Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Özet

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Özet

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Giriş

overekspresyonu teknolojilerin tanıtılması düşük kopya sayısı enzimlerin biyokimyasal çalışmalar ve farmakolojik olarak aktif proteinlerin (örneğin, insülin) sanayi üretimi ya artırdı. Bu teknolojilerin gelişiyle bu yana, önemli gelişmeler rekombinant proteinlerin verim ve kaliteyi artırmak için elde edilmiştir. Buna ek olarak, prokaryotik ve ökaryotik ^{1,2 3} ekspresyonu sistemleri, protein biyoteknoloji, yani, Escherichia coli "iş atı" yararlı alternatifler sunan, yıllar içinde geliştirilmiştir. E. alternatif platformların Özellikle, kullanılabilirlik E. coli rekombinant peptitler veya post-translasyonel modifikasyonlar taşıyan proteinlerin üretimine yol açtı. Bununla birlikte, söz edilmelidir E. E. coli halen yeniden birleştirici protein üretimi için tercih edilen bir organizmayı ifade eder. Bu en alakalı olabilir aralarında çeşitli faktörler, nedeniylekabul: i) ekspresyonu sistemleri (ifade vektörleri ve suşları oldukça bir dizi kullanılabilirlik) E. için E. coli ^1,2; E. ii) Kısa nesil süreleri ve yüksek biyokütle verimi, Zengin ve sentetik medya çeşitli coli; iii) biyokimyasal olarak ve bu mikroorganizmanın genetik düzeyde ya uyduruk manipülasyon; iv), toksik proteinlerin ⁴ üretebilen suşlarının izole edilmesi; v) nüfus düzeyinde ^5,6 homojen indüksiyon sahip suşlar yapımı. Buna ek olarak, son zamanlarda, E. üretimi için uygun olan bu ifade sistemleri gördü translasyon sonrası modifiye edilmiş proteinlerin E. coli tasarlanmış ve ² yapılabilir.

Şu anda, proteini aşırı ekspresyonu esas olan hypersynthesis uygun bir plasmid içine klonlanmış tek bir gen ile yapılabilir monomerik ya da homo-oligomerik proteinler elde etmek için kullanılır. Bununla birlikte, dikkat son zamanlardaE. inşaat ödenen coli proteini birlikte ifade sistemleri, bir hetero-oligomerik kompleksleri ^2, in vivo olarak, üretim zorlu. İlginç bir şekilde, protein, birlikte-ifade edilme daha önceki deneylerde, siyanobakteri ribuloz-1,5-bisfosfat karboksilazın / oksijenaz ^7,8 arasında büyük ve küçük alt birimleri ve türler arası düzeneği, ve HIV-1 kesik ve tam uzunluktaki formları arasındaki ilişkiyi ele transkriptaz ⁹ ters. Bu öncü çalışmalar, protein ko-ifadesi in vitro yeniden geleneksel güçlü bir alternatif temsil ettiğini göstermiştir. E. koli içinde ilave olarak, protein, ko-ekspresyonu E. coli doğal olmayan amino asitler ² ihtiva eden proteinler elde etmek için, post-translasyonel modifikasyonlar ² taşıyan çeşitli proteinleri üretmek için ve Süreksprese membran proteinlerinin ² verimini artırmak için kullanılmıştır. Ayrıca, bir araç olarak bir protein birlikte-ifade edilme potansiyel E. kazandırma coli rekabetProtein salgılanması nce aktif soruşturma ² altında.

E. Protein birlikte-ifade edilme iki temel strateji coli takip edilebilir: Farklı genleri barındırmak için tek bir plazmid kullanımı aşın i); ii) tek bir hücre içinde birden fazla plasmidlerin kullanımı hedef proteinlerin yardımcı şekilde ifade etmek. Tandem promotör / operatör elemanları ihtiva eden, özellikle plazmidler ko-ekspresyonu ¹⁰ oluşturulmuştur, ancak ilk durumda, plazmid seçimi için kriterler, geleneksel tek bir protein aşın deney olanlardan farklı değildir. Bu ilk yaklaşım bu nedenle oldukça basittir. Bununla birlikte, farklı proteinler yardımcı şekilde ifade etmek tek plazmidin kullanılması, sağlamanın iki büyük bir zorlukla karşı karşıya olduğu belirtilmelidir: i) eş ifade edilen proteinlerin sayısının sınırlandırılması barındırılan genlerin sayısı ile vektör artar, moleküler kütlesi; ii) birden fazla gen, tek bir promotörün kontrolü altında klonlandı zaman, polarite gerilemenin olabilirpromoterinden distal genlerin ifadesi e. Tek E., ikili veya çoklu plasmidlerin kullanımı coli hücreleri, bu nedenle plazmid uygun kombinasyonlarla kısıtlamalar getiren, seçilen vektörler uyumluluğunu gerçekleştirmek zorundadır. Bununla birlikte, bu ikinci eş ifade stratejisinin vektörlerinin molekül kütlesi ihtiva eden bir avantaj sahiptir, ve polarite sınırlar. Son zamanlarda birlikte ekspresyon plazmidleri ¹¹ arasında gen mekik kolaylaştırmak için tasarlanmış bir protein ko-ifade sistemi inşa edilmiştir. Özellikle, pGOOD vektörleri serisi inşa ilgili özellikler elde edilmiştir: i) bir replikasyon orijini p15A, ticari vektörler (ör pBAD seri ¹²⁾ ColE1 orijini içeren pGOOD plazmid uyumluluğunu sağlamak; ii) bir tetrasiklin direnç kasedi; iii) lac varlığı düzenleyici unsurları, yani Yarışmayı-Operatörü (O ₁₎ çift ve IacI -türevli ^q geni. Uygun bir pBAD-pGOOD çift kullanarak, E. katalitik çekirdeğini aşırı ifade başardık üç farklı alt üniteden oluşan coli DNA polimeraz III, yani α (5'-3 'polimeraz), ε (3'-5' eksonükleaz) ve (stabilize edici ε) ¹³ θ. Özellikle, αεθ kompleksinin birlikte ifadesi, E. ek sıkı sıkıya bağlı olduğunu göstermiştir IPTG ve arabinoz hem de E. coli kültür ortamı, pGOOD ve pBAD sırasıyla (Şekil 1A), tetikleyici aşırı ekspresyonu.

Mevcut yazıda, proteinin birlikte ifadesi, etkin bir şekilde bir protein kompleksi alt biriminin çözünürlüğünün kötü bağlantılı zorlukların üstesinden nasıl göstermektedir. Buna ek olarak, ne kadar in vivo proteinin tamamlama testlerinde gerçekleştirilebilir göstermektedir, ve nihayet E. ayar mutasyon sıklığı protein ko-ifade edilmesi için rapor dağ geçidii. Bu amaçla, her vaka çalışması ilgili örnekler göstermek için uygun pGOOD-pBAD çiftler kullanılır.

Protokol

E. 1. izolasyonu E. coli Eş transformantlar

1. Uygun E. elektro-yetkili hücreleri hazırlayın coli suşu transforme edilecek. LB ortamı, 1 ml (tripton, maya ekstresi, 10 NaCl, 5, ve 10 g / l'lik konsantrasyonlarda kullanılır) tercih edilen soyunun tek bir koloni, ve transfer 180 rpm çalkalama koşulları altında, 37 ° C'de inkübe edin. Ön-kültür 1 seyreltin: 500, taze LB ortamında 25 ml ve 37 ° C'de kültür inkübe edin.
2. Log-faz (0.6 OD) içinde 20 dakika için 5000 xg) bir hücre süspansiyonu santrifüj ve orijinal kültür hacminin yarısı% 10, h / h buz soğukluğunda steril gliserol-su içinde pelletini. Her seferinde tabanda hacmi yarıya, bu adımı 4 kez tekrarlayın. Son olarak, gliserol / su içinde tekrar süspansiyon pelet ve 50 ul alikolar içinde hücre süspansiyonu bölün. 6 ay -80 ° C de alikotları saklayın.
3. 0.5 mM EDTA ile takviye edilmiş, steril su içinde arzu edilen plazmid çözülür. Ic üzerinde çözülmeE elektro-kompetan hücrelerin bir tümböleni ve vektör uygun bir miktar (2.5-5 ng) ile karıştırılır. Elektroporasyon için uygun olan bir 0.1 cm küvet içine karışımı koyun ve 1.8 kV uygulanır.
4. Hemen SOC ortamında 1 ml 'ye elektroporatlanmıştır hücreleri transferi (LB ortamı% 0.2 / h glukoz, 10 mM _MgCl2, 2.5 mM KCI ile takviye edilmiş), çalkalama altında 1 saat boyunca inkübe edilir ve son olarak da içeren Petri kapları 100 ul alikotları aktarmak Uygun antibiyotik ile LB agar. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
5. Petri kapları tek koloniler çizgiler ile transformantlann arındırın.
6. Birincil Transformantların elektro-yetkili hücreleri hazırlayın ve tekrar ileri plazmidlerle dönüştürmek için 1,1-1,5 adımları.
7. Ko-transformantların gliserol stokları hazırlayın. Uygun antibiyotikler ile takviye edilmiş LB içinde tek bir koloni transfer, çalkalanarak 37 ° C'de inkübe ve log-faz (0.6 OD) santrifüj 20 dakika boyunca 5000 x g'de hücre süspansiyonu. ROrta% 15 h / h gliserol ihtiva eden LB-antibiyotikler pelet esuspend. Alikotları koyun ve en saklayın - 80 ° C.

E. α ve ε Altbirimlerin 2. birlikte ifadesi, E. coli DNA polimeraz III

1. Steril bir çerçevenin bulunduğu uygun soy gliserol stokundan bir miktar transfer LB ortamı ve antibiyotikler içeren bir Petri kutusu içine (örneğin, TOP10 / pGOOD-ε243 ve TOP10 / pGOOD-ε243-θ / pBADα1160, Şekil 1 'e bakınız). Hücreler damlacık hücreler süspansiyon Petri kabı üzerine kuru ve çizgi edelim. 37 ° CO / N inkübe edin.
2. Steril kürdan LB-antibiyotikler ortamı, 1 ml için tek bir koloni ile Aktarım. 37 ° C'de 8 saat inkübe edin. Taze ortam içinde 500 ve 15 saat boyunca 30 ° C'de inkübe: kültür öncesi 1 seyreltin.
3. IPTG, arabinoz veya arabinoz ve IPTG, 1 mM her ekleyin. 2.5 saat boyunca 30 ° C'de inkübe edilir. Hücreler toplanır ve -20 ° C 'de pelet saklayın.
4. Liziz tamponu (50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, 1 mM EDTA, 2.5 mM ditiyotreitol, 1 mM fenilmetilsülfonil florür (PMSF), pH 8) 'de buz ve tekrar süspansiyon ile çözülme peletler. Yavaşça soğuk cam çömlekçi olan hücreler süspansiyon homojenize.
5. 15 sn soğutma aralığı (4 kür) takip 15 sn 15 W, bir sonikasyon.
6. Çözünür fraksiyonu geri kazanmak için, 4 ° C'de, 20 dakika boyunca 10,000 x g'de toplam protein ekstreleri santrifüjleyin.
7. SDS-PAGE (% 12.5 akrilamid) her çözünür protein ekstresi alikolar ile analiz edin. Bu amaçla, _H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI, pH 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine her çözünür protein ekstresi 20 ul transfer 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (ağ / hac) SDS,% 50 (h / h) gliserol,% 0.25, mavi (ağ / hac) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V'ta elektroforez gerçekleştirin.

Deinococ arasında α alt birimi 3. birlikte ifadesi,cus radiodurans DNA Polimeraz III ε E. Alt Birim E. coli DNA polimeraz III

1. E. ön kültür hazırlanması E. coli suşu TOP 10 / Dr pBAD-α / LB-ampisilin, tetrasiklin ortamı, 1 ml pGOOD-ε243 ve 37 ° C 'de 8 saat daha inkübe edilir. Taze ortam içinde, 1.000 ve 37 ° C 'de O / N inkübe: 1 seyreltin.
2. 1 seyreltin: taze ortam, 100, 200 içine mi, daha sonra arabinoz ve IPTG, 1 mM her biri 3 saat; özellikle, 3 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin. Hücreler hasat ve -20 ° C 'de pelet saklayın.
3. 50 mM Tris-HCI, pH 8, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF içinde pelletini. Homojenize ve 2.4 ve 2.5 de tarif edildiği gibi hücreler bozabilir.
4. Hemen hücreler 20 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj lizata. Pelet atın. Kağıt filtre 3 kat ile donatılmış bir Buchner hunisi ile süpernatant filtre. Nazik vakum uygulayın. Aşırı köpüklenme önlemek için, filtrasyon sırasında buz üzerinde vakum Erleni tutun.
5. Bradford ¹⁴ göre protein konsantrasyonu belirleyin.

4. Jel Filtrasyon Kromatoarafisi

1. 50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, pH kolonuna 8. Yük çözünür protein ekstresi ile bir su ceketli 16x70 (200) jel süzme sütunu dengelenmesi. En uygun çözünürlük için, 1 ml örnek döngü kullanmak. / Dakika 0.6 ml kromatografisi yapın. Boyunca 4 ° C'de kolon sıcaklığı muhafaza edin.
2. 0.9 ml kesirler toplayın ve SDS-PAGE ile analiz. Aktarım _H2O 60 ul ve yükleme tamponu (250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10 mM β-merkaptoetanol,% 10 (a / h) SDS, w% 50 20 ul ihtiva eden Eppendorf tüplerine ilgili her fraksiyonun 20 ul ( h / h) gliserol,% 0.25 (mavi ağırlık / hacim) bromofenol) ve 5 dakika kaynatılır. Yük, her numune için 18 ul ila yaklaşık 1.5 saat için 140 V'ta elektroforez gerçekleştirin.
3. 3'-5 'ekzonükleaz ve her bir fraksiyonun DNA polimeraz aktivitesi 96 biz de belirlerll mikroplakalar. Alt-tabaka ¹⁵ olarak timidin 5'-monofosfat, p-nitrofenil ester (p NP TMP) ile eksonükleaz aktivitesi deneyi. PPX (pirofosfataz, purin nükleosit fosforilaz, ksantin oksidaz) enzim-bağlı deney ¹⁶ ve DNA polimeraz aktivitesi tahmin 2- (4-İyodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolyum klorid (INT) Elektron alıcı ¹⁶ gibi.

Popülasyonlarının E. Yabani tip ε alt biriminin birlikte ifade 5. Mutasyon Analizi E. coli DNA Polimeraz III ve mutajenik εD12A Variant

1. E. tek bir koloni transfer pBAD-ε ve LB-antibiyotikler ortamın 1 ml pGOOD1-εD12A ¹¹ vektörleri içeren E. coli TOP 10. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
2. (Arabinoz, IPTG veya arabinoz ve IPTG, 1 mM), uygun indükleyicileri eklemek, taze ortam (10 mi) ihtiva eden 250 3 şişeleri ve 37 ° C'de inkübe: Ön-kültür 1 seyreltin8 saat karıştırıldı. Paralel olmayan kaynaklı kültürlerde hazırlayın.
3. 1 ml'lik alikolar toplamak, daha sonra 1 sulandırmak taze ortam (10 mi) ihtiva eden yeni şişelere 500 uygun indükleyicileri ile takviye edilmiş ya da. 37 ° C'de O / N inkübe edin.
4. Tekrar 1 ml 5.2 ve 5.3 ve toplamak alikotları adımları.
5. Nesillerin sayısı her kültürde meydana belirleyin. LB plakaları, inokulum ve kültür uygun seri dilüsyonları 100 ul üzerine aktarın. 37 ° C'de O / N inkübe edin. LB plakaları üzerine kolonileri sayın ve büyüme _(C log) sonunda aşı içinde mevcut _(I log) ve kültürde hücre sayısının kaydını hesaplar. Nesillerin sayısını belirlemek için, formülü kullanın: _(C log - _I log) /0.301.
6. 20 dakika boyunca 5000 x g'de santrifüj ve 50 mM Tris-HCI, pH 7.6, 50 mM NaCI, 1 ml süspansiyon hücrelerin. Hücreleri geçirgenliği, 20 saniye kloroform ve vorteks 2-3 damla ekleyin.
7. Β- belirleyinSubstrat olarak p-nitrofenil-β-D-glukopiranosid (PNPGluc) kullanılarak 96 çukurlu bir mikrolevhadaki her bir kısım bir glukosidaz aktivitesi. Her çukuruna geçirgen hücrelerin 100 ul ve alt-tabaka 100 ul (16 mg / _H2 O ml stok çözelti) eklenir. Kuyularda hava kabarcıklarını önlemek için özen gösterin. Bir mikrolevha okuyucu ve uygun bir filtre kullanılarak, 420 nm'de absorbansı okumak.

Sonuçlar

E. ε alt birimi E. coli DNA polimeraz III 243 amino asitten oluşur ve kalıntılar 187-243 ¹⁷ silinir sürece, zayıf çözünürlüğe ^17,18 bulunmaktadır. Bununla birlikte, daha önce tam uzunlukta α, ε ve θ alt birimlerinin birlikte ifadesi, çözünür bir DNA polimeraz III katalitik çekirdek (Şekil 1) elde edilir ki ¹¹ göstermiştir. I) α ve ε alt birimden fazla sentezlenmesi, bağımsız olarak arabinoz ve IPTG sırasıyla (Şek...

Tartışmalar

Proteinler olan üçüncül yapı uyumlarının ²⁵ arasında, sınırlı sayıda sınırlı değildir bölgeleri içeren, doğal olarak düzensiz olabilir. Bu düzensiz proteinler toplama ²⁵ genellikle eğilimli, ve onların izolasyon ve karakterizasyonu zor bir görev temsil edebilir. E. ε alt birimi coli DNA polimeraz III iki farklı etki yani ^26,27, özellikleri: i) N-ter etki, θ alt birimini bağlama 3'-5 'ekzonükleaz aktivitesini taşıyan ve yetkin; ii)...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix