A Radyo-telemetrik Sistemi Omurilik transeksiyonu ve Embriyonik Nöral Hücre Greftler Kök Sıçanlarda Kardiyovasküler Fonksiyonu Monitör

Özet

Biz lezyon yerinde içine aşılama sekiz hafta embriyonik beyin nöral kök hücre T4 omurilik kesilen sıçanlarda kardiyovasküler parametreleri kaydetmek için bir radyo-telemetrik sisteminin kullanılması için bir protokol mevcut. Telemetri doğru bilinçli serbestçe hareket spinal kord yaralı sıçanlarda kardiyovasküler fonksiyonu değerlendirmek için gelişmiş bir tekniktir.

Özet

Yüksek torasik veya servikal spinal kord yaralanması (SKY) kardiyovasküler fonksiyon bozukluğuna yol açabilir. Kardiyovasküler parametreleri izlemek için, biz ya da yeşil floresan proteinini ifade embriyonik beyin sapı kaynaklı nöral kök hücrelerin aşılama olmadan T4 omurilik kesiye uygulanan sıçanların femoral artere bir radyo vericisi bağlı bir kateter yerleştirildi. Böyle kanül yerleştirilmesi veya kuyruk-manşet gibi diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, telemetri sürekli serbestçe hareket hayvanlarda kan basıncını ve kalp hızını izlemek için avantajlıdır. Ayrıca, uzun süreli, birden fazla veri satın alma yeteneğine sahiptir. Spinal kord yaralı sıçanlarda, kolorektal distansiyona yanıt dizginlenmemiş durumuna ve otonom disrefleksi'ye altında bazal kardiyovasküler verileri başarıyla kaydedildi. Bir verici, bir omurilik transeksiyonu önce yerleştirilmiş, buna ek olarak, önceki ve omurilik yaralanması sonrasında Kalp damarı parametreler, aynı farede karşılaştırılabilir. Anlatılan telemet bir sınırlamary prosedür femoral artere implantasyonu ipsilateral hindlimb için kan akımını etkileyebilir olmasıdır.

Giriş

Kardiyovasküler disfonksiyon yüksek seviyelerde spinal kord yaralanması (SKY) sonra oluşur. Bu düzensiz kan basıncı ve kalp hızı istirahat, ortostatik hipotansiyon, egzersiz kaynaklı hipotansiyon ve yaralanma seviyesinin ^1,2 altında duyusal uyaranlara yanıt olarak hipertansiyon ve barorefleks bradikardi atakları ile karakterize otonom disrefleksi'ye tecelli. Bu belirtiler spinal kord yaralı hastaların günlük yaşam müdahale. Böylece, SCI ve deneysel tedaviler hayvanlarda kardiyovasküler değişikliklerin araştırılması için etkili araçlar oluşturulması önem taşımaktadır.

Hayvanlarda kardiyovasküler fonksiyonu araştırmak için, çeşitli teknikler, kan basıncını ve kalp hızını izlemek için kullanılmıştır. Noninvaziv kuyruk manşetleri periferik kan basıncını ³ ölçmek için istihdam edilebilir, oysa Orta kardiyovasküler parametreler, kanül yerleştirilmesi ve telemetri ile kaydedilebilir. Diğer yöntemler, tele karşılaştırıldığındametri serbestçe hareket eden hayvanlar ve kardiyovasküler fonksiyon ⁴ uzun süreli izlemede sürekli olarak kaydedilmesini sağlayan temel bir avantaja sahiptir. Omurilik yaralanması, hayvan modellerinde, deneysel uyarıldıktan sonra periferal kan basıncı değişiklikleri tespit edilmesi için yeterince büyük olmayabilir. Bu duruma göre, müsait kalp izleme tekniği omurilik yaralanması olan hayvanlar için seçilmelidir.

Bu çalışmada, bir radyo-telemetrik sistem tam omurilik transeksiyondan sonra erişkin sıçanlarda kardiyovasküler fonksiyonu izlemek için tanıtıldı. Sıçanlar lezyon yerinde sinjeneiktir sıçan embriyonik gün 14 (E14) beyin sapı kaynaklı nöral kök hücreler (BS-NSC'lerde) greft aldı. Yaralanma ve hiçbir nakli ve naif, yaralanmamış sıçanlara sıçanlar kontrol olarak görev yaptı. Telemetri prosedürü verici sterilizasyon ve implantasyonu (Şekil 1), bazal kardiyovasküler parametre kayıt, distansiyon kaynaklı yanıtları, ve verici temizlik içerir vedepolama.

Protokol

Tüm hayvan protokoller Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Laboratuar hayvan bakımı ve güvenliği için NIH kurallar sıkı takip edilir. Cerrahi işlemlerde Hayvanlar yeterli ağrı ve rahatsızlık en aza indirmek için tedavi edildi.

1. Omurilik Curgery ve Hücre Tırnak

1. Tüm ameliyatları öncesinde otoklav cerrahi aletler. Farklı hayvanlar üzerinde prosedür arasındaki araçlardan patojenleri ve mikrobiyal kirleri çıkarmak için Sıcak Boncuk Sterilizatörü (Güzel Bilim Araçları) kullanın. Ameliyat sırasında steril cerrahi eldiven, önlük ve örtüler kullanın. Her cerrahi işlem için aseptik cerrahi tekniğini kullanıyoruz.
2. Erkek Fischer intraperitoneal enjeksiyon (i.p.) ile ketamin (25 mg / ml), ksilazin (1.3 mg / ml) ve asepromazin (0.25 mg / ml) bir kombinasyonu ile 344 fareleri (2 ml / kg) anestezisi.
3. Arka alanı Tıraş ve Betadine'le ve etanol ile defalarca cildi temizleyin.
4. Bir # 10 bıçak kullanarak deriyi kesme ve açık açık kaslar katmanları teşrih. , Omurları izole T3 vertebra maruz ve ince uçlu bir rongeurs kullanarak bir dorsal laminektomi gerçekleştirmek için bir neşter kullanın.
5. Uzunlamasına dura insizyon ve omurilik kütükleri arasında yaklaşık 1 mm'lik bir boşluk oluşturmak için rostrokaudal iridektomi makas ve Mikroaspirasyon bir kombinasyonu kullanılarak T4 düzeyinde omurilik transeksiyonu.
6. 3-0 Vycril ile tamamen kanama durur, sonra dikiş kaslar kadar 2 dk ve yara klipler ile cilt kapatmak - yaklaşık 1 bekleyin.
7. Ringer (5 mi), buprenorfin (0.035 mg / kg) deri altından ameliyattan hemen sonra Ampisilin (33 mg / kg) enjekte edilmiş ve uyanık kadar ılık bir kuluçka makinesi içinde fareleri korumak.
8. Enjekte Ringer ve günde iki kez 3 gün boyunca veya ağrı ve sıkıntı belirtileri kaybolana kadar ampisilin günde bir kez 10 güne kadar çözüm ve buprenorfın. F kadar diğer hayvanların şirkete bir hayvanı iade etmeyinully iyileşti.
9. Elle boşalma refleks mesane kuruluşuna kadar iki kez yaklaşık iki hafta boyunca bir gün mesane boş, ve sonra gerekirse hayatta boyunca günde bir kez mesane boş.
10. İki hafta sonra, yukarıda tarif edildiği gibi, SCI fareler yeniden anestezi ve omurilik lezyon yerinin yeniden maruz kalmaktadır. Lezyon sitedeki implante edilmiş hücreleri korumak için kapalı dura tutun.
11. Lezyon kavite merkez ve çoklu enjeksiyon ile lezyonun rostral ve kaudal arayüzü içine, 10 E14 yerde GFP transgenik fare embriyoları toplanan ve fibrinojen gömülü hücre çözümü (3,5 × 10 ⁵ ul), ul ve trombin ^5,6 enjekte Bir Hamilton şırınga bağlı 40 um arasında bir iç çapı olan bir çekilmiş cam mikropipet kullanılarak bölgelerini içerebilir.
12. Kas katmanları dikin ve yara klipler ile cilt kapatın.
13. 1.8 - 1.6 adımlarla açıklandığı gibi cerrahi sonrası enjeksiyon ve mesane bakım yapın.
14. Bir hafta olacakön perfüzyon, omurilik ⁷ intraperitoneal olarak retrograd etiket sempatik pregangliyonik nöronları% 0.5 Fluorogold (FG, damıtılmış su içinde 0.4 mi) enjekte edilir.

2. Verici İmplantasyon

1. Sterilizasyon için, oda sıcaklığında, 2 saat (10 saat kadar) - en az 1 transmittersin% 2 glutaraldehid çözeltisi (96 ml damıtılmış su içinde% 50 glutaraldhyde 4 mi) bekletin.
2. Iyice steril% 0.9 serum fizyolojik ile 3 kez vericilerini yıkayın ve kullanım (en fazla 1 saat) kadar tuzlu su içinde saklayın.
3. Sekiz hafta E14 hücre transplantasyonu (10 hafta sonrası yaralanma) sonra, veya hücre aşılama ve naif kontrol sıçanların olmadan SCI uygulanan fareler reanesthetize.
4. Karın bölgesi ve arka ayakların tıraş. Betadine'le cildi temizleyin. Yatar pozisyonda cerrahi masaya sıçan yerleştirin.
5. 15. Bir bıçak kullanarak yandaki ventral karın ve uyluk cilt İnsizyon.
6. S kestiubcutaneous bağ dokuları, küçük bir makas kullanarak femoral damarların ve sinir demeti ortaya çıkarmak.
7. Kavisli ipuçları ile ince forseps kullanarak ven ve sinirden femoral arter ayırın.
8. Arterin altında üç ipek sütür koyun ve her dikiş gevşek bir düğüm yapmak.
9. Daha sonra kateterizasyon damar genişlemesini ortaya çıkarmak için arter yüzeyine 0.1 mi lidokain (% 2) uygulanır.
10. Proksimale gevşek ipek sütür germe tarafından kalıcı ipek düğümle ve geçici blok ile distalde damar sabitleyin.
11. 20 numaralı kavisli iğne kullanılarak arter delinme ve bir kateter yerleştirme aracını kullanarak telemetre kateter (8 cm uzunluğunda) ucunu yerleştirin.
12. Rostrally kadar böylece torasik aorta ucunu yerleştirerek 4 cm kateter yerleştirin.
13. Femoral arter boyunca üç ipek sütür bağlama ile kap içindeki kateter çapa.
14. Göğüs kafesi ve t kaudal kenarı arasındaki kanadını boyunca deri altı cebe olunO bir künt makas ile dizim aralığının en kranial uzantısı.
15. Aşırı hareket etmesini önlemek için vericiyi çevreleyen bağ dokusu için cep ve dikiş içine verici vücudu yerleştirin.
16. No: 6 ipek iplik ile deriyi dikin.
17. Ringer (5 mi), buprenorfin (0.035 mg / kg) deri altından ameliyattan hemen sonra Ampisilin (33 mg / kg) enjekte edilmiş ve uyanık kadar ılık bir kuluçka makinesi içinde fareleri korumak.

3. Bazal Ortalama Arter Basıncı (MAP) ve Kalp Hızı (HR) Kayıt

1. Gibi erken bir verici implante edildikten sonraki bir gün olarak, alıcı yastığı bir canlıya koymak ve vericiyi açın. Kardiyovasküler parametreleri hayvan alışmakta ve stabilize etmek için 15 dakika - yaklaşık 10 bekleyin.
2. En az 1 saat boyunca bir bilgisayarlı veri toplama sistemi ile atım arter basıncı elde edilir Kayıt dinlenme MAP ve HR. Veriyi her 5 sn toplayın.
3. An Monitörimals sürekli ve görünür spazm oluşumu sırasında veri noktalarını kaldırın. Her bir hayvan için ortalama veri noktaları ortalama değerleri elde edildi.

4. Kolorektal otonomik disrefleksi Distansiyon indüklenen

1. Verici alıcı üzerinde içinde gıda pelet ile birlikte bir havlu NSC-aşılı veya SCI kontrol fareleri kısıtlamaktadır. Genellikle sıçan işlem sırasında işbirliği kalabilir.
2. Yaklaşık 2 cm için rektum içine lateks balon uçlu kateter yerleştirin ve bantla ⁸ ile kuyruk sabitleyin.
3. Vericiyi açın ve bekleyin 10 - 15 dakika kan basıncı Ön ekleme taban değere dönmelerine izin.
4. Yaklaşık 30 mmHg'lik bir basınç elde etmek için yavaş yavaş, 1 dakika boyunca, 1.4 ml hava ile 10 saniye içinde balonun şişirilmesi kolorektal distansiyon yol açar.
5. Tutanak MAP ve daha önce HR 1 dk sırasında 1 dk, ve kolorektal distansiyon 1 dk sonra; örnek verileri 3 dakika işlem sırasında her 3 sn.
6. İki denemeler arasında en az 15 dakika kurtarma aralığı ile hayvan başına 3 deneme - 2 gerçekleştirin.
7. Eğer başka değerlendirme yukarıda açıklanan çift doz anestezi kombinasyonu ile doz aşımı hayvanlar (ip). % 4 paraformaldehid, ardından tuzlu su ile hayvanlar serpmek.
8. Her bir hayvan için, daha önce, sırasıyla kolorektal gerilimi sırasında ortalama değerleri; Başlangıçta ve her deneme için şişme kaynaklı MAP ve İK değişiklikler arasındaki farkı hesaplamak; 2 yılı ortalama - 3 deneme ortalama değerler elde etmek.

5. Verici Temizleme

1. Anesteziden sonra ancak perfüzyon önce hayvan vücudunun gelen vericiyi çıkarın. Temizlenene kadar damıtılmış su ile dolu bir beher içinde hemen bekletin; uzaktan ölçüm cihazının kurumayı önlemek.
2. Oda sıcaklığında 24 saat boyunca% 1 Terg-A-Zyme enzimatik bir temizleme çözeltisi (10 g / L su) için telemetre aktarın.
3. Kör bir 30 gauge iğne ile verici kateterin ucu REGELRegel şırıngaya bağlanır.
4. Dikkatlice katlanmış yumuşak dokuyu kullanarak vericiyi kurulayın ve orijinal plastik tepsi içinde saklayın.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan telemetri tekniği kullanarak, başarılı spinal kord yaralı hayvanların kardiyovasküler parametreleri kaydedildi. İK önceki raporlarda ⁹ ile tutarlı naif hayvanlara göre artış ise yalnız omurilik yaralanması olan hayvanlar, MAP önemli ölçüde azaldı. BS-MGK aşılama, MAP ve HR ile hayvanlarda naif hayvanlarda ölçülen düzeyleri (Şekil 2) yaklaştı. Zararlı stimülasyon MAP bir artış ve İK ^3,8 bir azalma meydana eğer kolorektal dista...

Tartışmalar

Geleneksel olarak, bir sıvı doldurulmuş kanül artere yerleştirilmiş ve her bir hayvan ¹¹ bir uç anlık gibi kalp-damar parametrelerini kaydetmek için bir basınç transdüktörüne bağlanır. Sürekli uzun süre kardiyovasküler performansını izlemek için, radyo-telemetrik sistemler birçok laboratuvarda istihdam edilmektedir. Bu daha rafine araç serbestçe hayvanlar hareket, bilinçli kan basıncını kaydedebilirsiniz. Sıvı dolu kateterler ile karşılaştırıldığında, telemetri doğru SC...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37 oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension