Les méthodes de mesures de capacité cellulaires attaché à la souris surrénales chromaffines cellule

Résumé

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

Résumé

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

Introduction

La transmission synaptique est médiée par exocytose des vésicules synaptiques contenant neurotransmetteurs, et ces vésicules doit subir recyclage d'endocytose locale dans la terminaison nerveuse de maintenir la communication neuronale dans le long terme. Compte tenu du rôle essentiel de la transmission synaptique dans le cerveau, la compréhension de la machinerie moléculaire qui constitue le cycle de la vésicule synaptique est un fondement essentiel pour une meilleure compréhension dans la communication cellulaire dans son ensemble. Parmi les systèmes de modèles de cellule, la cellule chromaffine surrénale a fourni une partie de la vision la plus définitive dans le mécanisme moléculaire sous-jacent recyclage des vésicules synaptiques. Exocytose, la dernière étape de la libération de neurotransmetteurs, a été extrêmement étudié et examiné par l'utilisation de la cellule surrénale chromaffin ^1,2. En fait, la plupart des acteurs moléculaires qui orchestrent la formation, le ciblage, accueil, et la fusion des granules de sécrétion ont été identifiés grâce à l'application de divERSE techniques dans les cellules chromaffines ^1. En outre, en offrant la possibilité de permettre la résolution unique vésicule de la machinerie protéique impliqué dans l'exocytose, la cellule chromaffin reste un modèle puissant pour répondre aux questions de la fusion des vésicules ^3.

Mesures de capacité cellules ont d'abord été utilisés attaché à résoudre seul la fusion des vésicules pendant l'exocytose ^3. L'exocytose de vésicules aussi petites que ~ 60 nm de diamètre ont été démontrées pour être détectée par des mesures admission de la membrane cellulaire avec la technique du patch clamp en configuration cellule attachée de ^4-7. Entrée est définie comme une mesure de la facilité avec un circuit ou un dispositif permettront passage d'un courant; il est l'inverse de l'impédance. Ainsi, des mesures d'admission permettent de comprendre la capacité de la membrane. Ceci est accompli par l'incorporation de la membrane vésiculaire dans la membrane plasmique; cette incorporation révèle des changements dans la surfacezone ^8. Chaque vésicule fusion provoque une augmentation progressive de la capacité de la membrane ^9,10. De plus, cette mesure d'admission fournit la conductance de la membrane et la conductance des pores fusion lors d'une sortie ³ exocytose. Comme cette technique a fourni un outil unique à identifier cinétique simple vésicule pendant l'exocytose, notre laboratoire a récemment appliqué ce concept à détecter l'endocytose des vésicules de simples ^11,12.

Notre intérêt particulier est la clathrine endocytose (CME), qui a été considéré comme un élément fondamental de ménage dans de nombreuses cellules ¹³ et en tant que principale voie d'endocytose des vésicules synaptiques dans les terminaux neuronales ^14,15. CME est connu pour être biologiquement important, cependant, sa cinétique restent pas bien compris en raison de limitations techniques dans la surveillance des événements singuliers endocytose. Compte tenu des similitudes dans les mécanismes d'exocytose entre les cellules et les neurones ¹ chromaffines, il est plausible que les mécanismes de fission dans les cellules chromaffines peuvent probablement s'appliquer à endocytose des vésicules synaptiques dans les neurones. Les mesures de capacité cell-attached ont été utilisés pour surveiller les événements d'endocytose individuels et analyser la cinétique de fission, dont la plupart des méthodes sont incapables de résoudre. Dans les enregistrements cell-attached, une onde sinusoïdale à 20 kHz est superposée sur le potentiel de maintien et le courant de sortie est séparé en la conductance membranaire dans un canal et la membrane capacitance dans l'autre canal à partir d'une à deux phases amplificateur à verrouillage ^{16 18.} A partir des variations de la conductance de la membrane et de la capacité, on peut calculer la cinétique de la fission-pore, ce qui correspond vraisemblablement à la tubulure de membrane tubulaire qui relie la vésicule intériorisation de la membrane plasmique des vésicules avant pincement. Collectivement, cette technique nous donne l'occasion d'examiner les mécanismes de régulation de la vésicule fission pendant CME.

Protocole

NOTE: L'ensemble de la procédure a été menée conformément aux lignes directrices des Instituts nationaux de la santé, tel qu'approuvé par le soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université de l'Illinois à Chicago.

1. Solutions et milieux de culture préparatifs

1. Gardez toutes les solutions à -20 ° C pendant jusqu'à six mois. Gardez les milieux de culture à 4 ° C pendant 3 mois.
2. Préparer 100 ml de milieu de culture en mélangeant 1 ml de solution de pen-strep et 1 ml de ITSX (insuline-transferrine-sélénium-supplémentation) à 100 ml avec du milieu DMEM.
3. Préparer la solution enzymatique en mélangeant 250 ml de DMEM, 2,5 ml de 100 mM _CaCl2, et de 2,5 ml de 50 mM d'EDTA.
4. Préparer la solution d'inactivation en mélangeant 225 ml de DMEM, 25 ml de FBS, 625 mg d'albumine, et de 625 mg d'inhibiteur de la trypsine.
5. Préparer la solution de NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, 5,0 mM de HEPES, 3,6 mM NaHCO3, 5,6 mM de glucose d'un Locke. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH.
6. Préparer une solution de poly-D-lysine (PDL) de 50 mg / ml. Utiliser une concentration finale de 1 mg / ml de lamelles de revêtement.
7. Préparer une solution extracellulaire du NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 ₂ mM, 1 mM de _MgCl2, 10 mM de HEPES-NaOH, et 10 mM de glucose. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH avec une osmolarité de ~ 310 nmol / kg.
8. Préparer une solution de pipette de 50 mM de NaCl, 100 mM TEACl, 5 mM de KCl, CaCl2 ₂ mM, _MgCl2 1 mM, et 10 mM d'HEPES. Ajuster le pH à 7,3 avec NaOH avec une osmolarité de ~ 290 nmol / kg.

2. glande surrénale isolement

1. Autoclave une paire de petits et grands ciseaux de dissection et deux paires de pinces. Porter des gants lors de tout le processus et placer le plateau de dissection sur un seau à glace.
2. Utilisez la souris prises au jour 0-3. Euthanasier les animaux avec un réservoir de CO ₂ sous pression suivie par décapitation.
3. Utiliser le plus petit ensemble de ciseaux pour couper le long du dos du chiot qui suit la colonne vertébrale de cervi cal à caudale région. Veillez à couper superficiellement sous la peau et pas percer dans la cavité du corps.
4. Ensuite, peler la peau loin de la colonne vertébrale ainsi que la musculature est exposé à avoir une vision claire de la colonne vertébrale. De là, faire une coupe transectional à la moelle épinière cervicale, puis faire deux coupes parallèles sur les côtés de la colonne vertébrale.
5. Avec une paire de pinces qui maintiennent le corps principal de l'animal, utiliser l'autre paire de pinces pour attraper la colonne vertébrale et peler la colonne vertébrale jusqu'à reins sont exposés.
6. A ce moment, les glandes surrénales visualiser sur le dessus des reins. Ensuite, placer soigneusement les deux glandes de chaque animal dans un tube conique rempli avec la solution de Locke.
   REMARQUE: Parfois, les glandes s'en tiendra à la pince. Si tel est le cas, utiliser un autre doucement paire de pinces pour aider à l'élimination des glandes de la pince et dans la solution de Locke. Les glandes peuvent être maintenus dans cet état pendant jusqu'à 2 heures.

e "digestion du tissu> 3.

1. Dans l'intervalle, la bulle de solution d'enzyme avec 5% de CO ₂ + O ₂ à 95% pendant 15 minutes avant utilisation. Assurez-vous que la solution équilibrée devient d'une couleur rose vif en couleur rose / orange.
2. Ajouter la papaïne de la solution d'enzyme fraîchement barboter à une concentration finale de 20 à 25 unités / ml. Incuber chaque paire de glandes à partir de chaque animal pendant 40 à 60 min à 37 ° C dans la solution enzymatique avec de la papaïne.
3. Ajouter 75% de solution d'inactivation de chaque tube et incuber à 37 ° C pendant encore 10 min. Cette incubation à inactiver l'activité enzymatique de la papaïne.
4. Après l'incubation de 10 min avec la solution d'inactivation, les glandes transférer doucement dans un tube nouvellement marquée, puis laver les glandes 3x avec le milieu de culture.

4. cellule de dissociation et placage

1. Après le lavage, placez les deux glandes dans 200 pi de milieu de culture, puis titrer doucement les glandes etvers le bas à travers la pointe de la pipette avec une pipette de 200 pi jusqu'à ce que il n'y a plus un gros morceau de tissu dans la solution.
   REMARQUE: Lorsque le titrage, les glandes à maintenir le fond du tube avec une force vers le bas à partir de la pointe de pipette de 200 pi et engager doucement et lentement le tissu. Soyez certain d'utiliser lents, les coups continus, jamais pipetage rapide ou brusque.
2. Ajouter un support supplémentaire de 250 ul de culture pour amener le volume total de milieu de culture à 450 pi.
3. Planche 60 ul de cette solution contenant des cellules sur chacun des sept lamelles 12 mm PDL-pré-enrobés, qui sont placés dans une boîte de culture de 60 x 15 mm.
4. Une fois plaqué, placez le plat dans l'incubateur qui est fixé à 37 ° C et maintenue avec un débit / approvisionnement régulier de 5% de CO ₂ pendant 30 minutes afin de garantir un environnement propice à la viabilité cellulaire. Après incubation, ajouter doucement 5 ml de milieu de culture pré-chauffé dans la boîte de culture et de retourner le plat de nouveau dans l'incubateur pendant 24 heures avant de la cellule-attachéenregistrements d.
   NOTE: En règle générale, les cellules peuvent être utilisées pour des enregistrements électrophysiologiques pour 4 jours.

5. cellulaire Formation sceau d'identification et gigaohm

1. Placer la lamelle couvre-objet de 12 mm dans la solution extracellulaire. Depuis l'ensemble des glandes surrénales sont utilisés pour la préparation de la cellule, mélanger les cellules chromaffines (généralement très lumineux avec un brun / beige coloration et une forme circulaire presque parfaite (figure 1) en culture avec des cellules corticales (petites et plus faible que les cellules chromaffines).
2. Tirez les pipettes de patch en quatre étapes à l'aide programmable P-97 extracteur. Trempez la pointe de la pipette dans une cire fondue, ce qui contribuera à réduire la capacité du verre et ensuite le feu à ongles à la pointe "coup-away" cette cire à l'intérieur de la pointe de la pipette.
   REMARQUE: Lorsqu'il est rempli avec une solution patch pipette, pipettes de patch ont généralement une résistance de ~ 2 MQ.
3. L'approche de la pipette de patch à proximité de la cellule au sein de plusieurs microns. Pour obtenir une configuration cellule attachée, comparer une légère déformation de la cellule au cours de l'approche de la pipette de patch plus proche de la cellule. Appliquer une aspiration douce jusqu'à un joint GQ est atteint.

6. enregistrements de capacitance cellulaires-joint

1. Une fois un joint GQ se révèle, faire des enregistrements cell-attached grâce à l'utilisation d'un amplificateur EPC-7 plus de patch-clamp et un amplificateur analogique de verrouillage en deux phases (voir tableau ci-joint de l'équipement). Appliquer une onde sinusoïdale avec une amplitude de 50 mV (rms) et une fréquence de 20 kHz provenant de l'amplificateur lock-in.
2. Régler le filtre de sortie de l'amplificateur de verrouillage à une constante de temps de 24 ms et db. Régler la phase de l'amplificateur de verrouillage de telle sorte que les changements de capacité de passage des impulsions produites par une aspiration douce apparaissent uniquement dans la trace correctif capacité (Im) sans saillie dans la pièce trace conductance (Re) (figure 2).
   NOTE: S'il vous plaît voir les détails de l'étalonnage du système de reConférence 19.
3. Identifier les changements typiques de capacité par étapes "vers le bas" (figure 3).
   NOTE: Un enregistrement solide sera considéré comme un "escalier" Type ressemblance avec de nombreuses étapes vers le bas, ce qui indique l'internalisation des vésicules simples. Le processus de correction sert une stimulation mécanique puisque le courant de l'action peut être généralement enregistré de la plupart des cellules.
4. Nommer les fichiers que les dossiers individuels y compris la date: jj / mm / an et chaque enregistrement cellule attachée comme sa propre numérotation individuelle (xx) dans ce fichier.

Résultats

La viabilité cellulaire et la qualité de l'étanchéité de gigaohm sont critiques dans la détermination de la qualité des enregistrements de capacité cell-attached. Par conséquent, il est essentiel de se procurer une culture cellulaire et efficace avant les enregistrements électrophysiologiques, et les cellules viables typiques sont illustrés dans la Figure 1. Pratique et l'heure vous seront utiles dans la réalisation d'un joint de gigaohm de haute qualité. Si l'on peut voir c...

Discussion

Mesure de la capacité de cellules attachée nécessitent plusieurs étapes critiques afin d'obtenir avec succès des enregistrements de haute qualité: 1) les cellules viables et sains préparés à partir des glandes surrénales; 2) PDL revêtement des lamelles couvre-objet; 3) la formation de joint de gigaohm; 4) le niveau de bruit du système; et 5) de correction de phase.

Pour la chirurgie des animaux, des modifications, on peut éventuellement faire est d'ajuster l'approche...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12 mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100 ml
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter: 1.5 mm Inner diameter: 1.10 mm Length: 10 cm