Las multifacéticas beneficios de la proteína co-expresión en<em&gt; Escherichia coli</em

Resumen

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Resumen

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Introducción

La introducción de tecnologías de sobreexpresión impulsado cualquiera de los estudios bioquímicos de las enzimas bajo número de copias y la producción industrial de proteínas farmacológicamente activas (por ejemplo, insulina). Desde la llegada de estas tecnologías, los avances se han logrado importantes para aumentar el rendimiento y la calidad de las proteínas recombinantes. Además, los sistemas de sobreexpresión procariotas y eucariotas ^{1,2 3} fueron desarrollados en los últimos años, ofreciendo alternativas útiles a la "caballo de batalla" de la biotecnología de proteínas, es decir, la Escherichia coli. En particular, la disponibilidad de plataformas alternativas a E. coli condujo a la producción de péptidos o proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales recombinantes. Sin embargo, se debe mencionar que la E. coli sigue siendo el organismo de elección para la producción de proteínas recombinantes. Esto se debe a varios factores, entre los cuales los más relevantes se puedenconsiderado: i) la disponibilidad de un buen número de sistemas de sobreexpresión (vectores de expresión y cepas) para E. coli ^1,2; ii) veces el corto generación y altos rendimientos de biomasa, de E. coli en una variedad de medios ricos y sintético; iii) la fácil manipulación ya sea en la bioquímica y en el nivel genético de este microorganismo; iv) el aislamiento de cepas capaces de la producción de proteínas tóxicas ^4; v) la construcción de cepas que ofrecen inducción homogénea a nivel de población ^5,6. Además, se ha demostrado recientemente que los sistemas de expresión adecuados para la producción en E. coli de proteínas después de la traducción modificados se puede diseñar y construir ^2.

En la actualidad, la sobreexpresión de proteínas se utiliza principalmente para obtener proteínas monoméricas o homo-oligómero, cuyos hiperproducción se puede realizar con un solo gen clonado en un plásmido apropiado. Sin embargo, la atención fue recientementepagado a la construcción de E. sistemas de la proteína co-expresión de E. coli, desafiando la producción, in vivo, de complejos hetero-oligoméricos ^2. Curiosamente, los primeros experimentos de la proteína co-expresión se dirigieron a la asamblea inter-especies de grandes y pequeñas subunidades de carboxilasa cianobacterias ribulosa-1,5-bisfosfato / oxigenasa ^7,8, y la asociación de formas truncadas y de longitud completa de VIH-1 transcriptasa inversa ^9. Estos estudios pioneros demostraron que la proteína co-expresión representa una poderosa alternativa a los tradicionales en la reconstitución in vitro. Además, la proteína co-expresión en E. coli se utilizó para producir diferentes proteínas que llevan modificaciones post-traduccionales ^2, para obtener proteínas que contienen aminoácidos no naturales ^2, y para aumentar el rendimiento de proteínas de la membrana sobreexpresados ^​​2. Por otra parte, el potencial de la proteína co-expresión como una herramienta para confiere a E. coli competirna vez en la secreción de la proteína está bajo investigación activa ^2.

Dos estrategias principales de proteínas co-expresión en E. coli puede perseguirse: i) el uso de un único plásmido para albergar los diferentes genes que se sobreexpresa; ii) el uso de múltiples plásmidos en células individuales para co-expresar las proteínas diana. En el primer caso, los criterios para la elección del plásmido no difieren de las de los experimentos de sobreexpresión de la proteína individuales tradicionales, aunque plásmidos particulares que contienen elementos en tándem promotor / operador se construyeron para la co-expresión ^10. Por tanto, esta primera aproximación es bastante simple. Sin embargo, se debe mencionar que el uso de un único plásmido para co-expresar diferentes proteínas se enfrenta a dos dificultades principales: i) la masa molecular de los vectores aumenta con el número de genes alojados, lo que limita el número de proteínas co-expresó; ii) cuando múltiples genes se clonan bajo el control de un único promotor, de polaridad puede decrease la expresión de los genes distales del promotor. El uso de plásmidos dobles o múltiples en una sola E. células de E. coli tiene que lograr la compatibilidad de los vectores de elección, por lo tanto, la imposición de limitaciones a las combinaciones admisibles de plásmidos. Sin embargo, esta segunda estrategia de co-expresión cuenta con la ventaja de contener la masa molecular de los vectores, y limita la polaridad. Recientemente hemos construido un sistema de co-expresión de la proteína diseñada para facilitar el vaivén de genes entre los plásmidos co-expresión ^11. En particular, se construyó la serie vectores PGOOD, las características relevantes de los cuales son los siguientes: i) un origen de replicación p15A, para proporcionar compatibilidad de los plásmidos PGOOD con los vectores comerciales que contiene el origen ColE1 (por ejemplo, la serie pBAD ^12); ii) un casete de resistencia a tetraciclina; iii) la presencia de lac -derivado elementos reguladores, es decir, el promotor-operador (O ₁₎ par y el lacI ^q gen. El uso de un par pBAD-PGOOD apropiado, hemos sido capaces de sobreexpresan el núcleo catalítico de E. coli DNA polimerasa III, compuesto de tres subunidades diferentes, es decir, α (la 'de la polimerasa, ε (la 3'-5 5'-3)' exonucleasa) y θ (ε estabilización) ^13. En particular, hemos demostrado que la co-expresión del complejo αεθ era estrictamente dependiente de la adición a la E. coli medio de cultivo tanto de IPTG y arabinosa, desencadenando la sobreexpresión de PGOOD y pBAD, respectivamente (Figura 1A).

En el presente informe, se expone cómo la proteína co-expresión puede resolver eficientemente las dificultades vinculadas a la mala solubilidad de una subunidad de proteína compleja. Además, se muestra cómo en ensayos de complementación de proteínas in vivo se pueden realizar, y finalmente nos informe sobre el uso de la proteína co-expresión de la frecuencia de mutación sintonizar E. columnayo. Para ello, utilizamos parejas PGOOD-PBAD adecuados para ilustrar ejemplos relevantes de cada estudio de caso.

Protocolo

1. Aislamiento de E. coli cotransformantes

1. Preparar las células electro-competente del E. apropiado cepa de E. coli que se transforma. Traslado a 1 ml de medio LB (triptona, extracto de levadura, NaCl a 10, 5, y 10 g / l, respectivamente) de una sola colonia de la cepa de elección, y se incuba a 37 ° C bajo condiciones de agitación de 180 rpm. Diluir el precultivo 1: 500 en 25 ml de medio LB fresco y se incuba el cultivo a 37 ° C.
2. En fase logarítmica (0,6 OD) centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min), y resuspender el pellet en 10%, v / v de glicerol-agua estéril enfriada con hielo en la mitad del volumen de cultivo original. Repita este paso 4 veces, reducir a la mitad cada vez que el volumen de resuspensión. Por último, volver a suspender el sedimento en glicerol / agua y dividir la suspensión de células en 50 ml de alícuotas. Almacene las alícuotas a -80 ° C hasta 6 meses.
3. Disolver el plásmido deseado en agua estéril suplementado con EDTA 0,5 mM. Deshielo en ice una alícuota de células electro-competente y mezclar con una cantidad apropiada (2,5-5 ng) de vector. Dispensar la mezcla en una cubeta de 0,1 cm adecuado para electroporación, y aplicar 1,8 kV.
4. Inmediatamente transferir las células a electroporación en 1 ml de medio SOC (medio LB suplementado con 0,2% w / v de glucosa, 10 mM de MgCl _2, KCl 2,5 mM), se incuba durante 1 h bajo agitación, y, finalmente, transferir 100 ml de alícuotas a placas de Petri que contiene agar LB con el antibiótico apropiado. Incubar O / N a 37 ° C.
5. Purifica los transformantes estriando colonias individuales en placas de Petri.
6. Preparar las células electro-competentes de los transformantes primarios y repita los pasos 1.1 a 1.5 para transformar con otros plásmidos.
7. Preparar las existencias de glicerol de los co-transformantes. Transferencia de una sola colonia en LB suplementado con los antibióticos apropiados, se incuba a 37 ° C bajo agitación, y en fase logarítmica (0,6 OD) Centrifugar la suspensión de células a 5.000 xg durante 20 min. Resuspend el sedimento en LB-antibióticos que contienen medio de 15% v / v de glicerol. Distribuir en alícuotas y almacenar a - 80 ° C.

2. Co-expresión de α y ε Subunidades de E. coli ADN polimerasa III

1. Transferencia con un asa estéril una pequeña cantidad de la glicerol cepa apropiada (por ejemplo, TOP10 / PGOOD-ε243 y TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, véase la Figura 1) en una placa de Petri que contenían medio LB y los antibióticos. Deje que la células suspensión seca en la placa de Petri, y la racha de las células de las gotas. Se incuba a 37 ° CO / N.
2. Transfer, usando un palillo de dientes estéril, una sola colonia de 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir el precultivo 1: 500 en medio fresco y se incuba a 30 ° C durante 15 hr.
3. Añadir IPTG, arabinosa, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno. Se incuba a 30 ° C durante 2,5 horas. Recoger las células, y almacenar los pellets a -20 ° C.
4. Pellets de descongelación en hielo y se resuspende en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, ditiotreitol 2,5 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), pH 8). Homogeneizar suavemente la suspensión de células con un alfarero vaso frío.
5. Someter a ultrasonidos a 15 W durante 15 segundos, seguido por 15 seg intervalo de refrigeración (4 ciclos).
6. Centrifugar los extractos de proteínas totales a 10.000 xg durante 20 min, a 4 ° C para recuperar la fracción soluble.
7. Analizar por alícuotas de cada extracto de proteína soluble SDS-PAGE (12,5% de acrilamida). Para este objetivo, transferir 20 l de cada extracto de proteína soluble a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H ₂ O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr.

3. Co-expresión de la subunidad α de Deinococradiodurans CUS ADN polimerasa III y ε Subunidad de E. coli ADN polimerasa III

1. Preparar un cultivo previo de la E. coli cepa TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 en 1 ml de medio LB-ampicilina-tetraciclina e incubar 8 horas a 37 ° C. Diluir 1: 1000 en medio fresco y se incuba O / N a 37 ° C.
2. Diluir 1: 100 en 200 ml de medio fresco, se incuba a 37 ° C durante 3 horas, a continuación, inducir durante 3 horas con arabinosa y IPTG, 1 mM de cada uno. Recoger las células, y almacenar el pellet a -20 ° C.
3. Resuspender el precipitado en 50 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Homogeneizar y romper las células como se describe en 2.4 y 2.5.
4. Inmediatamente Centrifugar las células lisado a 10.000 xg durante 20 min. Deseche la pastilla. Se filtra el sobrenadante con un embudo Büchner equipado con 3 capas de papel de filtro. Aplicar vacío suave. Para evitar la excesiva formación de espuma, mantenga el matraz Erlenmeyer vacío en hielo durante la filtración.
5. Determinar la concentración de proteína de acuerdo con Bradford ^14.

4. Cromatografía de filtración en gel

1. Equilibrar la columna de filtración en gel un 16x70 con camisa de agua (200) con 50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, pH 8. carga sobre la columna del extracto de proteína soluble. Para una resolución óptima, utilice un bucle de muestra de 1 ml. Realizar la cromatografía en 0,6 ml / min. Mantenga temperatura de la columna a 4 ° C en todo.
2. Recoger fracciones de 0,9 ml y analizarlas por SDS-PAGE. Transferencia de 20 l de cada fracción correspondiente a tubos Eppendorf que contienen 60 l de H ₂ O y 20 l de tampón de carga (Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, 10 mM β-mercaptoetanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) de glicerol, 0,25% (w / v) de azul de bromofenol) y hervir durante 5 min. Cargar 18 l de cada muestra y realizar la electroforesis a 140 V durante aproximadamente 1,5 hr.
3. Determinar la 3'-5 'exonucleasa y la actividad de la ADN polimerasa de cada fracción en 96-nosll microplacas. Ensayar la actividad exonucleasa usando timidina 5'-monofosfato de éster p-nitrofenil (p NP-TMP) como sustrato ^15. Estimar la actividad de la polimerasa de ADN utilizando la PPX (pirofosfatasa, purina nucleósido fosforilasa, la xantina oxidasa) de la enzima de acoplamiento de ensayo de ¹⁶ y 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5-fenil-2H-tetrazolio (INT) como aceptor de electrones ^16.

5. Mutación análisis de las poblaciones Co-expresan la subunidad ε de tipo silvestre de E. coli ADN polimerasa III y la mutagénico εD12A Variant

1. Transferir una sola colonia de E. coli TOP10 contiene el pBAD-ε y los pGOOD1-εD12A ¹¹ vectores a 1 ml de medio LB-antibióticos. Incubar O / N a 37 ° C.
2. Diluir el precultivo 1: 250 en 3 matraces que contenían medio fresco (10 ml), agregar los inductores apropiados (arabinosa, IPTG, o arabinosa y IPTG, 1 mM cada uno) y se incuba a 37 ° Cdurante 8 horas. Preparar cultivos paralelos no inducidas.
3. Recoger alícuotas de 1 ml, luego se diluye 1: 500 en los nuevos matraces que contienen medio fresco (10 ml) suplementado o no con los inductores apropiados. Incubar O / N a 37 ° C.
4. Repita los pasos 5.2 y 5.3 y recoger alícuotas de 1 ml.
5. Determinar el número de generaciones se produjo en cada cultura. Traslado en placas de LB, 100 l de diluciones en serie apropiadas de inóculo y la cultura. Incubar O / N a 37 ° C. Contar las colonias en las placas de LB, y calcular el registro del número de células presentes en el inóculo (log _I) y en el cultivo al final del crecimiento (log _C). Para determinar el número de generaciones, utilice la fórmula: (log _C - log _I) /0.301.
6. Centrifugar a 5000 xg durante 20 min y resuspender las células en 1 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,6, NaCl 50 mM. Para permeabilizar las células, añadir 2-3 gotas de cloroformo y agitar durante 20 segundos.
7. Determinar la β-actividad glucosidasa de cada alícuota en una microplaca de 96 pocillos, usando p-nitrofenil-β-D-glucopiranósido (PNPGluc) como sustrato. Añadir a cada pocillo 100 l de células permeabilizadas y 100 l de sustrato (16 mg / ml solución madre en H ₂ O). Tenga cuidado para evitar las burbujas de aire en los pozos. Leer la absorbancia a 420 nm, usando un lector de microplacas y el filtro apropiado.

Resultados

La subunidad ε de E. coli ADN polimerasa III consta de 243 aminoácidos y tiene poca solubilidad ^17,18, a menos que se eliminan los residuos 187-243 ^17. Sin embargo, hemos demostrado que el ¹¹ co-expresión de α de longitud completa, ε y θ subunidades produce ADN polimerasa III soluble núcleo catalítico (Figura 1). En particular, utilizando el sistema de pBAD-PGOOD co-expresión, hemos demostrado que: i) la sobreexpresión de α y ε subunidades puede ser ...

Discusión

Las proteínas pueden ser intrínsecamente desordenados, con regiones cuya estructura terciaria no está restringido a un número limitado de conformaciones ^25. Estas proteínas desordenadas son generalmente propensos a la agregación ^25, y su aislamiento y caracterización pueden representar una tarea difícil. La subunidad ε de E. coli DNA polimerasa III tiene dos dominios distintos ^26,27, a saber: i) el dominio N-ter, teniendo la 'actividad exonucleasa 3'-5, y compet...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix