Métodos de medidas de capacitância ligado por células em Rato Adrenal Cromafim celular

Resumo

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Resumo

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introdução

A transmissão sináptica é mediada por exocitose de vesículas sinápticas contendo neurotransmissores e estas vesículas deve sofrer reciclagem endocítica local no terminal nervoso para manter a comunicação neuronal, a longo prazo. Dado o papel essencial da transmissão sináptica no cérebro, a compreensão do mecanismo molecular que constitui o ciclo de vesículas sinápticas é um fundamento essencial para uma melhor compreensão na comunicação celular como um todo. Entre os sistemas modelo de célula, a célula chromaffin adrenal tem proporcionado alguns dos insights mais definitivo na maquinaria molecular subjacente a reciclagem de vesículas sinápticas. Exocitose, o passo final na libertação de neurotransmissores, foi imensamente estudado e analisado por meio da utilização da célula cromafina adrenal ^1,2. Na verdade, a maioria dos jogadores moleculares que orquestram a formação, a segmentação de encaixe, e fusão de grânulos de secreção foram identificados devido à aplicação do divtécnicas erse em células cromafins ^1. Além disso, ao proporcionar uma oportunidade para permitir a resolução de um único vesícula da maquinaria proteína envolvida na exocitose, a célula cromafina continua a ser um poderoso modelo para resolver as questões de fusão das vesículas ^3.

Medições de capacitância-attached celulares foram utilizados pela primeira vez na resolução de fusão única vesícula durante exocitose ^3. Exocitose de vesículas pequenas como ~ 60 nm de diâmetro foram demonstrados para ser detectado por meio de medições de admissão da membrana celular com a técnica de patch-clamp na célula ligada configuração ^4-7. A admissão é definido como uma medida da facilidade com um circuito ou dispositivo irá permitir que um fluxo de corrente; que é o inverso da impedância. Assim, as medições de admissão de fornecer uma compreensão da capacitância da membrana. Isto é conseguido através da incorporação da membrana vesicular na membrana plasmática; essa incorporação revela mudanças na superfícieárea ^8. Cada vesícula fusão provoca um aumento gradual na capacitância de membrana ^9,10. Para além disso, esta medição de admissão proporciona a condutância da membrana e a condutância de poros de fusão durante um evento exocitótico ^3. Como essa técnica tem proporcionado uma ferramenta única de identificar cinética de um único vesícula durante exocitose, nosso laboratório foi recentemente aplicado esse conceito para detectar a endocitose de vesículas individuais ^11,12.

Nosso interesse específico é mediada por clatrina endocitose (CME), que tem sido considerada como um componente fundamental na arrumação muitas células ¹³ e como uma via principal para sináptica endocitose de vesículas nos terminais neuronais ^14,15. CME é conhecido por ser biologicamente importante, no entanto, sua cinética não ficar bem entendido devido a limitações técnicas no monitoramento de eventos endocíticas singulares. Dadas as semelhanças nos mecanismos exocíticos entre as células cromafins e neurônios ^1, é plausible que os mecanismos de fissão em células cromafins, provavelmente, pode aplicar-se a vesícula sináptica endocitose em neurônios. As medidas de capacitância ligado de células foram utilizadas para monitorar eventos endocíticas individuais e analisar a cinética de fissão, que a maioria dos métodos não são capazes de resolver. Nas nossas gravações ligado de células, uma onda sinusoidal de 20 kHz é sobreposta sobre o potencial de manutenção, e a corrente de saída é separado a condutância da membrana em um canal e a capacitância da membrana no outro canal a partir de uma de duas fases amplificador lock-in ^{16 18.} A partir das alterações na condutância da membrana e capacitância, pode calcular-se a cinética da cisão de poros, o que provavelmente corresponde ao gargalo da membrana tubular que liga a vesícula internalização da membrana do plasma antes da vesícula pinch-off. Coletivamente, essa técnica dá-nos a oportunidade de examinar os mecanismos de regulação da vesícula fissão durante CME.

Protocolo

NOTA: Todo o procedimento foi realizado de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde, aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso da Universidade de Illinois, em Chicago Animal.

1. Soluções e Meios de Cultura Preparações

1. Mantenha todas as soluções a -20 ° C durante até seis meses. Mantenha o meio de cultura, a 4 ° C por até 3 meses.
2. Preparar 100 ml de meio de cultura por mistura de 1 ml de solução pen-strep e 1 ml de ITSX (insulina-transferrina-selênio-suplementação) a 100 ml com DMEM.
3. Preparar a solução de enzima por mistura de 250 mL de DMEM, 2,5 mL de 100 _mM CaCl2, e 2,5 ml de EDTA 50 mM.
4. Preparar a solução de inactivação pela mistura de 225 ml de DMEM, 25 mL de FBS, 625 mg de albumina, e 625 mg de inibidor de tripsina.
5. Prepare uma solução de Locke de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, HEPES 5,0 mM, NaHCO3 3,6 mM, glicose 5,6 mM. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH.
6. Prepara-se uma solução de poli-d-lisina (PDL) de 50 mg / ml. Use uma concentração final de 1 mg / ml para lamelas de revestimento.
7. Prepara-se uma solução extracelular de 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de _CaCl2, 1 mM de _MgCl2, 10 mM HEPES-NaOH, e 10 mM de glucose. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 310 nmol / kg.
8. Prepara-se uma solução de pipeta de 50 mM de NaCl, TEACl 100 mM, KCl 5, 2 mM de _CaCl2, 1 mM de _MgCl2, e 10 mM de HEPES. Ajustar o pH para 7,3 com NaOH, com uma osmolaridade de ~ 290 nmol / kg.

2. glândula adrenal Isolamento

1. Autoclave um par de tesouras de dissecação grandes e pequenos e dois pares de fórceps. Usar luvas durante todo o processo e colocar a bandeja de dissecação em um balde de gelo.
2. Use camundongos tomadas no dia 0-3. Eutanásia animais com um tanque pressurizado de CO _2, seguida por decapitação.
3. Utilizar o menor conjunto de tesoura para cortar a parte de trás do filhote após a coluna de cervi cal de caudal região. Certifique-se de cortar superficialmente sob a pele e não furar na cavidade do corpo.
4. Em seguida, pele casca de distância da coluna vertebral para que a musculatura está exposto a ter uma visão clara da coluna vertebral. A partir daqui, fazer um corte transectional na medula espinhal cervical e, em seguida, fazer dois cortes paralelos ao longo dos lados da coluna vertebral.
5. Com um par de pinças que seguram o corpo principal do animal, usar o outro par de pinças para agarrar coluna vertebral e descascar espinha até rins estão expostos.
6. Neste momento, as glândulas supra-renais visualizar na parte superior dos rins. Em seguida, coloque cuidadosamente as duas glândulas de cada animal em um tubo cônico preenchido com solução de Locke.
   NOTA: Às vezes, as glândulas vai ficar com a pinça. Se este for o caso, usam suavemente outro par de pinças para ajudar na remoção das glândulas de a pinça e para a solução de Locke. As glândulas podem ser mantidas nesse estado durante até 2 horas.

e "> 3. Digestão Tissue

1. No entanto, a solução de enzima de bolha com 5% de CO ₂ + 95% de O ₂ durante 15 minutos antes de usar. Certifique-se de que a solução equilibrada passa de uma cor-de-rosa brilhante em rosa / laranja cor.
2. Adicionar a papaína para a solução de enzima recentemente borbulhar a uma concentração final de 20-25 unidades / ml. Incubar cada par de glândulas de cada animal para 40-60 min a 37 ° C na solução de enzima com papaína.
3. Adicionar 75% de solução de inactivação para cada tubo e incubar a 37 ° C durante mais 10 min. Esta incubação inativa a atividade enzimática da papaína.
4. Após a incubação de 10 min com a solução de inactivação, suavemente transferir as glândulas para um tubo novo rotulados e depois lavar as glândulas 3x com meio de cultura.

4. celular dissociação e Galvanização

1. Após a lavagem, colocar as duas glândulas em 200 ul de meio de cultura e em seguida titula-se suavemente para cima e as glândulaspara baixo através da ponta da pipeta com uma pipeta de 200 uL até que não haja mais de um grande pedaço de tecido na solução.
   NOTA: Quando a titulação, mantêm glândulas na parte inferior do tubo com uma força para baixo a partir da ponta de pipeta 200 uL e envolver o tecido suave e lentamente. Esteja certo de usar, traços contínuos lentos, nunca pipetar rápido ou abrupta.
2. Adicionar um meio adicional de 250 ul de cultura para levar o volume total de meio de cultura até 450 ul.
3. Placa de 60 ul desta solução contendo as células em cada um dos sete lamelas 12 milímetros PDL-pré-revestidas, que são colocados em um 60 x 15 mm prato de cultura.
4. Uma vez chapeado, colocar o prato na incubadora que está definida para 37 ° C e mantida com um fluxo / suprimento constante de 5% de CO ₂ durante 30 minutos para assegurar um ambiente para a viabilidade celular. Após a incubação, adicionar cuidadosamente 5 ml de meio de cultura pré-aquecido no prato de cultura e devolver o prato de volta na incubadora durante 24 horas antes da célula-adidogravações d.
   NOTA: Tipicamente, as células podem ser utilizadas para registos electrofisiolicos por até 4 dias.

5. celular Formação Identificação e gigaohm selo

1. Coloque a lamela de 12 milímetros em solução extracelular. Como toda a glândulas supra-renais são utilizados para a preparação celular, misturar as células cromafins (normalmente muito brilhantes com um marrom / coloração bege e uma forma circular quase perfeita (Figura 1) em cultura com células corticais (menores e mais escuro do que as células cromafins).
2. Puxe as pipetas de patch em quatro etapas usando um programável P-97 extrator. Mergulhe a ponta da pipeta em uma cera derretida, o que ajudará a reduzir a capacidade do vidro e, em seguida, disparar polonês ponta para "blow-away" esta cera de dentro da ponta da pipeta.
   NOTA: Quando preenchido com solução de patch pipeta pipetas de patch normalmente têm uma resistência de ~ 2 mohms.
3. Aproxime-se da pipeta remendo perto da célula dentro de vários microns. Para obter uma configuração ligado à célula, para qualquer célula pequena deformação durante a aproximação da pipeta patch de mais perto da célula. Aplicar sucção suave até um selo GÊ seja alcançado.

6. Recordings capacitância Anexado-Cell

1. Uma vez que um vedante GÊ é revelado, fazer gravações ligado de células, através da utilização de um amplificador EPC-7 mais de patch-clamp e um amplificador lock-in analógico de duas fases (ver tabela anexa do equipamento). Aplique uma onda senoidal com amplitude de 50 mV (rms) e freqüência de 20 kHz a partir do amplificador lock-in.
2. Defina o filtro do amplificador lock-in de saída a 1 constante de tempo ms e 24 db. Defina a fase do amplificador lock-in de modo que as mudanças de capacitância transitórios produzidos por pulsos de sucção suave só aparecem no rastreamento de patch capacitância (Im) sem projeção para o traço remendo condutância (Re) (Figura 2).
   NOTA: Por favor, veja os detalhes para a calibração do sistema de reference 19.
3. Identificar mudanças típicas de capacitância por etapas "para baixo" (Figura 3).
   NOTA: A gravação sólida será visto como uma "escada" tipo de semelhança com muitos passos para baixo, o que indica a internalização vesículas individuais. O processo de correção serve como um estímulo mecânico desde atual ação pode ser normalmente registrada da maioria das células.
4. Nomear arquivos como pastas individuais, incluindo data: dd / mm / ano e cada gravação ligado à célula como a sua própria numeração indivíduo (xx) dentro desse arquivo.

Resultados

A viabilidade celular e a qualidade da vedação gigaohm são críticos na determinação da qualidade das gravações capacitância ligado de células. Portanto, é essencial para obter uma cultura de células eficazes e eficientes antes de registos electrofisiolicos, e células viáveis ​​típicas são ilustradas na Figura 1. Prática e tempo será útil na obtenção de uma vedação gigaohm com alta qualidade. Se se pode ver claramente a deformação da célula quando a pipeta patch for aproxima...

Discussão

Medições de capacitância anexado-Cell exigir várias etapas críticas, a fim de obter sucesso gravações com alta qualidade: 1) células viáveis ​​e saudáveis ​​preparados a partir de glândulas supra-renais; 2) PDL revestimento das lamelas; 3) de formação de selo gigaohm; 4) o nível de ruído do sistema; e 5) correção de fase.

Para a cirurgia animal, modificações pode potencialmente fazer é ajustar a abordagem cirúrgica para melhor atender destreza e para evitar danos...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm