Fare Adrenal Kromafin Cell Hücre bağlı Kapasitans Ölçümler Yöntemleri

Özet

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Özet

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Giriş

Sinaptik nörotransmiter içeren sinaptik veziküllerin ekzositozu aracılık eder ve bu veziküller uzun vadede nöronal iletişim sağlamak için sinir terminal içinde yerel endositik geri dönüşüm geçmesi gerekmektedir. Sinaptik vezikül döngüsü, bir bütün olarak, hücresel haberleşme daha iyi bir kavramaya yönelik gerekli bir temel teşkil eden moleküler makine anlaşılması, sinaptik iletim temel rolü göz önüne alındığında. Hücre modeli sistemleri arasında, adrenal kromafin hücre sinaptik vezikül geri dönüşüm altında yatan moleküler makineler içine en kesin içgörü bazı sağlamıştır. Ekzositoz, nörotransmitter açıklamasında son adım, son derece okudu ve adrenal chromaffin hücrenin ^1,2 kullanımı yoluyla incelenmiştir. Aslında, salgı granüllerin oluşumuna, hedefleme, yerleştirme ve füzyon orkestra moleküler oyuncu büyük çapta div uygulanmasından tespit edilmiştirkromafin hücreleri ¹ erse teknikleri. Ayrıca, Ekzositoz katılan protein makine tek-vezikül çözümü için izin için bir fırsat sağlayarak, kromaffin hücre vezikül füzyonu ³ soruları yanıtlamak için güçlü bir model kalır.

Hücre bağlı kapasitans ölçümleri ilk Ekzositoz ³ sırasında tek vezikül füzyon çözümünde kullanılmıştır. ~ Çapı 60 mil gösterilmiştir kadar küçük veziküller Ekzositoz hücre konfigürasyonda bağlı olarak ^4-7 yama kelepçe tekniğiyle birlikte hücre zarı admitans ölçümleri ile tespit edilebilir. Admittans bir devre ya da cihaz, bir akımın akmasına izin verecek kadar kolay bir ölçüsü olarak tanımlanır; Bu empedansının tersidir. Böylece, giriş ölçümler membran kapasitans anlaşılmasını sağlamak. Bu, plazma membranı içine veziküler membranın eklenmesi ile gerçekleştirilir; Bu birleşme yüzeyinde değişiklikler ortayaalan ^8. Her bir füzyon vezikül membran kapasitans ^9,10 kademeli bir artışa neden olur. Ayrıca, bu geçiri ölçüm membran iletkenliğini ve eksositotik olay ³ sırasında füzyon gözenek iletkenlik sağlar. Bu tekniğin Ekzositoz sırasında tek vezikül kinetiği belirlenmesi eşsiz bir araç sağladı gibi, bizim laboratuvar son zamanlarda tek kesecikler ^11,12 endositozu algılamak için bu kavramı başvurdu.

Bizim özel ilgi birçok hücreleri ¹³ ve nöronal terminalleri ^14,15 sinaptik vezikül endositoz için bir ana yol olarak temel bir temizlik bileşeni olarak kabul edilmiştir klatrin aracılı endositoz (CME), olduğunu. CME Ancak kinetiği nedeniyle tekil endositik olayların izlenmesinde teknik sınırlamalara tam olarak anlaşılamamıştır, biyolojik olarak önemli olduğu bilinmektedir. Kromaffin hücreleri ve nöronlar arasındaki ¹ ekzositik mekanizmalarında benzerlikler dikkate alındığında, plchromaffin hücreleri fisyon mekanizmalar büyük olasılıkla nöronlarda sinaptik vezikül endositoz için geçerli olabilir ausible. Hücre bağlı kapasite ölçümleri bireysel endositik olayları izlemek ve en yöntemleri çözemiyorsanız fisyon kinetik analiz için kullanılmıştır. Bizim hücre bağlı kayıtlarında, 20 kHz'de bir sinüs dalgası tutma potansiyelinden üzerine biner, ve çıkış akımı yükseltici kilitli iki fazdan, başka bir kanalda bir kanal ve membran kapasitans membran iletkenliği ayrılır ^{16- 18.} Membran iletimini ve kapasitanstaki değişimlere kaynaktan, tek bir olasılıkla kabarcık kıstırma önce plazma zarına içe vezikül bağlayan boru şeklindeki zar boynuna karşılık fisyon-gözenekli, kinetiğini hesaplayabilir. Topluca, bu teknik bize CME sırasında vezikül fisyon düzenleyici mekanizmaları incelemek için fırsat verir.

Protokol

NOT: Chicago Illinois Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanan tüm prosedür, Ulusal Sağlık Enstitüleri kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Çözümleri ve Kültür Medya Hazırlıklar

1. Altı aya kadar -20 ° C'de tüm çözümleri tutun. 3 aya kadar 4 ° C 'de kültür ortamı tutun.
2. DMEM ile 100 ml ITSX (İnsülin-Transferrin-Selenyum takviyesi-) 1 Pen-strep çözeltisi ve 1 ml kültür ortamı karıştırılarak 100 ml hazırlayın.
3. DMEM, 250 mi, 100 mM _CaCl2, 2.5 ml ve 50 mM EDTA, 2.5 ml enzim çözeltisi karıştırarak hazırlayın.
4. DMEM, 225 ml FBS, 25 ml, 625 mg albumin ve 625 mg tripsin inhibitörü karıştırılarak inaktivasyonu çözeltisi hazırlayın.
5. 154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM HEPES, 3.6 mM NaHCO3, 5,6 mM glikoz, bir Locke çözeltisi hazırlayın. NaOH ile 7.3 pH ayarlayın.
6. 50 mg / ml 'lik bir poli-D-lisin (PDL) çözeltisi hazırlayın. Kat lamelleri, 1 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyon kullanın.
7. 140 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM _CaCI2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, 10 mM glukoz, hücre dışı bir çözelti hazırlayın. ~ 310 nmol / kg 'lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın.
8. 50 mM NaCI, 100 mM TEACl, 5 mM KCI, 2 mM _CaCI2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, bir pipet çözeltisi hazırlayın. ~ 290 nmol / kg 'lık bir ozmolarite NaOH ile 7.3 pH ayarlayın.

2. Adrenal İzolasyon

1. Büyük ve küçük diseksiyon makas ve forsepsle iki çift bir çift otoklava. Bütün bu işlemler sırasında eldiven giyin ve bir buz kovası diseksiyon tepsiye yerleştirin.
2. Gün, 0-3 alındığı fareler kullanır. Dekapitasyon basınçlı CO ₂ tankı ile hayvan öldürülür.
3. Cervi'de gelen omurga aşağıdaki yavru geri kesmek için makas küçük kümesi yararlanın cal bölgeyi kaudale. Deri altında yüzeysel kesilir ve vücut boşluğuna delmek değil emin olun.
4. Sonraki uzak omurga soyma cilt bu kaslar omurga net bir görünümü var maruz böylece. Buradan, servikal spinal kord bir transectional kesim yapmak ve daha sonra omurga kenarları boyunca iki paralel kesim yapmak.
5. Hayvanın ana gövdesini tutan forseps bir çift, omuriliğe kapmak ve böbrekler maruz dek omurga geri soymak için forseps diğer çifti kullanın.
6. Bu noktada, böbreklerin üstüne böbreküstü bezleri görselleştirmek. Daha sonra dikkatli bir Locke çözeltisi ile doldurulmuş bir konik tüp içine her hayvandan iki bezi yerleştirin.
   NOT: Bazen bezleri forseps sadık olacaktır. Bu durumda, yavaşça Forseps ve Locke çözelti içine bezlerinin bertaraf edilmesine yardımcı olmak için başka bir çift forseps kullanır. Bezleri 2 saat kadar bu durumda muhafaza edilebilir.

e "> 3. Doku sindirimi

1. Bu arada, kabarcık, 15 dakika boyunca% 5 _CO2 +% 95 _O2 ile enzim solüsyonu kullanımdan önce. Dengelenmiş çözüm pembemsi / turuncu renk içine bir parlak pembe renk döner emin olun.
2. 20-25 ünite / ml 'lik bir nihai konsantrasyonda taze olarak kabarcıklar halinde enzim çözeltisine papain ekleyin. , Papain ile enzim çözeltisi içerisinde 37 ° C'de 40-60 dakika boyunca, her bir hayvandan bezlerinin her çift inkübe edin.
3. Her tüpe inaktivasyon çözeltisi% 75 ilave edildikten sonra 10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Bu inkübasyon papain enzim aktivitesini eylemsiz hale getirir.
4. Inaktivasyonu çözeltisi ile 10 dakika süreyle inkübe edildikten sonra, yavaşça yeni etiketli tüpe aktarın ve bezleri bezleri kültür ortamı ile 3 kez yıkayın.

4. Hücre Ayrılma ve Kaplama

1. Yıkama işleminden sonra, kültür ortamı içine 200 ul iki bezi yerleştirin ve sonra yavaşça bezleri ve titreaşağı 200 ul pipet pipet ucu ile artık çözelti içinde dokusunun büyük bir parçası kalmayıncaya kadar.
   Not: titre zaman, 200 ul pipet ucu aşağıya doğru bir kuvvet ile tüpün alt bezleri ve muhafaza ve yavaşça doku girerler. , Yavaş, sürekli darbeleri kullanmak için belirli olun asla hızlı veya ani pipetlerken.
2. 450 ul kadar kültür ortamı toplam hacmi getirmek için ek bir 250 ul kültür ortamı ekleyin.
3. Plaka, bir 60 x 15 mm kültür tabağına yerleştirilir yedi ila 12 mm PDL önceden kaplanmış lamelleri, her biri üzerine, bu, hücre-ihtiva eden çözelti, 60 ul.
4. Bir kez kaplama, hücre canlılığı için bir ortam sağlamak için 30 dakika boyunca% 5 CO ₂ sürekli bir akış / arz ile 37 ° C ayarlanır ve muhafaza kuvöz içine koyunuz. İnkübasyondan sonra, yavaşça kültür kabı içine önceden ısıtılmış kültür ortamı 5 ml ilave edilir ve 24 saat süreyle tekrar inkübatör içine yemeğin geri hücre ataşe öncesinded kayıtları.
   Not: Hücreler tipik olarak, en fazla 4 gün boyunca elektrofizyolojik kayıtları için kullanılabilir.

5. Hücre Tanımlama ve gigaohm Seal Oluşumu

1. Hücre dışı çözelti içine 12 mm'lik bir örtücü cam yerleştirin. Bütün böbreküstü bezleri hücre hazırlanması için kullanılan bu yana, kortikal hücreleri (küçük ve) hücreleri kromafin daha sönük kültür içinde kromaffin hücreleri (kahverengimsi / bej rengi ve mükemmele yakın bir dairesel formlu, genellikle çok parlak (Şekil 1) karıştırın.
2. Programlanabilir P-97 çektirmenin kullanarak dört aşamada yama pipetler çekin. Daha sonra cam kapasitenin azaltılması ve yardımcı olacak bir erimiş mum içine pipet ucu batırın pipet içerisinden ucu "darbe-away" lehçe bu balmumu ateş.
   Not: Yama pipet çözeltisi ile doldurulan, yama pipetler genellikle yaklaşık 2 M? Bir dirence sahiptir.
3. Birkaç metre içinde hücreye yakın yama pipet Yaklaşımicrons. Hücreye bağlı bir konfigürasyon elde etmek için, hücreye yakın yama pipet yaklaşması sırasında herhangi bir hafif hücre deformasyon için bak. Bir GΩ mühür elde edilinceye kadar nazik vakum uygulayın.

6. Hücre-Ekli Kapasite Kayıtlar

1. Bir mühür ortaya GΩ sonra, EPC-7 artı yama-kenet büyütücü kullanımı ile hücre bağlı kayıt yapmak ve iki fazlı bir analog kilidi amplifikatör (ekipman ekli tabloya bakınız). Kilit-amplifikatör 50 mV (rms) genlik ve 20 kHz frekans ile bir sinüs dalgası uygulayın.
2. 1 msn zaman sabiti ve 24 db de kilit-amplifikatör çıkış filtre ayarlayın. Kilit-amplifikatör gibi nazik emme bakliyat tarafından üretilen geçici kapasite değişiklikleri sadece yama iletkenlik (Re) iz içine hiçbir projeksiyon ile yama kapasitans (Im) iz görünür ki (Şekil 2) fazını ayarlayın.
   NOT: bir yeniden sistemin kalibrasyonu için ayrıntıları bakın19 Ference.
3. "Aşağıya doğru" adımlar (Şekil 3) ile tipik kapasite değişiklikleri belirlemek.
   NOT: Bir katı kayıt Tek veziküllerini içselleştirerek gösterir birçok aşağıya doğru adımlarla bir "merdiven" tipi benzerliği olarak görülecektir. Yama işlemi eylem akım tipik olarak en hücrelerinden kaydedilmiş olacağından mekanik uyarım olarak hizmet vermektedir.
4. Bu dosya içinde aa / gg / yıl ve kendi bireysel numaralandırma (xx) gibi her hücre bağlı kayıt: Bireysel tarih dahil klasörler gibi dosyaları isim.

Sonuçlar

Hücre canlılığı ve gigaohm sızdırmazlık kalitesinin hücre bağlı kapasitans kayıtlarının kalitesini belirlemek için önemlidir. Bu nedenle, önceki elektrofizyolojik kayıtları ve tipik yaşayabilir hücrelerin, Şekil 1 'de gösterilmiştir etkili ve verimli bir hücre kültürünü temin etmek önemlidir. Teori ve zaman yüksek kaliteli bir yalıtım elde edilir gigaohm yararlı olacaktır. Bir açık protokol Aşama 5.3 'te tarif edildiği gibi Patch-Pipeti hücre yaklaşmaktad...

Tartışmalar

Hücre bağlı kapasite ölçümleri başarılı bir şekilde yüksek kalitede ses kayıtları elde etmek için bazı kritik adımları gerektirir: böbreküstü bezlerinden hazırlanmış 1) canlı ve sağlıklı hücreleri; Lamelleri 2) PDL kaplama; 3) gigaohm yalıtım oluşturma; 4) sistem gürültü seviyesi; ve 5) faz düzeltme.

Hayvan ameliyatı için bir potansiyel yapabilirsiniz değişiklikler en uygun dirayeti cerrahi yaklaşımı ayarlamak ve diseksiyon sırasında zarar görmesi...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm