Die vielfältigen Vorteile von Protein Co-expression in<em&gt; Escherichia coli</em

Zusammenfassung

Protein co-expression is a powerful alternative to the reconstitution in vitro of protein complexes, and is of help in performing biochemical and genetic tests in vivo. Here we report on the use of protein co-expression in Escherichia coli to obtain protein complexes, and to tune the mutation frequency of cells.

Zusammenfassung

We report here that the expression of protein complexes in vivo in Escherichia coli can be more convenient than traditional reconstitution experiments in vitro. In particular, we show that the poor solubility of Escherichia coli DNA polymerase III ε subunit (featuring 3’-5’ exonuclease activity) is highly improved when the same protein is co-expressed with the α and θ subunits (featuring DNA polymerase activity and stabilizing ε, respectively). We also show that protein co-expression in E. coli can be used to efficiently test the competence of subunits from different bacterial species to associate in a functional protein complex. We indeed show that the α subunit of Deinococcus radiodurans DNA polymerase III can be co-expressed in vivo with the ε subunit of E. coli. In addition, we report on the use of protein co-expression to modulate mutation frequency in E. coli. By expressing the wild-type ε subunit under the control of the araBAD promoter (arabinose-inducible), and co-expressing the mutagenic D12A variant of the same protein, under the control of the lac promoter (inducible by isopropyl-thio-β-D-galactopyranoside, IPTG), we were able to alter the E. coli mutation frequency using appropriate concentrations of the inducers arabinose and IPTG. Finally, we discuss recent advances and future challenges of protein co-expression in E. coli.

Einleitung

Die Einführung der Überexpression Technologien erhöht entweder die biochemische Untersuchungen von niedriger Kopienzahl Enzyme und die industrielle Herstellung von pharmakologisch aktiven Proteinen (zB Insulin). Seit der Einführung dieser Technologien wurden erhebliche Fortschritte erzielt worden, um die Ausbeute und Qualität von rekombinanten Proteinen zu erhöhen. Darüber hinaus wurden ^1,2 prokaryotischen und eukaryotischen ³ Überexpression Systeme über die Jahre entwickelt und bietet sinnvolle Alternativen zu dem "Arbeitspferd" der Proteinbiotechnologie, also Escherichia coli. Insbesondere die Verfügbarkeit von alternativen Plattformen E. coli führte zur Produktion von rekombinanten Peptiden oder Proteinen, die post-translationale Modifikationen. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass E. coli stellt noch immer den Organismus der Wahl für die Produktion rekombinanter Proteine. Dies ist auf mehrere Faktoren, von denen die relevantesten sein kannberücksichtigt: i) die Verfügbarkeit von einer ganzen Reihe von Überexpression Systeme (Expressionsvektoren und Stämme) für E. coli ^1,2; ii) die kurze Generationszeiten und hohe Biomasseerträge, der E. coli in einer Vielzahl von reichen und synthetische Medien; iii) die leichte Manipulation entweder auf biochemischer und genetischer Ebene dieses Mikroorganismus; iv) die Isolierung der Stämme, die die Produktion von toxischen Proteinen ^4; v) die Konstruktion von Stämmen mit homogenen Induktion auf Bevölkerungsebene ^5,6. Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass Expressionssysteme für die Produktion in E. coli von posttranslational modifizierten Proteinen entwickelt werden können, und ² aufgebaut.

Gegenwärtig wird die Proteinexpression vor allem zur monomeren oder homo-oligomere Proteine, deren hypersynthesis kann mit einem einzigen Gen in ein geeignetes Plasmid kloniert geführt werden erhalten. Doch vor kurzem war die Aufmerksamkeitfür den Bau von E. bezahlt coli-Protein co-Expressionssysteme, gegen die Produktion, in vivo, der Hetero oligomeren Komplexen ^2. Interessanterweise frühen Experimenten von Protein Co-Expression adressiert die Interspezies-Montage von großen und kleinen Untereinheiten der Cyanobakterien Ribulose-1,5-Bisphosphat-Carboxylase / Oxygenase ^7,8, und die Assoziation von abgeschnitten und in voller Länge Formen von HIV-1- ^{Reverse-Transkriptase-9.} Diese bahnbrechenden Studien gezeigt, dass Protein Co-Expression stellt eine leistungsstarke Alternative zu herkömmlichen in vitro Rekonstitution. Zusätzlich Protein Co-Expression in E. coli wurde verwendet, um verschiedene Proteine ​​tragen post-translationale Modifikationen ² zu produzieren, um Proteine, die unnatürliche Aminosäuren ² zu erhalten, und die Ausbeute an überexprimiert Membranproteine ^​​2 zu erhöhen. Ferner wird das Potential der Protein Coexpression als Werkzeug zum E. verleihen coli Wettbewerbnce in Proteinsekretion ist aktiv untersucht ^2.

Zwei Hauptstrategien von Protein Co-Expression in E. coli können verfolgt werden: i) die Verwendung eines einzigen Plasmid, um die verschiedenen Gene Gastgeber zu überexprimiert wird; ii) die Verwendung von mehreren Plasmiden in einzelnen Zellen zu co-exprimieren, die Zielproteine. Im ersten Fall müssen die Kriterien für die Auswahl von Plasmid nicht von denen der traditionellen einzelnen Proteinexpression Experimente unterscheiden, auch wenn insbesondere Plasmide, die Tandem-Promotor / Operator-Elemente wurden für die Co-Expression ¹⁰ aufgebaut. Dieser erste Ansatz ist daher ganz einfach. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass die Verwendung von einem einzigen Plasmid zu co-exprimieren verschiedene Proteine ​​vor zwei Hauptschwierigkeiten: i) die Molekularmasse des Vektors mit der Anzahl von bereitgestellten Gene, wodurch die Anzahl der co-exprimierten Proteine; ii) wenn mehrere Gene unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors kloniert, können Polarität Verklee die Expression der Gene, die distal von dem Promotor. Die Verwendung von Doppel- oder Mehrfach Plasmide in Einzel E. coli-Zellen hat, um die Kompatibilität der Vektoren der Wahl zu erreichen, daher Ohne Zwang auf die förderfähigen Kombinationen von Plasmiden. Diese zweite Co-Expression Strategie verfügt jedoch den Vorteil, das die Molekülmasse von Vektoren und begrenzt Polarität. Wir haben vor kurzem gebaut ein Protein Co-Expressionssystem entwickelt, um die Pendel von Genen zwischen den Co-Expressionsplasmide ¹¹ zu erleichtern. Insbesondere konstruierten wir das PGOOD Vektoren Serie, die relevanten Merkmale davon sind: i) einem p15A-Replikationsursprung, um die Kompatibilität der PGOOD Plasmide mit den kommerziellen Vektoren, die den ColE1 Ursprung (zB den pBAD-Serie ¹²⁾ bereitzustellen; ii) ein Tetracyclin-Resistenz-Kassette; iii) die Anwesenheit von lac abgeleitete regulatorische Elemente, dh der Promotor-Operator (O ₁₎ Paar und das lacI ^q Gen. Unter Verwendung eines geeigneten pBAD-PGOOD Paar, waren wir in der Lage, den katalytischen Kern von E. überexprimieren coli-DNA-Polymerase III, die aus drei verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzt ist, das heißt, α (der 5'-3'-Polymerase), ε (der 3'-5'-Exonuklease) und θ (Stabilisierungs ε) ^13. Insbesondere haben wir gezeigt, dass die Co-Expression des αεθ Komplex war streng abhängig von der zusätzlich zu dem E. coli-Kulturmedium sowohl IPTG und Arabinose, Auslösung Expression von PGOOD und pBAD, bzw. (1A).

In diesem Bericht zeigen wir, wie Protein Co-Expression effizient Schwierigkeiten der schlechten Löslichkeit von einem Proteinkomplex Untereinheit verbunden zu lösen. Darüber hinaus zeigen wir, wie in vivo Protein Ergänzung Tests durchgeführt werden, und wir endlich über die Verwendung von Protein Co-Expression zu stimmen Mutationsfrequenz in E. berichten colich a. Zu diesem Zweck haben wir PGOOD-pBAD Paare geeignet, relevante Beispiele für jede Fallstudie veranschaulichen.

Protokoll

1. Isolierung von E. coli Cotransformanten

1. Bereiten elektrokompetenten Zellen des entsprechenden E. coli-Stamm transformiert werden. Transfer zum 1 ml LB-Medium (Trypton, Hefeextrakt, NaCl bei 10, 5 und 10 g / L, respectively) einer Einzelkolonie des Stammes der Wahl, und bei 37 ° C unter Schütteln Bedingungen von 180 Umdrehungen pro Minute. Verdünne die Vorkultur 1: 500 in 25 ml frischem LB-Medium und Inkubation der Kultur bei 37 ° C.
2. Bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 5.000 × g für 20 min), und das Pellet in 10%, v / v eiskaltes steriles Glycerin-Wasser in die Hälfte des ursprünglichen Kulturvolumens. Wiederholen Sie diesen Schritt 4 Mal, jedes Mal, wenn die Halbierung der Resuspensionsvolumen. Schließlich das Pellet in Glycerin / Wasser und teilen Sie die Zellsuspension in 50 ul Aliquots. Bewahren Sie die Aliquots bei -80 ° C bis zu 6 Monaten.
3. Lösen Sie das gewünschte Plasmid in sterilem Wasser mit 0,5 mM EDTA ergänzt. Thaw auf ice ein Aliquot elektrokompetenter Zellen und Mischen mit einer geeigneten Menge (2,5-5 ng) des Vektors. Abgeben der Mischung in eine 0,1 cm-Küvette für Elektroporation und gelten 1,8 kV.
4. Die elektroporierten Zellen unmittelbar Transfer in 1 ml SOC-Medium (LB-Medium mit 0,2% w / v Glucose, 10 mM MgCl _2, 2,5 mM KCl ergänzt), Inkubation für 1 h unter Schütteln und schließlich dann 100 ul Aliquots auf Petrischalen, LB-Agar mit dem entsprechenden Antibiotikum. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
5. Reinige die Transformanten durch Ausstreichen von Einzelkolonien auf Petrischalen.
6. Bereiten von elektrokompetenten Zellen der primären Transformanten und die Schritte 1.1 bis 1.5 mit weiteren Plasmide transformieren.
7. Bereiten Glycerin Aktien der Co-Transformanten. Übertragen einer einzelnen Kolonie in LB mit den geeigneten Antibiotika ergänzt, bei 37 ° C unter Schütteln und bei log-Phase (0,6 OD) Zentrifuge die Zellen Suspension bei 5000 g für 20 min. Resuspend des Pellets in LB-Medium, das Antibiotika, 15% v / v Glycerin. Dispense in Aliquots und Lagerung ist - 80 ° C.

2. Die Co-Expression von α und ε-Untereinheiten von E. coli DNA Polymerase III

1. Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife eine kleine Menge des entsprechenden Stammes Glycerolstammlösung (zB TOP10 / PGOOD-ε243 und TOP10 / PGOOD-ε243-θ / pBADα1160, siehe Abbildung 1) in eine Petrischale mit LB-Medium und Antibiotika. Lassen Sie die Zellsuspension trocken auf die Petrischale, und streifen die Zellen Tröpfchen. Bei 37 ° CO / N.
2. Transfer mit einem sterilen Zahnstocher eine einzelne Kolonie zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren 8 h bei 37 ° C. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 500 in frischem Medium und Inkubation bei 30 ° C für 15 Stunden.
3. Fügen IPTG, Arabinose, oder Arabinose und IPTG, 1 mM jeweils. Inkubiere bei 30 ° C für 2,5 Std. Sammeln Sie die Zellen, und die Pellets lagern bei -20 ° C.
4. Tau-Pellets auf Eis und Resuspendieren in Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2,5 mM Dithiothreitol, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), pH 8). Homogenisierung vorsichtig die Zellsuspension mit einem kalten Glas Töpfer.
5. Ultraschallbehandlung bei 15 W für 15 Sekunden, gefolgt von 15 Sekunden Kühlintervall (4 Zyklen).
6. Zentrifugieren der Gesamtproteinextrakte bei 10.000 × g für 20 min bei 4 ° C, um die lösliche Fraktion zu gewinnen.
7. Analyse durch SDS-PAGE (12,5% Acrylamid) Aliquots jeder löslichen Proteinextrakt. Zu diesem Zweck übertragen 20 ul jeder löslichen Proteinextrakt in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H ₂ O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% (v / v) Glycerin, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.

3. Co-Expression der α-Untereinheit des Deinococcus durans DNA Polymerase III und ε-Untereinheit von E. coli DNA Polymerase III

1. Bereiten Sie eine Vorkultur des E. coli-Stamm TOP10 / pBAD-α Dr / PGOOD-ε243 in 1 ml LB-Ampicillin-Tetracyclin Medium und Inkubation 8 h bei 37 ° C. Gebrauchslösung: 1: 1000 in frischem Medium und Inkubation O / N bei 37 ° C.
2. Verdünne 1: 100 in 200 ml frischem Medium, Inkubation bei 37 ° C für 3 Stunden inkubiert, anschließend für 3 h mit Arabinose und IPTG, 1 mM jedes induzieren. Ernten Sie die Zellen, und speichern Sie das Pellet bei -20 ° C.
3. Das Pellet in 50 mM Tris-HCl pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF. Homogenisieren und stören die Zellen wie in 2.4 und 2.5 beschrieben.
4. Unmittelbar Zentrifuge die Zellen Lysat bei 10.000 × g für 20 min. Entsorgen Sie das Pellet. Den Überstand mit einem Büchner-Trichter mit 3 Lagen Filterpapier ausgestattet. Bewerben leichtem Vakuum. Um eine übermäßige Schaumbildung zu vermeiden, halten das Vakuum-Erlenmeyerkolben auf Eis während der Filtration.
5. Bestimmen der Proteinkonzentration nach Bradford ^14.

4. Gelfiltrationschromatographie

1. Äquilibrieren einem mit Wassermantel 16x70 (200) Gelfiltrationssäule mit 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8. Laden auf die Säule die löslichen Proteinextrakt. Für die optimale Auflösung, verwenden Sie ein 1 ml Probenschleife. Führen Sie die Chromatographie bei 0,6 ml / min. Halten Säulentemperatur bei 4 ° C im gesamten.
2. Sammeln 0,9 ml-Fraktionen und zu analysieren durch SDS-PAGE. Transfer 20 ul jeder relevanten Fraktion in Eppendorf-Röhrchen, enthaltend 60 & mgr; l H ₂ O und 20 & mgr; l Ladepuffer (250 mM Tris-HCl pH 6,8, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10% (w / v) SDS, 50% ( v / v) Glycerol, 0,25% (w / v) Bromphenolblau) eingestellt und die Mischung 5 min. Last 18 ul jeder Probe und führen Sie die Elektrophorese bei 140 V für ca. 1,5 Stunden.
3. Bestimmen die 3'-5'-Exonuclease und der DNA-Polymerase-Aktivität von jeder Fraktion in 96-well Mikrotiterplatten. Assay wird die Exonukleaseaktivität mit Thymidin-5'-monophosphat-p-nitrophenylester (p NP-TMP) als das Substrat ^15. Abzuschätzen DNA-Polymerase-Aktivität unter Verwendung des PPX (Pyrophosphatase, Purinnucleosidphosphorylase, Xanthinoxidase) enzymgekoppelten Assay ¹⁶ und 2- (4-Jodphenyl) -3- (4-nitrophenyl) -5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (INT) als Elektronenakzeptor ^16.

5. Mutationsanalyse von Populationen Co-Expression des Wildtyp-ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III und die mutagene εD12A Variant

1. Übertragen einer Einzelkolonie von E. coli TOP10, die das pBAD-ε und die pGOOD1-εD12A ¹¹ Vektoren zu 1 ml LB-Medium Antibiotika. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
2. Verdünnen Sie die Vorkultur 1: 250 in 3-Kolben mit frischem Medium (10 ml), fügen Sie die entsprechenden Induktoren (Arabinose, IPTG oder Arabinose und IPTG 1 mM jeweils) und bei 37 ° C8 h. Bereiten parallel nicht-induzierten Kulturen.
3. Sammeln Aliquots von 1 ml, dann verdünnt 1: 500 in neue Kolben mit frischem Medium (10 ml) ergänzt oder nicht mit den entsprechenden Induktoren. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
4. Wiederholen Sie die Schritte 5.2 und 5.3 und sammeln Aliquots von 1 ml.
5. Bestimmung der Anzahl der Generationen in jeder Kultur aufgetreten. Übertragen auf LB-Platten, 100 & mgr; l geeignete Verdünnungen des Inokulums und der Kultur. Inkubieren Sie O / N bei 37 ° C. Die Kolonien auf den LB-Platten, und berechnet den Logarithmus der Anzahl der im Inokulum vorhanden ist (log _I) und in der Kultur am Ende des Wachstums (log _C) Zellen. Um die Anzahl der Generationen zu bestimmen, verwenden Sie die Formel: (log _C - log _I) /0.301.
6. Zentrifuge bei 5000 × g für 20 min, und die Zellen werden in 1 ml 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 50 mM NaCl. Um die Zellen durchlässig, fügen Sie 2-3 Tropfen Chloroform und Vortex für 20 Sekunden.
7. Bestimmen Sie die β-Glukosidase Aktivität jedes Aliquot in einer 96-Well-Mikroplatte, unter Verwendung von p-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPGluc) als Substrat. Hinzufügen zu jeder Vertiefung 100 ul der permeabilisierten Zellen und 100 ul Substrat (16 mg / ml Stammlösung in H ₂ O). Achten Sie auf Luftblasen in den Vertiefungen zu vermeiden. Die Absorption bei 420 nm unter Verwendung eines Mikroplatten-Lesegerät und den entsprechenden Filter.

Ergebnisse

Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III aus 243 Aminosäuren und verfügt Schwerlöslichkeit ^17,18, wenn die Stoffreste 187-243 deletiert ^17. Allerdings haben wir früher gezeigt haben, dass ¹¹ die Co-Expression von Volllängen-α, ε und θ-Untereinheiten ergibt lösliche DNA-Polymerase III katalytischen Kern (Abbildung 1). Insbesondere unter Verwendung des pBAD-PGOOD Co-Expressionssystem, zeigten wir, dass: i) die Überexpression von α und ε-Unter...

Diskussion

Proteine ​​können sich nicht in Ordnung sein, mit Regionen, deren Tertiärstruktur ist nicht auf eine begrenzte Anzahl von Konformationen, ²⁵ beschränkt. Diese ungeordnete Proteine ​​sind in der Regel anfälliger für Aggregation ^25, und deren Isolierung und Charakterisierung könnte eine schwierige Aufgabe darstellen. Die ε-Untereinheit der E. coli-DNA-Polymerase III verfügt über zwei getrennte Bereiche ^26,27, und zwar: i) die N-ter-Domain, mit dem 3'-5'-Ex...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Agar	Sigma-Aldrich	A1296
Ampicillin	Sigma-Aldrich	A9518
Chloroform	Sigma-Aldrich	288306
EDTA	Sigma-Aldrich	EDS
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
INT	Sigma-Aldrich	I8377
IPTG	Sigma-Aldrich	I5502
KCl	Sigma-Aldrich	P9541
L-Arabinose	Sigma-Aldrich	A3256
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670
NaCl	Sigma-Aldrich	31434
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
PNP-gluc	Sigma-Aldrich	N7006
pNP-TMP	Sigma-Aldrich	T0251
Tetracyclin	Sigma-Aldrich	87128
Trizma base	Sigma-Aldrich	T1503
Tryptone	Sigma-Aldrich	95039
Yeast extract	Fluka	70161
Acrylamide solution 30%	BioRad	161-0158	For gel electrophoresis
Ammonium persolphate	BioRad	161-0700	For gel electrophoresis
Glycine	BioRad	161-0718	For gel electrophoresis
SDS	BioRad	161-0302	For gel electrophoresis
TEMED	BioRad	161-0800	For gel electrophoresis
Tris	BioRad	161-0719	For gel electrophoresis
Cuvettes 0.1 cm	BioRad	1652089	For electroporation
EQUIPMENT
Centrifuge 5415R	Eppendorf
Centrifuge Allegra 21R	Beckman
Chromatography apparatus GradiFrac	Pharmacia Biotech
Gene Pulser II electroporation	BioRad
Microplate Reader 550	Biorad
MiniProtean 3 cell	BioRad
Power Supply	BioRad
Sonicator 3000	Misonix