I benefici multiforme Protein Co-espressione in<em&gt; Escherichia coli</em

Riepilogo

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Abstract

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introduzione

L'introduzione di tecnologie iperespressione impulso sia gli studi biochimici di basso numero di copie enzimi e la produzione industriale di proteine ​​farmacologicamente attive (ad esempio, insulina). Con l'avvento di queste tecnologie, progressi significativi sono stati raggiunti per aumentare la resa e la qualità delle proteine ​​ricombinanti. Inoltre, procariote ed eucariote ^{1,2 3} sistemi iperespressione sono stati sviluppati nel corso degli anni, offrendo alternative utili al "cavallo di lavoro" di proteine ​​biotecnologie, cioè, Escherichia coli. In particolare, la disponibilità di piattaforme alternative a E. coli ha portato alla produzione di peptidi o proteine ​​ricombinanti recanti modificazioni post-traduzionali. Tuttavia, va detto che E. coli rappresenta ancora l'organismo di riferimento per la produzione di proteine ​​ricombinanti. Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la più rilevante può essereconsiderato: i) la disponibilità di un certo numero di sistemi iperespressione (vettori di espressione e ceppi) per E. coli ^1,2; ii) i tempi breve generazione, e alti rendimenti biomassa, di E. coli in una varietà di media ricchi e sintetici; iii) la manipolazione facile né al biochimico e a livello genetico di questo microrganismo; iv) l'isolamento di ceppi capaci di produzione di proteine ​​tossiche ^4; v) la costruzione di ceppi caratterizzati induzione omogenea a livello di popolazione ^5,6. Inoltre, è stato recentemente dimostrato che i sistemi di espressione adatti per la produzione in E. coli di proteine ​​post- traslazione modificati può essere concepita e costruita ^2.

Allo stato attuale, la proteina sovraespressione è principalmente utilizzato per ottenere proteine ​​monomeriche o omo-oligomeri, le cui hypersynthesis può essere eseguita con un singolo gene clonato in un plasmide appropriata. Tuttavia, l'attenzione è stata recentementeversato alla costruzione di E. sistemi di proteine ​​co-espressione coli, sfidando la produzione, in vivo, di complessi etero-oligomerica ^2. È interessante notare che i primi esperimenti di proteine ​​co-espressione di fronte all'Assemblea inter-specie di grandi e piccole subunità di carbossilasi cianobatteri ribulosio-1,5-bisfosfato / ossigenasi ^7,8, e l'associazione di forme troncate e lungometraggi di HIV-1 trascrittasi inversa ^9. Questi studi pionieristici hanno dimostrato che la proteina co-espressione rappresenta una potente alternativa al tradizionale ricostituzione vitro. Inoltre, la proteina co-espressione in E. coli è stato usato per produrre diverse proteine ​​recanti modificazioni post-traduzionali ^2, per ottenere proteine ​​contenenti amminoacidi innaturali ^2, e per aumentare la resa di proteine ​​di membrana sovraespresso ^2. Inoltre, il potenziale della proteina co-espressione come uno strumento per conferire a E. coli competerence della secrezione di proteine ​​è sotto inchiesta attiva ^2.

Due strategie principali di proteine ​​co-espressione in E. coli può essere perseguito: i) l'uso di un singolo plasmide per ospitare diversi geni da sovraespresso; ii) l'uso di più plasmidi in singole cellule co-esprimono proteine ​​bersaglio. Nel primo caso, i criteri per la scelta del plasmide non differiscono da quelle dei tradizionali esperimenti singole proteine ​​iperespressione, anche se particolari plasmidi contenenti tandem elementi promotore / operatore stati costruiti per co-espressione ^10. Questo primo approccio è quindi molto semplice. Tuttavia, va detto che l'uso di un singolo plasmide co-esprimere proteine ​​diverse facce due grandi difficoltà: i) la massa molecolare del vettore aumenta con il numero di geni ospitati, limitando il numero di proteine ​​co-espresse; ii) quando più geni clonati sono sotto il controllo di un unico promotore, polarità può decreasall'e l'espressione dei geni distali dal promotore. L'uso di plasmidi doppi o multipli in un'unica E. coli deve compiere la compatibilità dei vettori di scelta, quindi imporre vincoli alle combinazioni ammissibili di plasmidi. Tuttavia, questa seconda strategia co-espressione presenta il vantaggio di contenere la massa molecolare di vettori, e limita la polarità. Recentemente abbiamo costruito un sistema di co-espressione della proteina progettato per facilitare la spola di geni tra plasmidi co-espressione ^11. In particolare, abbiamo costruito la serie vettori PGOOD, le caratteristiche rilevanti dei quali sono: i) origine p15A di replica, per garantire la compatibilità dei plasmidi PGOOD con i vettori commerciali che contiene l'origine ColE1 (ad esempio, la serie pBAD ^12); ii) una cassetta tetraciclina resistenza; iii) la presenza di lac -derived elementi regolatori, cioè, il promotore-operatore (O ₁₎ Coppia e Laci gene ^q. Utilizzando un adeguato paio pBAD-PGOOD, siamo stati in grado di iperespressione nucleo catalitico di E. DNA polimerasi coli III, composto da tre differenti subunità, cioè, α (il 'polimerasi, ε (3'-5 5'-3)' exonuclease) e θ (stabilizzazione ε) ^13. In particolare, abbiamo dimostrato che la co-espressione del complesso αεθ era strettamente dipendente dalla aggiunta alla E. coli terreno di coltura sia di IPTG e arabinosio, innescando sovraespressione da PGOOD e pBAD rispettivamente (Figura 1A).

Nella presente relazione, illustriamo come proteine ​​co-espressione può efficacemente risolvere le difficoltà legate alla scarsa solubilità di un complesso proteico subunità. Inoltre, si mostra come nei test di complementazione proteica vivo possono essere eseguiti, e abbiamo finalmente riportiamo l'uso di proteine ​​co-espressione di frequenza sintonizzare mutazione in E. coli. A questo scopo, abbiamo utilizzato le coppie PGOOD-PBAD idonei per illustrare esempi rilevanti di ciascun caso di studio.

Protocollo

1. Isolamento di E. coli Co-trasformanti

1. Preparare le cellule elettro-competente della appropriata E. coli da trasformare. Trasferimento a 1 ml di terreno LB (Triptone, estratto di lievito, NaCl a 10, 5, e 10 g / L, rispettivamente) una singola colonia del ceppo di scelta, e incubare a 37 ° C in stringono condizioni di 180 giri al minuto. Diluire la precoltura 1: 500 in 25 ml di mezzo fresco LB ed incubare la coltura a 37 ° C.
2. A log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 minuti), e risospendere il pellet in 10%, v / v sterile glicerolo-acqua ghiacciata nella metà del volume cultura originaria. Ripetere questa operazione 4 volte, dimezzando ogni volta il volume risospensione. Infine, risospendere il pellet in glicerolo / acqua e dividere la sospensione cellule in 50 microlitri aliquote. Conservare le aliquote a -80 ° C fino a 6 mesi.
3. Sciogliere il plasmide desiderato in acqua sterile integrato con EDTA 0,5 mm. Thaw su ice un'aliquota di cellule elettro-competente e mescolare con una quantità appropriata (2,5-5 ng) di vettore. Versare il composto in una vaschetta 0,1 centimetri adatto per elettroporazione, e applicare 1,8 kV.
4. Immediatamente trasferire le cellule elettroporate in 1 ml di terreno SOC (terreno LB integrato con 0,2% w / v di glucosio, 10 mM MgCl _2, 2.5 mM KCl), incubare per 1 ora sotto agitazione, e infine trasferire aliquote di 100 microlitri di piastre di Petri contenenti LB agar con l'antibiotico appropriato. Incubare O / N a 37 ° C.
5. Purificare trasformanti strisciando singole colonie su piastre di Petri.
6. Preparare le cellule elettro-competente dei trasformanti primari e ripetere i passaggi da 1.1 a 1.5 per trasformare con ulteriori plasmidi.
7. Preparare glicerolo scorte di co-trasformanti. Trasferimento di una singola colonia in LB addizionato con antibiotici appropriati, incubare a 37 ° C sotto agitazione, e al log-fase (0,6 OD) centrifugare la sospensione cellule a 5.000 xg per 20 min. Resuspend il pellet in LB-antibiotici mezzo contenente 15% v / v glicerolo. Distribuire in aliquote e conservare a - 80 ° C.

2. Co-espressione di α e ε subunità E. coli DNA polimerasi III

1. Trasferire con un'ansa sterile una piccola quantità di glicerolo magazzino ceppo appropriata (ad esempio, TOP10 / PGOOD-ε243 e TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, vedi Figura 1) in una capsula di Petri contenente terreno LB e antibiotici. Lasciate che le cellule di sospensione secca sulla piastra di Petri, e strisciare le cellule gocciolina. Incubare a 37 ° CO / N.
2. Trasferimento, utilizzando uno stuzzicadenti sterili, una singola colonia di 1 ml di LB-antibiotici medie. Incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire la precoltura 1: 500 in mezzo fresco e incubare a 30 ° C per 15 h.
3. Aggiungi IPTG, arabinosio, o arabinosio e IPTG, 1 mm ciascuna. Incubare a 30 ° C per 2,5 ore. Raccogliere le cellule, e memorizzare i pellet a -20 ° C.
4. Pellets Scongelare su ghiaccio e risospendere in tampone di lisi (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, ditiotreitolo 2,5 mm, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoruro (PMSF), pH 8). Omogeneizzare delicatamente la sospensione cellule con un vasaio vetro freddo.
5. Sonicare a 15 W per 15 secondi, seguito da 15 intervallo di raffreddamento sec (4 cicli).
6. Centrifugare gli estratti proteici totali a 10.000 xg per 20 minuti, a 4 ° C per recuperare la frazione solubile.
7. Analizzare mediante SDS-PAGE (12,5% acrilammide) aliquote di ogni estratto proteina solubile. A tale scopo, trasferire 20 microlitri di ogni estratto proteina solubile in provette Eppendorf contenenti 60 ml di H ₂ O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.

3. Co-espressione di α subunità di Deinococradiodurans CUS DNA polimerasi III e ε subunità di E. coli DNA polimerasi III

1. Preparare una precoltura della E. coli ceppo TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml di terreno LB-ampicillina-tetraciclina e incubare 8 ore a 37 ° C. Diluire 1: 1.000 in terreno fresco e incubare O / N a 37 ° C.
2. Diluire 1: 100 in 200 ml di mezzo fresco, incubare a 37 ° C per 3 ore, poi indurre per 3 ore con arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno. Raccogliere le cellule, e conservare il pellet a -20 ° C.
3. Risospendere il pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Mescolare e distruggere le cellule, come descritto in 2.4 e 2.5.
4. Centrifugare immediatamente le cellule lisato a 10.000 xg per 20 min. Eliminare il pellet. Filtrare il surnatante con un imbuto Buchner dotato di 3 strati di carta da filtro. Applicare dolce di vuoto. Per evitare eccessiva formazione di schiuma, mantenere la beuta vuoto su ghiaccio durante la filtrazione.
5. Determinare la concentrazione di proteine ​​secondo Bradford ^14.

4. Gel Filtration Chromatography

1. Equilibrare un 16X70-rivestito di acqua (200) colonna di gel filtrazione con 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. carico sulla colonna dell'estratto proteina solubile. Per una risoluzione ottimale, utilizzare un ciclo campione di 1 ml. Eseguire la cromatografia a 0.6 ml / min. Mantenere la temperatura della colonna a 4 ° C in tutto.
2. Raccogliere 0,9 ml frazioni e analizzare con SDS-PAGE. Trasferire 20 ml di ogni frazione rilevante per provette Eppendorf contenenti 60 ml di H ₂ O e 20 microlitri di tampone di caricamento (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanolo, 10% (w / v) di SDS, 50% ( v / v) di glicerolo, 0,25% (w / v) di blu di bromofenolo) e far bollire per 5 min. Carico 18 microlitri di ciascun campione ed eseguire l'elettroforesi a 140 V per circa 1,5 ore.
3. Determinare il 3'-5 'esonucleasi e l'attività della DNA polimerasi di ciascuna frazione in 96-cill micropiastre. Analizzare l'attività di esonucleasi 5'-utilizzando timidina monofosfato estere p-nitrofenil (p NP-TMP) come substrato ^15. Stima polimerasi DNA usando l'PPX (pirofosfatasi, Purine nucleoside fosforilasi, xantina ossidasi) enzima accoppiato dosaggio ¹⁶ e 2- (4-Iodophenyl) -3- (4-nitrofenil) -5-cloro fenil-2H-tetrazolio (INT) come accettore di elettroni ^16.

5. Mutazione Analisi delle popolazioni Co-esprimono la wild-type ε subunità di E. coli DNA polimerasi III e mutageni εD12A Variant

1. Trasferire una singola colonia di E. coli TOP10 contenente il pBAD-ε e le pGOOD1-εD12A ¹¹ vettori a 1 ml di LB-antibiotici media. Incubare O / N a 37 ° C.
2. Diluire la precoltura 1: 250 in 3 fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml), aggiungere le appropriate induttori (arabinosio, IPTG o arabinosio e IPTG, 1 mM ciascuno) e incubare a 37 ° Cper 8 ore. Preparare in culture non-indotta paralleli.
3. Raccogliere aliquote di 1 ml, poi diluito 1: 500 in nuove fiasche contenenti mezzo fresco (10 ml) integrato o meno con gli induttori appropriati. Incubare O / N a 37 ° C.
4. Ripetere i punti 5.2 e 5.3 e raccogliere aliquote di 1 ml.
5. Determinare il numero di generazioni è verificato in ciascuna cultura. Trasferimento su piastre LB, 100 ml di appropriate diluizioni seriali di inoculo e cultura. Incubare O / N a 37 ° C. Contare le colonie su piastre LB, e calcolare il logaritmo del numero di cellule presenti nel inoculo (log _I) e nella coltura alla fine della crescita (log _C). Per determinare il numero di generazioni, utilizzare la formula: (log _C - log _I) /0.301.
6. Centrifugare a 5.000 xg per 20 min e risospendere le cellule in 1 ml di 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Per permeabilize le celle, aggiungere 2-3 gocce di cloroformio e vortex per 20 sec.
7. Determinare il β-Attività glucosidasi di ciascuna aliquota in una micropiastra a 96 pozzetti, utilizzando p -nitrophenyl-β-D-glucopiranoside (PNPGluc) come substrato. Aggiungere a ciascun pozzetto 100 l di cellule permeabilizzate e 100 ml di substrato (16 mg / ml soluzione madre in H ₂ O). Fare attenzione ad evitare bolle d'aria nei pozzetti. Leggere l'assorbanza a 420 nm, utilizzando un lettore di micropiastre e il filtro appropriato.

Risultati

La subunità ε di E. coli DNA polimerasi III è composto da 243 aminoacidi e dispone di scarsa solubilità ^17,18, a meno che i residui 187-243 vengono cancellati ^17. Tuttavia, abbiamo già dimostrato ¹¹ che il co-espressione di α full-length, ε, e subunità θ produce solubile DNA polimerasi III nucleo catalitico (Figura 1). In particolare, utilizzando il sistema pBAD-PGOOD co-espressione, abbiamo dimostrato che: i) la sovraespressione di α e subunità ε pu...

Discussione

Le proteine ​​possono essere intrinsecamente disordinato, con le regioni la cui struttura terziaria non è limitata a un numero limitato di conformazioni ^25. Queste proteine ​​sono disordinati solito incline all'aggregazione ^25, e l'isolamento e la caratterizzazione potrebbero rappresentare un compito difficile. La subunità ε di E. DNA polimerasi coli III dispone di due domini distinti ^26,27, vale a dire: i) il dominio N-ter, recante la 'attività ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix