Un sistema radio-telemetria per monitorare la funzionalità cardiovascolare in ratti con midollo spinale e Transection embrionali staminali neurali Innesti cellulari

Riepilogo

Vi presentiamo un protocollo per l'utilizzo di un sistema radio-telemetrico per registrare i parametri cardiovascolari in T4 midollo spinale ratti transected otto settimane successive tronco cerebrale embrionale delle cellule staminali neurali innesto nel sito della lesione. Telemetria è una tecnica avanzata per valutare con precisione la funzione cardiovascolare in coscienti liberi di muoversi midollo spinale topi feriti.

Abstract

Lesione alta del midollo spinale toracico o cervicale (SCI) può portare a disfunzioni cardiovascolari. Per monitorare i parametri cardiovascolari, abbiamo impiantato un catetere collegato ad un trasmettitore radio in arteria femorale di ratti che hanno subito una resezione del midollo spinale T4 con o senza innesto di cellule staminali neurali del tronco encefalico-embrionali derivate che esprimono la proteina fluorescente verde. Rispetto ad altri metodi come l'inserimento cannula o la coda-bracciale, telemetria è vantaggioso per monitorare costantemente la pressione arteriosa e la frequenza cardiaca in animali liberi di muoversi. E 'anche in grado di lungo termine acquisizioni multiple di dati. Nei ratti midollo spinale feriti, sono stati registrati con successo dati cardiovascolari basali sotto condizione sfrenato e disreflessia autonomica in risposta alla distensione del colon-retto. Inoltre, i parametri cardiovascolari prima e dopo SCI possono essere confrontati nello stesso ratto se un trasmettitore viene impiantato prima una transezione del midollo spinale. Una limitazione del Telemet descrittoprocedura ry è che l'impianto nell'arteria femorale può influenzare l'apporto di sangue al arti posteriori omolaterale.

Introduzione

La disfunzione cardiovascolare si verifica dopo la lesione del midollo spinale (SCI) ad alti livelli. Essa si manifesta in disordinata pressione sanguigna e la frequenza cardiaca a riposo, ipotensione ortostatica, ipotensione indotta da esercizio fisico, e disreflessia autonomo caratterizzato da episodi di ipertensione e bradicardia baroriflesso-mediata in risposta a stimoli sensoriali al di sotto del livello di pregiudizio ^1,2. Questi sintomi interferiscono con la vita quotidiana dei pazienti del midollo spinale danneggiato. Pertanto, è importante stabilire strumenti efficaci per lo studio dei cambiamenti cardiovascolari negli animali con SCI e trattamenti sperimentali.

Per studiare la funzione cardiovascolare negli animali, sono state utilizzate diverse tecniche per monitorare la pressione sanguigna e la frequenza cardiaca. Parametri cardiovascolari centrali possono essere registrati mediante inserimento cannula e telemetria, mentre non invasive coda polsini possono essere utilizzati per misurare la pressione del sangue periferico ^3. Rispetto ad altri metodi, telemetria ha il vantaggio principale che permette la registrazione continua in animali liberi di muoversi e di monitoraggio a lungo termine della funzione cardiovascolare ^4. In modelli animali di SCI, i cambiamenti della pressione del sangue periferico dopo stimolazione sperimentale non possono essere abbastanza grandi per essere rilevato. Di conseguenza, adatto tecnica di monitoraggio cardiaco dovrebbe essere selezionato per animali con SCI.

Nel presente studio, un sistema radio-telemetrico è stato introdotto per monitorare la funzione cardiovascolare in ratti adulti dopo resezione completa del midollo spinale. I ratti hanno ricevuto innesti di ratto singenico giorno embrionale 14 (E14), le cellule staminali neurali del tronco encefalico-derivato (BS-NSC) nel sito della lesione. I ratti con lesioni e senza trapianto e ingenui, ratti infortunati serviti come controlli. La procedura di telemetria comprende trasmettitore sterilizzazione e impianto (Figura 1), la registrazione dei parametri cardiovascolari basali, risposte distensione indotta colorettali e pulizia trasmettitore estoccaggio.

Protocollo

Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dalla cura e l'uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC). Linee guida NIH per il laboratorio la cura e la sicurezza degli animali sono rigorosamente seguite. Gli animali con procedure chirurgiche sono stati adeguatamente trattati per ridurre al minimo il dolore e il disagio.

1. midollo spinale Curgery e innesto cellulare

1. Strumenti chirurgici autoclave prima di tutti gli interventi chirurgici. Utilizzare Hot Bead Sterilizzatore (Fine Science Tools) per rimuovere gli agenti patogeni e contaminanti microbici dagli strumenti tra procedure su animali diversi. Utilizzare guanti sterili chirurgici, abito e tende durante l'intervento chirurgico. Impiegare tecnica chirurgica asettica per ogni procedura chirurgica.
2. Anestetizzare femminile Fischer 344 ratti con una combinazione (2 ml / kg) di ketamina (25 mg / ml), xilazina (1,3 mg / ml), e acepromazina (0,25 mg / ml) somministrato per via intraperitoneale (ip).
3. Radere la zona posteriore e pulire la pelle ripetutamente con Betadine ed etanolo.
4. Tagliare la pelle con una lama # 10 e senza mezzi termini sezionare muscoli strati. Utilizzare un bisturi per isolare le vertebre, esporre la vertebra T3, ed eseguire una laminectomia dorsale usando una punta fine rongeurs.
5. Incidere la dura longitudinalmente e transetto il midollo spinale a livello T4 utilizzando una combinazione di iridectomia forbici e microaspirazione per creare un gap rostrocaudale circa 1 mm tra i monconi del midollo spinale.
6. Attendere circa 1 - 2 minuti fino a quando il sanguinamento completamente ferma, poi i muscoli di sutura con 3-0 Vycril e chiudere la pelle con clip ferita.
7. Iniettare Ringer lattato (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicillina (33 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mantenere i ratti in un incubatore caldo fino svegli.
8. Iniettare la soluzione Ampicillin una volta al giorno fino a 10 giorni, e buprenorfina due volte al giorno per 3 giorni o fino a quando i segni di dolore e di sofferenza scompaiono di Ringer e. Non restituire un animale per la compagnia di altri animali fino a fUlly recuperato.
9. Svuotare manualmente la vescica due volte al giorno per circa due settimane fino all'istituzione della vescica svuotamento riflesso, e quindi svuotare la vescica una volta al giorno per tutta la sopravvivenza, se necessario.
10. Due settimane dopo, ri-anestetizzare ratti SCI come descritto sopra e ri-esporre il sito cordone lesione spinale. Mantenere la dura chiusa per mantenere le cellule impiantate nel sito della lesione.
11. Iniettare 10 ml di soluzione di cella (3,5 × 10 ⁵ ml), raccolti da E14 GFP onnipresente embrioni transgenici ratto e incorporato in fibrinogeno e trombina ^5,6, nel epicentro della cavità lesione e l'interfaccia rostrale e caudale della lesione con iniezione multipla siti, usando una micropipetta di vetro tirato con un diametro interno di 40 micron, collegato ad una siringa Hamilton.
12. Suturare gli strati muscolari e chiudere la pelle con clip ferita.
13. Eseguire l'intervento chirurgico dopo l'iniezione e la cura della vescica, come descritto nei passaggi 1,6-1,8.
14. Una settimana essereribalta perfusione, iniettare 0,5% Fluorogold (FG, 0,4 ml di acqua distillata) per via intraperitoneale per etichetta retrograda neuroni simpatici pregangliari nel midollo spinale ^7.

2. Trasmettitore impianto

1. Bagnare transmittersin soluzione di glutaraldeide al 2% (4 ml di 50% glutaraldhyde in 96 ml di acqua distillata) per almeno 1 - 2 ore (fino a 10 ore) a temperatura ambiente per la sterilizzazione.
2. Lavare accuratamente con trasmettitori sterile allo 0,9% soluzione salina 3 volte e memorizzarli in soluzione salina fino al momento dell'uso (non più di 1 ora).
3. Otto settimane dopo il trapianto di cellule E14 (10 settimane lesioni post), reanesthetize i ratti che hanno subito un SIC, con o senza innesto di cellule e ratti di controllo ingenui.
4. Radere la zona addominale e arti posteriori. Pulire la pelle con Betadine. Posizionare il ratto sul tavolo operatorio in posizione supina.
5. Incidere la pelle sulla coscia addome e interno ventrale sul lato destro con una lama # 15.
6. Tagliare le stessuti connettivi ubcutaneous per esporre il fascio di vasi femorali ed il nervo utilizzando una piccola forbice.
7. Separare l'arteria femorale dalla vena e il nervo utilizzando una pinza sottile con punte curve.
8. Mettere tre punti di sutura in seta sotto l'arteria e fare un nodo allentato in ogni sutura.
9. Applicare 0,1 ml di lidocaina (2%) alla superficie dell'arteria per suscitare vasodilatazione per la successiva cateterizzazione.
10. Fissare il vaso distale con un nodo di seta permanente e blocco temporaneo prossimalmente allungando una sutura di seta allentato.
11. Puntura dell'arteria utilizzando un ago curvo calibro 20 e inserire la punta del catetere telemetro (lunga 8 cm) utilizzando uno strumento di inserimento del catetere.
12. Inserire il catetere rostralmente fino a 4 cm determinando così la punta in aorta toracica.
13. Ancorare il catetere all'interno del vaso legando tre suture in seta intorno all'arteria femorale.
14. Fare una tasca sottocutanea lungo il fianco tra il bordo caudale del torace e tche proroga la maggior parte craniale della gamma di ginocchio con un paio di forbici spuntate.
15. Inserire il corpo del trasmettitore nella tasca e sutura al tessuto connettivo che circonda il trasmettitore per evitare movimenti eccessivi.
16. Suturare la pelle con n ° 6 filo di seta.
17. Iniettare Ringer lattato (5 ml), buprenorfina (0,035 mg / kg), e ampicillina (33 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo l'intervento chirurgico e mantenere i ratti in un incubatore caldo fino svegli.

3. basali di pressione arteriosa media (MAP) e frequenza cardiaca (HR) di registrazione

1. Già il giorno successivo trasmettitore impianto, mettere un singolo animale sul pad ricevitore e accendere il trasmettitore. Attendere per circa 10 - 15 minuti per abituare l'animale e stabilizzare i parametri cardiovascolari.
2. Record MAP riposo e HR, che derivano dalla pressione del polso arterioso con un sistema di acquisizione dati informatizzata per almeno 1 ora. Raccogliere i dati ogni 5 secondi.
3. Monitorare l'unaimals rimuovono continuamente e punti dati durante il verificarsi di spasmi visibili. Per ogni animale, punti dati medi per ottenere valori medi.

4.-retto distensione indotta autonomica disreflessia

1. Trattenere ratti NSC-innestate o di controllo SCI in un asciugamano fornito con pellet di cibo all'interno del ricevitore trasmettitore. Di solito i ratti possono rimanere cooperativo durante la procedura.
2. Inserire un catetere a palloncino con punta in lattice nel retto per circa 2 cm e fissarlo alla coda con nastro ^8.
3. Accendere il trasmettitore e attendere 10 - 15 minuti permette la pressione del sangue per tornare alla preinsertion basale.
4. Indurre distensione del colon-retto dal gonfiaggio del palloncino lentamente oltre 10 secondi con 1,4 ml di aria per 1 min, a generare una pressione di circa 30 mmHg.
5. Record MAP e HR 1 minuti prima, 1 min durante e 1 min dopo distensione del colon-retto; dati di esempio ogni 3 sec durante la procedura di 3 min.
6. Eseguire 2 - 3 studi clinici per animali con almeno 15 min intervallo di recupero tra le due prove.
7. Animali Overdose (ip) con doppia combinazione anestesia dosaggio sopra descritto, se non ulteriore valutazione. Profumato animali con soluzione fisiologica seguita da paraformaldeide al 4%.
8. Per ogni animale, la media dei valori prima e durante rispettivamente distensione del colon-retto; calcolare la differenza tra il basale e distensione indotta MAP e HR modifiche per ciascuna prova; media dei 2 - 3 prove per ottenere valori medi.

5. Trasmettitore Pulizia

1. Rimuovere il trasmettitore dal corpo animale dopo l'anestesia, ma prima di perfusione. Bagnare immediatamente in un becher riempito con acqua distillata fino pulizia; evitare l'essiccamento del dispositivo telemetro.
2. Trasferire il telemetro al 1% soluzione detergente enzimatica Terg-A-Zyme (10 g acqua / L) per 24 ore a temperatura ambiente.
3. Regel la punta del catetere trasmettitore con un ottuso ago 30 gaugecollegato alla siringa regel.
4. Asciugare con cura il trasmettitore con un panno morbido piegato e riporlo nel cassetto di plastica originale.

Risultati

Utilizzando la tecnica di telemetria sopra descritto, abbiamo registrato con successo parametri cardiovascolari in midollo spinale degli animali feriti. Negli animali con il solo SCI, MAP è stata significativamente ridotta, mentre HR aumentato rispetto agli animali naïve, in linea con le precedenti relazioni ^9. Negli animali con BS-NSC innesto, MAP e HR avvicinato livelli misurati negli animali naïve (Figura 2). Durante la distensione del colon-retto, un topo era considerato dysreflexic se...

Discussione

Tradizionalmente, un fluido riempito cannula viene inserito nell'arteria e collegato ad un trasduttore di pressione per registrare parametri cardiovascolari come un'istantanea terminale di ciascun animale ^11. Per monitorare continuamente le prestazioni cardiovascolare per lungo tempo, sistemi radio-telemetrica sono impiegati in molti laboratori. Questo strumento più raffinato in grado di registrare la pressione arteriosa in coscienza, muoversi liberamente gli animali. Rispetto al fluido riempito cate...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of Specific Materials/Equipment:
Reagents	Company	Catalogue	Comment
Fibrinogen (rat)	Sigma	F6755-25MG	2 hr at 37oC to dissovle
Thrombin (rat)	Sigma	T5772-100UN	Dissovle in 10 mM CaCl2
1% Terg-A-Zyme	Sigma	Z273287	Enzymatic solution for telemeter cleaning
Fluorogold	Fluorochrome		Dissovle in distilled water and avoid light
Telemeter            (PA-C40)	Data Sciences International
Telementric recording and analysis system	Data Sciences International		Signal stimulator, Data Exchange Matrix, receivers, Ambient pressure reference monitor
Balloon-tipped catheter	Edward Lifesciences	111F7-P	For colorectal distension