10 kullandıktan sonra çanta atmak için karar verdi.
9. RPMI-1640 +% 10 FCS ve sonraki deneyler için kültür makrofajlar. Daha düşük serum konsantrasyonları gerekli olması halinde,% 1 FCS ile RPMI-1640 içinde kültür da mümkündür. Tohum ve 3-4 saat inkübe hücreleri. Bu dönemden sonra, hücre kültürü makrofajlar çanağının yüzeyine bağlamak dikkatHerhangi bir bulaşık hücreleri (örneğin eritrosit, lenfositler ve dendritik hücreler) süspansiyonu kalır. Yapışmayan hücreleri çıkarmak için PBS ile en az iki kez hücreleri yıkayın.
10. Daha fazla deneyler için hücre kültürü çanak kültüre makrofajlar ayırmak için, yüzeyi dikkatlice onları kazıyın. Alternatif olarak, buz üzerinde 20 dakika süre ile inkübe yemekler kültür ortamı aspire, ve 1 ml enzimsiz hücre ayrışma tamponunu ilave edin. 37 ° C de 5 dakika inkübasyondan sonra, aşağı doğru en az 3 dakika boyunca 4 mL PBS ekleyin ve pipetleme hücreleri ayırmak ve.

Sonuçlar

Ficoll kullanılarak birinci yoğunluk gradyan santrifüj PBMC (Şekil 1A), yani lenfositler ve monositler içeren beyaz interfazda verir. Bu, Mayıs Gruenwald boyama (lenfosit tipik) yüksek bir çekirdek / sitoplazma oranı, her iki gösterir toplanan hücreleri (Şekil 1B, C) ​​yoluyla teyit (monositler, tipik özelliği) fasulyesi ya da halka biçimli çekirdekler edilebilir. Bu hücreler daha sonra Percoll kullanarak ikinci bir yoğunluk gradyanı üzerine yüklendiğinde, monositler lemfositler daha ileri ölçüde ayrılabilir ve yeniden beyaz ara faz (Şekil 1D-F) gibi görünebilir. Her Buffy kat için tanımlanan çift yoğunluklu gradyan santrifüj rutin Buffy kat başına 70 ± 30 x 10 ⁶ makrofajlar (Şekil 2) ayırt edilebilir 150 ± 40 x 10 ⁶ monositlere verir. Gelen ortalama makrofaj verim20 bağımsız hazırlıkları toplam izole monositlerin 47 ±% 14 idi.

Percoll Santrifüjle çevrilmenin ardından yine kan verici hem de izolasyon işleminin doğruluğu bağlıdır hazırlanması için mevcut bir miktar artık olmayan monositik hücreler olabilir. Bununla birlikte, 6-7 günlük farklılaşma aşamasından sonra, preparat esas olarak daha nedeniyle plastik yüzeylere bir biçimde bağlı, rasgele kirletici hücreleri tarafından paylaşılmayan bir özellik (Şekil 4A ile zenginleştirilebilir olgun makrofajları (Şekil 3) oluşmaktadır ve B). Bir gergin iğ benzeri fenotip (Şekil 4C ve D) ile hücreleri de varken kez makrofajların çoğunluğu klasik bir "kızarmış yumurta" morfolojisini, kaplama. Bu sitoplazma ve yapışma kümeler içindeki F-aktin dağılımı ile yansıtılır. Farklılaşmış hücrelerolgun makrofajları (Şekil 5) için tipik işaretleri olan CD45, CD14, CD16, CD206 (mannoz reseptörü), CD11b, CD11c ifadesi ve karakterize edilir. CD11b varlığı hücreleri, dendritik hücre işaretleyici CD209 (DC-SIGN) için negatif olduğu gerçeğiyle desteklenmektedir, ağırlıklı olarak dendritik farklılaşma karşı çıkar.

Farklılaşma, sonra, hücreler fonksiyonel ve PM boyama ve tümör hücrelerine dökülen hücre dışı veziküller almak yetilerini kalsein ile görülebilir olarak yaklaşık 5-7 gün (Şekil 6), metabolik olarak aktif kalır. Ek olarak, hücreler hala çeşitli pro-enflamatuar genin (Şekil 7) 'nin sentezlenmesi ile sonuçlanmaktadır lipopolisakarit (LPS) ile uyarılması için, örneğin, gösterildiği gibi aktive edilebilir.

Çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme sonrası Şekil 1. Görüntü ve PBMC- bileşimi ve monosit-tabakası. Izo-ozmotik bir Percoll santrifüje edilmesinden sonra Ficoll gradyan ve (D) monosit-aşamasından sonra, (A), PBMC bant gösteren fotoğrafını çekin. Sitospin (B, C) ​​PBMC fraksiyonu hazırlıkları ve kalan (E, F) monositler içinde Mayıs-Gruenwald boyamaları. 200 B ve E mikron, C ve F 50 mikron = = Ölçek çubuğu

Monositler ve makrofajlar Şekil 2. Verim. Temsilcisi hücre izole monositlerin sayım ve 20 beyaz tabaka pr makrofajlareparations.

Şekil 3. ve Mikrograflan (A) ve (B) görünüşü makrofaj farklılaşması önce monositler ve makrofajlar. Monositik hücre süspansiyonu, faz kontrast mikroskopisi hücre boyutu ölçümleri. Monositler (C) ve makrofajlar (D) hücre boyutuna histogramlarını gelir. Ölçek çubuğu = 100 mikron.

Şekil 4. Morfoloji ve yapışık makrofajlar iskeletinin organizasyonu. (A) önce yapışık makrofajlar Faz kontrast mikroskobu ve non-adheren sonrası (B) çıkarmaT hücreleri. Yapışkan, uyarılmamış makrofajlar içinde filamentli aktin'in (C, D) Phalloidin-TRITC boyama. Ölçek çubuğu AC = 100 mikron, D. 20 um bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil farklılaştırılmış makrofaj 5. immunfenotipine. FEP Teflon kaplı hücre kültür çantaları farklılaşma 6 gün sonra makrofaj Flow sitometri analizi (kırmızı ile gösterilmiştir). İlgili izotip kontrolleri gri gösterilir. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Makrofajlar tarafından tümör hücresi microvesicles Şekil 6. Alımı. PKH26-etiketli (kırmızı flüoresan) Tümör hücre türevli microvesicles maruz bıraktıktan sonra yapışkan makrofaj Mikrografikleridir. Görüntüler canlılığı boya kalsein AM ile ilgili (A), aydınlık veya (B) sitosolik lekelenmeye karşı yerleştirilmiştir edilir. Ölçek çubukları 100 mikron =. , bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7, IL-1 β upregülasyonu, Wnt5a, TNFa, IL-6, MMP-2, MMP-7 ve MT1-MMP stimu sonra24 sa. Gen ekspresyonu için LPS'nin (100 ng / ml) ile makrofaj lasyon toplam RNA örnekleri (A) ve HPRT1 ve GNB2L1 ifade normalize kantitatif RT-PCR ile ölçülmüştür. Belirtilen değerler muamele edilmemiş kontrol ile karşılaştırıldığında kat değişiklikler (n, ortalama ± SD = 5 * p <0.05, ** p <0.01, *** P <0.001). LPS stimülasyon altında TNFa ve IL-6 indüksiyon ayrıca (SD ± yollarla * p <0.05) ELISA (B) tarafından teyit edildi.

Tartışmalar

Makrofajlar doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir efektör hücrelerdir ve immün, antijen sunumu ve doku homeostazında önemli fonksiyonları gösterir. Nedeniyle olağanüstü plastiklikleri, onların fenotip değişiklikleri ile farklı uyaranlara yanıt edebiliyoruz. Makrofaj markerlerinin polarizasyon sadece yaklaşık% 50 doğrudan insan ¹⁶ fareden tercüme edilmesi için kullanıldığını gösteren raporlar mevcuttur Ancak, her ne makrofaj polarizasyon ilişkin verilerin kadar çok, fare sisteminde elde edilmiştir. Bu nedenle, pahalı bir malzeme, örneğin, MACS manyetik boncuk ya da karşı akım santrifüj sivili ayrıştırma cihazına gerek olmadan burada, yeterli sayıda ve saflıkta primer insan makrofajlarını elde etmek için bir yöntem sunulmaktadır.

Önerilen yöntem, PBMC monositlerin izolasyonu ve FEP-makrofajlar için kendi sonra gelen değişim göre, düşük Conce varlığında, hücre kültürü çanta Teflon kaplıM-CSF ^11-13 ntrations. Monositler uyarılması üzerine, insanlarda en az 5, periferik kan lökosit% 10'a kadar yapmak da onlar vücut dokularında makrofajlar ve dendritik hücreler ¹⁷ için ayırt periferik bölgelerine kişi etüde dahil edilir. Sitokin M-CSF monosit hayatta kalması için önemli olduğu ve makrofajlar ^18,19 kendi farklılaşma sürer. Şimdiye kadar, monosit farklılaşması için seçilen M-CSF konsantrasyonu ancak, protokolde sadece 2.5 ng / ml bir ¹² M-CSF konsantrasyonu ile olgun makrofajlara yeterli sayıda elde edilmesi mümkün, 100 ng / ml kadar olan erim ^{, 20.} Buna ek olarak, hücreler, makrofajların dekolmanı ve belirli hücre sayıları ve bunların daha sonradan ekim kolaylaştırmak FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba kültürlenmiştir. Çanta birkaç kez tekrar edilebilir için bu daha da izolasyon işlemi için maliyetlerini azaltmaktadır.

Bu prosedür ile elde edilen makrofajlarCD45, CD14, CD11b, CD11c'nin için son derece olumlu ve saf, olgun makrofaj ^21,22 nüfus için savunuyor mannoz reseptör CD206 ifadesini göstermektedir. Özellikle yüksek bir CD14 ekspresyonu M-CSF ²³ varlığında farklılık makrofajlar için tipiktir. Diğer bir kızarmış yumurta fenotip sergileyen ise, hücrelerin, tohumlamadan sonra, bunlar tipik bir mil benzeri morfoloji gösteren bazı hücrelerde, plastik yüzeyler için hızlı bir yapışma göstermezler. Bu Diğer yazarlar ^18,22,24 gelen gözlemlerle uyumludur.

Daha sonra M-CSF varlığında monosit farklılaşma, M2-polarize makrofajlar ^16,25 neden olduğu bildirilmiştir. Ancak, protokol ile izole edilmiş makrofajlar oldukları programlarını ve indüksiyon ile tepkimeye yine tümör hücreleri ^26,27 veya LPS'ye maruz kalan tümör hücresi türevli microvesicles ve ko-kültür maruz de dahil olmak üzere çok geniş bir uyarı aralığına cevap verebilmektedir , IL-1 & gibi inflamatuar genlerin946. ;, TNFa, Wnt5a, veya M1-polarize makrofajlar ^3,5,28 için tipik sayılan çeşitli matris metaloproteinaz.

Sonuç olarak, teknik olarak zor veya pahalı prosedürler için gerek kalmadan çifte yoğunluk gradyanı ile santrifüjleme ve makrofaj yüksek sayıda FEP Teflon kaplı bir hücre kültürü torba sonuçlar makrofaj yönelik sonra gelen değişim ile monositlerin izolasyonu. Elde edilen makrofajlar tümör hücreleri ile birlikte-kültür, LPS birlikte klasik aktivasyonu arasında değişen bir sonraki analiz için kullanılabilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies for immunophenotyping	Beckman Coulter		for example: CD11c-PE (IM1760), CD45-FITC (7782), IgG1-PE isotype control (A07796), IgG1-FITC isotype control (A07795)
	BioLegends		for example: CD14-FITC (325603), CD206-PE (321105)
Axiovert 200M microscope	Zeiss
Calcein AM	AnaSpec	89201
Combi-stopper closing cones	Braun	4495101
1x PBS, w/o Ca and Mg	Pan biotech	P04-36500	for PBS-EDTA (1 mM) add 1 ml 0.5 M EDTA per 500 ml PBS
10x PBS, w/o Ca and Mg	Invitrogen	14200-067
EDTA (Titriplex III)	Merck	1084211000	prepare a 0.5 M solution in H2O, use a sterile filter
Cell dissociation buffer (enzyme-free, PBS-based)	Gibco	13151-014
Fetal calf serum (FCS)	Invitrogen	10091148	heat-inactivated
Ficoll (density 1.077 g/ml)	Biochrom AG	L6115
FACSCanto II	BD Biosciences
Goat anti-mouse FITC	santa cruz	sc-2010
LPS from E.coli	Sigma	L8274	final conc: 100 ng/ml
Multifuge 3 L-R	Heraeus
Penicillin/streptomycin	Biochrom AG	A2213
Percoll (density 1.131 g/ml)	GE Healthcare	17-0891-02
Perfusor syringe 50 ml	Braun	8728844F
Phalloidin-TRITC	Sigma	P1951	resuspend in methanol (c = 0.1 mg/ml)
[header]
Plastic disposable Pasteur pipettes	LVL technologies	2655181
rh M-CSF	ImmunoTools	11343117	Resuspend in 500 µl sterile H2O (c = 100 ng/µl), aliquot
RPMI-1640 with phenol red	Gibco	21875-034
RPMI-1640 without phenol red	Gibco	11835-063
Sterilization paper	VP group	3KFKFS230116
Trypan blue stain (0.4% w/v)	Sigma	T8154
FEP Teflon-coated cell culture bag, small	CellGenix	72-C
FEP Teflon-coated cell culture bag, large	CellGenix	197-C