마우스 부신하는 chromaffin 세포에서 세포 부착 된 정전 용량 측정을위한 방법

요약

After exocytosis, fused plasma membrane is retrieved through a process known as endocytosis. This mechanism reforms new synaptic vesicles for the next round of release. Individual endocytic events are captured and analyzed through the use of the cell-attached capacitance recordings in mouse adrenal chromaffin cells.

초록

Neuronal transmission is an integral part of cellular communication within the brain. Depolarization of the presynaptic membrane leads to vesicle fusion known as exocytosis that mediates synaptic transmission. Subsequent retrieval of synaptic vesicles is necessary to generate new neurotransmitter-filled vesicles in a process identified as endocytosis. During exocytosis, fusing vesicle membranes will result in an increase in surface area and subsequent endocytosis results in a decrease in the surface area. Here, our lab demonstrates a basic introduction to cell-attached capacitance recordings of single endocytic events in the mouse adrenal chromaffin cell. This type of electrical recording is useful for high-resolution recordings of exocytosis and endocytosis at the single vesicle level. While this technique can detect both vesicle exocytosis and endocytosis, the focus of our lab is vesicle endocytosis. Moreover, this technique allows us to analyze the kinetics of single endocytic events. Here the methods for mouse adrenal gland tissue dissection, chromaffin cell culture, basic cell-attached techniques, and subsequent examples of individual traces measuring singular endocytic event are described.

서문

시냅스 전달은 신경 전달 물질 - 함유 소포 시냅스 세포 외 유출에 의해 매개되고, 이러한 소포는 장기적으로 신경의 통신을 유지하기 위해 신경 말단 내의 지방 세포 내 이입 재활용을 거쳐야한다. 시냅스 소포 사이클 전체적으로 셀룰러 통신의 더 나은 이해를 향해 필수적인 토대 구성 분자 기계 이해, 뇌 시냅스 전달의 중요한 역할을 감안. 셀 모델 시스템 중 부신하는 chromaffin 세포는 시냅스 소포 재활용의 기초가되는 분자 기계에 관하여 가장 정확한 통찰력의 일부를 제공하고 있습니다. 세포 외 유출, 신경 전달 물질 방출의 마지막 단계는, 대단히 공부 부신하는 chromaffin 셀 ^1,2를 사용하여 조사되었다. 사실, 분비 과립의 형성, 타겟팅, 도킹 및 융합을 조율 분자 선수 대부분 기인 DIV의 애플리케이션에 확인 된하는 chromaffin 세포 ^하나에서 ERSE 기술. 더욱이, 세포 외 유출에 관여하는 단백질의 단일 기계 소포 해상도를 허용 할 수있는 기회를 제공하여, 셀하는 chromaffin 소포 융합의 ³ 문제를 해결하기 위해 강력한 모델 남아있다.

세포 부착 된 용량 측정은 첫째 세포 외 유출 ^세 동안 단일 소포 융합 해결에 사용되었다. ~ 60 nm의 직경이 입증 된만큼 작은 소포 세포 외 유출은 세포 부착 구성 ^4-7에서 패치 클램프 기술로 세포막 어드미턴스 측정에 의해 검출된다. 어드미턴스는 회로 또는 장치에 전류가 흐르도록하는 방법을 쉽게의 척도로서 정의된다; 이것은 임피던스의 역이다. 따라서, 어드미턴스의 측정은 막의 커패시턴스의 이해를 제공한다. 이는 세포막 소포 막에 혼입함으로써 달성된다; 이 법인은 표면의 변화를 보여준다지역 ^8. 각 융합 막 소포는 커패시턴스 ^9,10에서 단계적으로 증가시킨다. 또한,이 측정은 어드미턴스 막 컨덕턴스 및 이벤트 exocytotic ³ 중 융합 기공 컨덕턴스를 제공한다. 이 기술은 세포 외 유출 동안 단일 소포 반응 속도를 식별에 고유 한 도구를 제공하고, 우리의 연구소는 최근 하나의 소포 ^{11, 12의} 엔도 사이토 시스를 감지하는이 개념을 적용하고있다.

우리의 특정 관심이 많은 셀 ^(13)과의 연결 단자 ^{(14, 15)에서} 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 대한 주요 경로로 기본적인 가사 구성 요소로 간주하고있다 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)입니다. CME는하지만, 그 반응 속도로 인해 단일 ​​세포 내 이입 된 사건을 검사하는 경우에 기술적 인 제한으로 잘 이해되지 남아, 생물학적으로 중요한 것으로 알려져있다. 하는 chromaffin 세포와 신경 세포 ^일 사이 exocytic 메커니즘의 유사성을 감안할 때, 그것이 와줘하는 chromaffin 세포 분열 메커니즘 가능성이 뉴런에서 시냅스 소포 엔도 시토 시스에 적용 할 수 있음을 ausible. 세포 부착 된 용량 측정은 각각의 세포 내 이입 이벤트를 모니터링하고 대부분의 방법으로 해결할 수없는 핵분열 반응 속도를 분석하는 데 이용되어왔다. 우리의 세포 - 부착 기록에서, 20 kHz에서 사인파 들고 잠재적 겹쳐되며, 출력 전류는 증폭기 로크에 두 단계에서 다른 채널에서 하나의 채널과 멤브레인 커패시턴스 막 컨덕턴스로 분리 ^{16 18.} 멤브레인 컨덕턴스 및 커패시턴스의 변화로부터, 하나의 가능성 소포 핀치 오프 이전 원형질막에 내재화 소포 연결 관형 막 목에 대응 핵분열 기공의 동력학을 계산할 수있다. 종합적으로,이 기술은 우리에게 CME 동안 소포 분열의 규제 메커니즘을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.

프로토콜

주 : 시카고 일리노이 대학의 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 전체 절차는 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따라 실시 하였다.

1 솔루션 및 문화 미디어 준비

1. 최대 6 개월 -20 ° C에서 모든 솔루션을 유지합니다. 최대 3 개월 동안 4 ° C에서 배양 배지를 보관하십시오.
2. DMEM 100 ml의 ITSX (인슐린 트랜스페린 - 셀레늄 보충제)의 한 펜 연쇄상 구균의 수용액 1 ml에 혼합하여 배양 배지 100 ㎖를 준비합니다.
3. DMEM 250 ㎖, 100 MM의 _{염화칼슘이} 2.5 ml의 50 mM의 EDTA의 2.5 ML을 혼합하여 효소 솔루션을 준비합니다.
4. DMEM의 225 ML, FBS의 25 ML, 알부민 625 ㎎, 625 mg을 트립신 억제제를 혼합하여 불 활성화 솔루션을 준비합니다.
5. 154 밀리미터의 NaCl, 5.6 밀리미터의 KCl, 5.0 mM의 HEPES, 3.6 mM의 NaHCO3를, 5.6 mM의 포도당의 로크의 솔루션을 준비합니다. NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다.
6. 50 ㎎ / ㎖의 폴리-D-라이신 (PDL) 솔루션을 준비합니다. 코트 커버 슬립을 1 ㎎ / ㎖의 최종 농도를 사용한다.
7. 140 mM의 NaCl을, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 _2, 1 mM의 _MgCl2를, 10 mM의 HEPES-NaOH를, 10 mM의 포도당의 세포 외 용액을 준비합니다. ~ 310 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3로 pH를 조정합니다.
8. 50 mM의 NaCl을, 100 mM의 TEACl, 5 밀리미터의 KCl, 2 mM의 염화칼슘 _2, 1 mM의 _MgCl2를, 10 mM의 HEPES의 피펫 솔루션을 준비합니다. ~ 290 nmol의 / kg의 삼투압과 NaOH로 7.3으로 산도를 조정합니다.

2 부신 격리

1. 크고 작은 해부 가위와 집게 이쌍 한 쌍의 압력솥. 전체 과정 동안 장갑을 착용하고 얼음 양동이에 해부 트레이를 배치합니다.
2. 주 0-3 일에 찍은 마우스를 사용합니다. 잘린 다음에 가압 CO ₂ 탱크와 동물을 안락사.
3. cervi에서 척추 다음 강아지의 뒷면을 줄이기 위해 위의 작은 세트를 활용 칼은 지역을 꼬리 지느러미합니다. 피부 아래 표면적으로 잘라 체강 내에 뚫지해야합니다.
4. 다음으로, 멀리 척추에서 껍질 피부가 근육은 척추의 명확한 전망이 노출되도록. 여기에서 자궁 경부 척수에서 transectional 컷을 한 후 척추의 측면을 따라 두 개의 평행 한 컷을합니다.
5. 동물의 본체를 들고 집게 일쌍으로 척추를 잡아 신장이 노출 될 때까지 척추를 벗겨 집게의 다른 쌍을 사용합니다.
6. 이 때, 신장의 위쪽에있는 부신을 시각화. 그런 다음 조심스럽게 로크의 솔루션으로 가득 원뿔 튜브에 각 동물에서이 샘을 배치합니다.
   참고 : 때때로 땀샘은 집게에 충실 할 것이다. 이 경우, 부드럽게 집게로부터 로크의 용액에 땀샘의 제거에 도움이 다른 한 쌍의 집게를 사용한다. 땀샘 2 시간까지이 상태에서 유지 될 수있다.

전자 "> 3. 조직 소화

1. 한편, 거품을 15 분 동안 5 % CO ₂ + 95 % O ₂ 효소액 사용 전에. 평형 솔루션은 분홍빛 / 오렌지 색상에 밝은 핑크 색상에서 켜지는지 확인합니다.
2. 2,025 단위 / ㎖의 최종 농도 갓 버블 효소액 파파인 추가. 파파인으로 효소 용액에 37 ° C에서 40 ~ 60 분 동안 각 동물에서 동맥의 각 쌍을 품어.
3. 각 튜브에 불 활성화 솔루션의 75 %를 추가하고 또 다른 10 분 동안 37 ° C에서 배양. 이 배양은 파파인 효소의 활성을 불 활성화.
4. 불 활성화 용액으로 10 분 배양 후, 부드럽게 새로 레이블 튜브로 땀샘을 전송 한 후 샘은 문화 미디어 3 배 씻는다.

4 셀 해리와 도금

1. 세안 후, 배양 배지의 200 μL에이 글 랜드 위치하게 한 후, 부드럽게 분비를 적정하고다운 200 μL 피펫 피펫 팁을 통해 더 이상 용액 조직의 큰 조각이 없을 때까지.
   NOTE : 적정하면, 200 μL 피펫 팁으로부터 하방으로의 힘으로 튜브의 하단에 분비를 유지 조심스럽게 천천히 결합 조직. 느린 연속 스트로크를 사용하여 특정 수는 결코 빠르거나 갑작스러운 피펫 없습니다.
2. 450 μL까지 배양 배지의 전체 볼륨을 가지고 추가로 250 ㎕의 문화 매체를 추가합니다.
3. 플레이트 60 X 15mm 배양 접시에 배치 일곱 12mm PDL 미리 코팅 된 커버, 각각에이 세포 함유 용액의 60 μL.
4. 일단 도금, 세포 생존을위한 환경을 보장하기 위해 30 분 동안 5 % CO _2의 꾸준한 흐름 / 공급 37 ° C로 설정되고 유지되는 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 배양 후, 부드럽게 배양 접시에 미리 예열 문화 매체의 5 mL를 넣고 24 시간 동안 인큐베이터에 다시 접시를 반환 세포 무관 이전D 녹음.
   주 : 일반적으로, 세포가 최대 4 일 동안 전기 생리 레코딩에 사용될 수있다.

(5) 셀 식별 및 기가 옴 인감 형성

1. 세포 외 용액에 12mm coverslip에 놓습니다. 전체 부신 셀 제조에 사용되기 때문에, 대뇌 피질의 세포 (작고) 셀을하는 chromaffin보다 디머와 문화에하는 chromaffin 세포 (갈색 / 베이지 색상과 완벽에 가까운 원형 형태로 일반적으로 매우 밝은 (그림 1)을 섞는다.
2. 프로그램 P-97 풀러를 사용하여 네 단계의 패치 피펫을 당깁니다. 다음 유리의 용량을 줄이고 데 도움이됩니다 녹은 왁스로 피펫 팁을 찍어은 피펫 팁의 안쪽에서 끝이 "불어 멀리"하는 폴란드어이 왁스를 발생.
   참고 : 패치 피펫 솔루션 가득 할 때, 패치 피펫은 일반적으로 1 ~ 2 MΩ의 저항이있다.
3. 몇 m 내에서 세포에 가까운 패치 피펫 접근icrons. 세포 부착 된 구성을 달성하기 위해, 셀에 가까운 패치 피펫의 접근 중에 약간 변형 셀을 찾는다. GΩ 시일이 달성 될 때까지 부드러운 흡입을 적용합니다.

6 셀 첨부 용량 녹음

1. GΩ 시일이 계시되면 EPC-7 플러스 패치 - 클램프 증폭기의 사용을 통해 세포 부착을 녹음하고 두 상 아날로그 락 - 인 증폭기 (장비 첨부 표 참조). 잠금 증폭기에서 50 MV (RMS)의 진폭과 주파수 20kHz의 사인파를 적용합니다.
2. 1 밀리 초 시정 및 24dB의 종속 증폭기의 출력 필터를 설정합니다. 잠금 증폭기와 같은 부드러운 흡입 펄스에 의해 생성 된 일시적인 정전 용량 변경 사항은 패치 전도도 (재) 추적에 투영법으로 패치 용량 (임) 추적에서 나타나는 (그림 2)의 위상을 설정합니다.
   참고 : 재에서 시스템의 교정에 대한 세부 정보를 참조하십시오(19) 전파 방해.
3. "아래로"단계 (그림 3)에 의해 일반적인 정전 용량의 변화를 확인합니다.
   참고 : 고체 기록이 하나의 소포를 내면화 나타냅니다 많은 아래 단계를 "계단"형 닮은으로 볼 수 있습니다. 패치 프로세스는 동작 전류는 일반적으로 대부분의 세포에서 기록 될 수 있기 때문에 기계적 자극의 역할을한다.
4. 해당 파일 내에서 mm / 일 / 년 및 자신의 개인 번호 (XX) 등의 각 셀에 연결된 기록 : 개별 날짜 등의 폴더로 파일의 이름을 지정합니다.

결과

세포 생존 및 기가 옴 시일의 품질은 셀에 연결된 커패시턴스 레코딩의 품질을 결정하는데 중요하다. 따라서, 종래 전기 생리 레코딩, 및 일반적인 생존 세포로도 1에 도시되어 효과적이고 효율적인 세포 배양을 조달하는 것이 중요하다. 연습 시간은 고품질 기가 옴 시일을 달성하는데 도움이 될 것이다. 하나 명확 프로토콜 단계 5.3에 기재된 바와 같이 패치 피펫 셀 다가 세포 변형을...

토론

세포 부착 커패시턴스 측정이 성공적으로 고품질 레코딩 얻기 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요 : 부신으로부터 제조 1) 실용적이고 건강한 세포; 커버 슬립의 2) PDL 코팅; 3) 기가 옴 씰 형성; 4) 시스템의 노이즈 레벨; 5) 위상 보정.

동물의 수술 한 잠재적 수 변형이 가장 적합 기용으로 수술 접근을 조정하고, 박리시 손상을 방지하는 것이다. 전기 생리 녹음을 위해 이용 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Poly-D-Lysine	Sigma	P0899
DMEM		15066024	Keep out of UV
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Life Technologies
Cover Glass	Carolina Biological	633029	12mm
Penicillin Streptomycin	Life Technologies	15140122	100mL
Insulin-Trans-Sel-X	Life Technologies	51500056	Only thaw on ICE!
Papain	Worthington	39S11614
EPC-7 plus patch amplifier	HEKA
BNC-2090 data acquisition board	National Instruments
Igor data acquisition software	Wavemetrics
P-97 pipette puller	Sutter Instruments
Microforge	Scientific Instruments
Borosilicate glass capillaries	Sutter Instruments	B150-110-10	Outer diameter-1.5 mm
			Inner diameter 1.10 mm
			Length- 10 cm