Un système de radio-télémétrique de surveiller la fonction cardiovasculaire chez le rat avec la moelle épinière Transection et embryonnaires souches neurales greffes cellulaires

Résumé

Nous présentons un protocole d'utilisation d'un système de radio-télémétrie pour enregistrer des paramètres cardio-vasculaires dans la moelle épinière des rats T4 sectionnés huit semaines après le tronc cérébral embryonnaire cellule souche neurale de greffage dans le site de lésion. La télémétrie est une technique de pointe pour évaluer avec précision la fonction cardiovasculaire en déplaçant librement la moelle épinière des rats conscients blessés.

Résumé

Haut lésion de la moelle épinière thoracique ou cervicale (SCI) peut conduire à un dysfonctionnement cardio-vasculaire. Pour contrôler les paramètres cardiovasculaires, nous avons implanté un cathéter relié à un émetteur radio dans l'artère fémorale de rats ayant subi une transection de la moelle épinière T4 avec ou sans greffe de cellules souches neurales du tronc cérébral dérivées d'embryons exprimant la protéine fluorescente verte. Comparé à d'autres méthodes telles que l'insertion de la canule ou queue-manchette, la télémétrie est avantageux de surveiller en permanence la pression artérielle et la fréquence cardiaque chez les animaux se déplacent librement. Il est également capable de multiples acquisitions de données à long terme. Dans la moelle épinière des rats blessés, les données de base sous cardiovasculaires état libre et hyperréflexie autonome en réponse à la distension du côlon ont été enregistrées avec succès. En outre, les paramètres cardiovasculaires avant et après la SCI peuvent être comparées dans le même rat si un émetteur est implantée avant une transection de la moelle épinière. Une des limites de la Telemet décritprocédure d'implantation qui est re dans l'artère fémorale peut influencer l'irrigation sanguine de la patte postérieure ipsilatérale.

Introduction

Dysfonctionnement cardiovasculaire survient après une blessure de la moelle épinière (SCI) à des niveaux élevés. Elle se manifeste dans désordonnée pression artérielle et la fréquence cardiaque au repos, hypotension orthostatique, hypotension induite par l'exercice, et hyperréflexie autonome caractérisé par des épisodes d'hypertension et bradycardie baroréflexe médiation en réponse à des stimuli sensoriels dessous du niveau de blessure ^1,2. Ces symptômes interfèrent avec la vie quotidienne de la moelle épinière lésée patients. Ainsi, il est important d'établir des outils efficaces pour l'étude des changements cardio-vasculaires chez les animaux atteints de LM et les traitements expérimentaux.

Pour étudier la fonction cardiovasculaire chez les animaux, plusieurs techniques ont été utilisées pour contrôler la pression artérielle et du rythme cardiaque. Paramètres cardiovasculaires centrales peuvent être enregistrées par l'insertion de la canule et la télémétrie, tandis que la queue-poignets non invasifs peuvent être utilisés pour mesurer la pression du sang périphérique ^3. Comparé à d'autres méthodes, télémétrie a le principal avantage qu'il permet d'enregistrer en continu les animaux se déplacent librement et suivi à long terme de la fonction cardiovasculaire ^4. Dans les modèles animaux SCI, les changements dans la pression sanguine périphérique après stimulation expérimentale peuvent ne pas être assez grand pour être détecté. Par conséquent, la technique de monitorage cardiaque approprié doit être choisi pour les animaux avec la SCI.

Dans la présente étude, un système de radio-télémétrique a été introduit de surveiller la fonction cardio-vasculaire chez les rats adultes après complète sectionnement de la moelle épinière. Les rats ont reçu des greffes de rat syngénique jour embryonnaire 14 (E14) des cellules souches neurales dérivées du tronc cérébral (BS-CNS) dans le site de la lésion. Les rats ayant une lésion et aucune transplantation et, rats naïfs indemnes ont servi de témoins. Le mode opératoire de l'émetteur de télémesure comprend la stérilisation et l'implantation (figure 1), l'enregistrement de paramètre cardio-vasculaire basale, les réponses induites par distension colorectale-, et le nettoyage de l'émetteur etstockage.

Protocole

Tous les protocoles d'animaux ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux institutionnel (IACUC). Directives du NIH pour laboratoire soins et la sécurité des animaux sont strictement suivies. Les animaux atteints de procédures chirurgicales ont été adéquatement traitées pour minimiser la douleur et l'inconfort.

1. moelle épinière Curgery et cellulaire greffage

1. Instruments chirurgicaux autoclave avant toutes les chirurgies. Utilisez Hot Stérilisateurs à billes (Fine Outils scientifiques) pour éliminer les agents pathogènes et les contaminants microbiens des instruments entre les procédures sur différents animaux. Utiliser des gants stériles chirurgicaux, robe et des stores pendant la chirurgie. Employer la technique chirurgicale aseptique pour chaque intervention chirurgicale.
2. Anesthésier des rats Fischer 344 femelles avec une combinaison (2 ml / kg) de la kétamine (25 mg / ml), de xylazine (1,3 mg / ml), et d'acépromazine (0,25 mg / ml) administrée par injection intrapéritonéale (IP).
3. Rasez la zone arrière et nettoyer la peau à plusieurs reprises avec la Bétadine et l'éthanol.
4. Couper la peau à l'aide d'une lame # 10 et carrément disséquer les muscles couches. Utiliser un scalpel pour isoler les vertèbres, exposer la vertèbre T3, et d'effectuer une laminectomie dorsale à l'aide d'un rongeur à pointe fine.
5. Inciser la dure-mère et transect longitudinalement la moelle épinière au niveau de T4 en utilisant une combinaison de ciseaux iridectomie microaspiration et à créer un écart rostrocaudal environ 1 mm entre les souches de la moelle épinière.
6. Attendez environ 1 - 2 min jusqu'à ce que le saignement tout s'arrête, puis les muscles de suture avec 3-0 Vycril et fermer la peau avec des agrafes.
7. Injecter lactate de Ringer (5 ml), la buprénorphine (0,035 mg / kg), et l'ampicilline (33 mg / kg) par voie sous cutanée immédiatement après la chirurgie et de maintenir des rats dans un incubateur chaud jusqu'au réveil.
8. Injecter la solution ampicilline une fois par jour jusqu'à 10 jours, et la buprénorphine deux fois par jour pendant 3 jours ou jusqu'à ce que des signes de douleur et de détresse disparaissent Ringer et. Ne retournez pas un animal de compagnie d'autres animaux jusqu'à ce que fully récupéré.
9. Vider manuellement la vessie deux fois par jour pendant environ deux semaines jusqu'à ce que la mise en place de la vessie réflexe de vidange, puis vider la vessie une fois par jour tout au long de la survie si nécessaire.
10. Deux semaines plus tard, les rats nouveau-anesthésier SCI tel que décrit ci-dessus et re-exposer le site de la lésion de la moelle épinière. Gardez la dure fermé pour conserver les cellules implantées sur le site de la lésion.
11. Injecter 10 ul de solution de cellules (3,5 x 10 ⁵ pi), collectées à partir de E14 GFP ubiquitaire embryons transgéniques de rat et incorporé dans le fibrinogène et la thrombine ^{de 5,6,} dans l'épicentre de la cavité de lésion et l'interface rostrale et caudale de la lésion par injection multiple des sites, en utilisant une micropipette de verre tiré avec un diamètre intérieur de 40 um, relié à une seringue Hamilton.
12. Suturer les couches musculaires et fermer la peau avec des pinces plaies.
13. Effectuer injection après la chirurgie et les soins de la vessie comme décrit dans les étapes 01.06 à 01.08.
14. Une semaine êtreavant la perfusion, injecter 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml dans de l'eau distillée) par voie intrapéritonéale à l'étiquette rétrograde des neurones sympathiques préganglionnaires dans la moelle épinière ^7.

2 Transmetteur Implantation

1. Faire tremper transmittersin solution de glutaraldéhyde à 2% (4 ml de glutaraldéhyde à 50% dans 96 ml d'eau distillée) pendant au moins 1-2 heures (jusqu'à 10 heures) à température ambiante pendant la stérilisation.
2. Laver abondamment à l'émetteurs stérile saline à 0,9% 3 fois et de les stocker dans une solution saline jusqu'à utilisation (pas plus de 1 h).
3. Huit semaines après la transplantation de cellules E14 (après des blessures de 10 semaines), reanesthetize les rats qui ont subi une SCI avec ou sans greffe de cellule et les rats témoins naïfs.
4. Rasez la zone abdominale et des membres postérieurs. Nettoyer la peau à la Bétadine. Placez le rat sur la table d'opération en position couchée.
5. Inciser la peau de la cuisse et l'abdomen ventral interne sur le côté droit à l'aide d'une lame n ° 15.
6. Couper à travers les stissus conjonctifs ubcutaneous d'exposer l'ensemble des vaisseaux fémoraux et le nerf en utilisant une petite paire de ciseaux.
7. Séparer l'artère fémorale de la veine et le nerf en utilisant une pince fine à bout recourbé.
8. Mettez trois sutures de soie sous l'artère et faire un noeud lâche dans chaque suture.
9. Appliquer 0,1 ml de lidocaïne (2%) de la surface de l'artère pour provoquer une vasodilatation pour le cathétérisme ultérieur.
10. Fixez le navire distale avec un noeud de soie permanent et temporaire bloc proximale par étirage d'un fil de suture de soie lâche.
11. La perforation de l'artère à l'aide d'une aiguille courbe de calibre 20 et insérer l'extrémité du cathéter à télémètre (8 cm de longueur) en utilisant un outil d'insertion du cathéter.
12. Insérer le cathéter rostralement jusqu'à 4 cm plaçant ainsi la pointe dans l'aorte thoracique.
13. Ancrer le cathéter dans le vaisseau en l'attachant trois sutures en soie autour de l'artère fémorale.
14. Faire une poche sous-cutanée sur le flanc entre le bord extrême de la cage thoracique et til extension la plus crânienne de la gamme de genou avec une paire de ciseaux émoussés.
15. Insérez le corps de l'émetteur dans la poche et à la suture de tissu conjonctif entoure l'émetteur afin d'éviter tout mouvement excessif.
16. Suturer la peau avec n ° 6 du fil de soie.
17. Injecter lactate de Ringer (5 ml), la buprénorphine (0,035 mg / kg), et l'ampicilline (33 mg / kg) par voie sous cutanée immédiatement après la chirurgie et de maintenir des rats dans un incubateur chaud jusqu'au réveil.

3. basale Pression artérielle moyenne (PAM) et de la fréquence cardiaque (HR) Enregistrement

1. Dès le lendemain de l'émetteur implantation, mettre un seul animal sur le clavier du récepteur et mettez l'émetteur. Attendez environ 10 - 15 min d'habituer l'animal et de stabiliser les paramètres cardiovasculaires.
2. Fiche repos TAM et la FC, qui sont dérivés de la pression pouls artériel avec un système d'acquisition de données informatisées pendant au moins 1 h. Recueillir des données toutes les 5 sec.
3. Surveiller la uneimals continu et supprimer des points de données lors de l'accident de spasmes visibles. Pour chaque animal, la moyenne des points de données pour obtenir des valeurs moyennes.

4. colorectal distension induite Dysréflexie autonome

1. Retenez rats NSC-greffés ou contrôle SCI dans une serviette fournie avec des boulettes de nourriture à l'intérieur du récepteur de l'émetteur. Habituellement les rats peuvent rester coopération lors de la procédure.
2. Insérez un ballon-cathéter à de latex dans le rectum pendant environ 2 cm et fixez-le à la queue avec du ruban ^8.
3. Mettez l'émetteur sous tension et attendez pendant 10 - 15 min permettant à la pression de retour du sang vers préinsertion base.
4. Provoquer distension colorectale par l'inflation du ballon lentement en 10 sec avec 1,4 ml d'air pendant 1 min, à générer une pression d'environ 30 mmHg.
5. CARTE d'enregistrement et HR 1 min avant, 1 min pendant 1 min et après distension colorectale; données de l'échantillon tous les 3 sec au cours de la procédure 3 min.
6. Effectuer 2 - 3 essais par animal avec au moins 15 minutes d'intervalle de récupération entre les deux essais.
7. Animaux Surdosage (ip) avec double combinaison d'anesthésie de dose décrite ci-dessus, si aucune autre évaluation. Perfuser les animaux avec une solution saline suivie par 4% de paraformaldéhyde.
8. Pour chaque animal, la moyenne des valeurs avant et pendant distension colorectale respectivement; calculer la différence entre le début et la PAM et RH changements induits par la distension-pour chaque essai; moyenne sur les 2 - 3 essais pour obtenir des valeurs moyennes.

5. émetteur nettoyage

1. Retirer l'émetteur à partir du corps de l'animal après l'anesthésie mais avant la perfusion. Faire tremper immédiatement dans un bécher rempli d'eau distillée jusqu'à ce que le nettoyage; éviter le séchage du dispositif télémétrique.
2. Transférer le télémètre à la solution de nettoyage enzymatique Terg-A-Zyme 1% (10 g / L d'eau) pendant 24 heures à température ambiante.
3. Regel la pointe de l'émetteur cathéter avec une aiguille de calibre 30 émoussérelié à la seringue de regel.
4. Séchez soigneusement l'émetteur à l'aide d'un chiffon doux plié et le stocker dans le bac de plastique d'origine.

Résultats

En utilisant la technique de télémétrie décrit ci-dessus, nous avons enregistré avec succès les paramètres cardiovasculaires dans la moelle épinière des animaux blessés. Chez les animaux avec SCI seul, MAP a été réduite de manière significative tandis que RH a augmenté par rapport à des animaux naïfs, en conformité avec les rapports précédents ^9. Chez les animaux avec BS-NSC greffage, TAM et la FC approché les niveaux mesurés dans les animaux naïfs (Figure 2). Au cours ...

Discussion

Traditionnellement, une canule remplie de fluide est inséré dans l'artère et relié à un transducteur de pression pour enregistrer les paramètres cardiovasculaires comme un instantané terminal dans chaque animal ^11. Pour surveiller en continu les performances cardio-vasculaire pendant une longue période, les systèmes de radio-télémétrie sont utilisées dans de nombreux laboratoires. Cet outil plus raffinée peut enregistrer la pression artérielle en conscient, les animaux se déplaçant librem...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of Specific Materials/Equipment:
Reagents	Company	Catalogue	Comment
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension