İlköğretim İnsan Hepatositlerin İzolasyonu ve Non-parankimal karaciğer hücrelerinin Binbaşı popülasyonları İlgili Protokolü

Özet

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Özet

paren-kimal hepatositlerden yanında, karaciğer dışı parankimal hücreler (NPC), yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücreleri (LEC) ve hepatik yıldız şeklinde hücreler (HSC) oluşur. Birincil insan hepatosit (PHH) iki boyutlu (2D) kültürü hala ilaç metabolizması ve hepatotoksisite in vitro test için "altın standart" olarak kabul edilmektedir. Bu PHH 2D monokültür, farklılaşmadan ve fonksiyon kaybına uğrar çok iyi bilinmektedir. Son zamanlarda karaciğer NPC karaciğer (pato-) fizyoloji merkezi bir rol ve PHH fonksiyonları bakım oynadığı gösterilmiştir. Mevcut araştırma 2D monokültürlere sınırlamaları aşmak için 3B ve ko-kültür modellerinde in vivo doku mimarisinin yeniden odaklanır. Daha önce insan karaciğer hücreleri izole etmek için bir yöntem yayınlanmıştır ve Deneysel Biyoloji ve Tıp ¹ hücre kültürlerinde kullanımları için bu hücrelerin uygunluğunu incelenmiştir. Bu te geniş ilgi dayalıBu yazının amacı chnique bu tekniğin kolay bir üreme sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu.

Insan karaciğer hücreleri, iki aşamalı bir EGTA / kolajenaz P perfüzyon tekniği ile cerrahi müdahalelerin insan karaciğer doku örneklerinden izole edilmiştir. PHH 50 x g bir ilk santrifüj ile NPC ayrılmıştır. Yoğunluk gradyan santrifüj adımları ölü hücrelerin çıkarılması için kullanılmıştır. Bağımsız karaciğer hücre popülasyonları özel hücre özellikleri ve hücre sıralama prosedürleri kullanarak zenginleştirilmiş NPC fraksiyondan izole edilmiştir. PHH izolasyon yanında biz daha fazla ekimi için KC, LEC ve HSC ayırmak için başardık.

Birlikte ele alındığında, sunulan protokol bir donör doku örneğinden yüksek kalite ve miktar PHH ve NPC izolasyonu sağlar. Saflaştırılmış karaciğer hücre popülasyonlarının erişim insan li gibi in vivo oluşturulmasına izin verebilirver modelleri.

Giriş

İnsan karaciğer dokusu son derece karmaşık ve iki farklı hücre varlıklar, parankimal hücreler ve non-parankimal hücreler (NPC) oluşur. Parenkimal karaciğer hücreleri hepatositleri ve cholangiocytes bulunmaktadır. Hepatositler toplam karaciğer hücrelerinin 60 70% temsil eden ve metabolik karaciğer fonksiyonlarının çoğu için hesap, örneğin, safra asidi ve faktör sentezi, metabolizma ve enerji metabolizmasını ^2,3 tamamlayacak.

Daha küçük NPC fraksiyonu toplam karaciğer hücrelerinin% 30-40 oluşturmaktadır. NPC farklı hücre popülasyonlarının, yani Kupffer hücreleri (KC), karaciğer endotel hücrelerini (LEC) ve hepatik stellat hücreler (HSC) içerir. Bu heterojen hücre fraksiyonu karaciğer fizyolojik süreçlerde önemli bir rol oynar. Buna ek olarak, NPC örneğin ilaç kaynaklı karaciğer hasarı (Dili) ve kronik karaciğer yaralanması, siroz ⁴ gibi akut karaciğer hasarı, aracılık katılabilir.

Son yıllarda, Human karaciğer hücreleri karaciğer hastalıklarında daha önemli araştırma ve ilaç testleri, ilaç geliştirme ve yeni bir biyokimyasal yolların belirlenmesi gelişiminde olmuştur. İn vitro testler için PHH monokültürleri, hala "altın standart" olarak kabul edilmektedir ^5. Mevcut homotipik karaciğer modellerinde ana sınırlama birkaç gün ⁴ içinde farksızlaşma ve hepatositler fonksiyon kaybıdır. 3 boyutlu (3D) kültür teknikleri saptanması, bu sınırlama ^4,6 telafi edilebilir olduğunu göstermiştir. Ancak, hatta modern 3D kültür teknikleri eylemlerin ^7'nin tüm hepatotoksik modlarını görüntülemek mümkün değildir. Mevcut in vitro modellerde eksik NPC popülasyonları in vivo duruma Bu farklılığın olası bir nedeni olarak tartışılmıştır. Aynı zamanda pathophy farklı karaciğer hücre popülasyonları arasında hücre-hücre iletişim fizyolojik homeostazında önemli bir rol oynadığı gösterilmiştirsiologic ⁸ işler. Bu nedenle bilimsel ilgi NPC ve hücre-hücre etkileşimleri üzerinde daha fazla duruluyor. Ko-kültür ve doku mühendisliği sistemlerindeki maksatlı kullanım mümkün olduğunca in vivo duruma kadar yakın, in vitro karaciğer modellerinin ^8,9 yüksek talep için bir çözüm olabilir.

Şu anda temel zorluk PHH ve NPC açıkça tanımlanmış bölümlerini içeren standart bir insan karaciğeri ko-kültür modeli, geliştirilmesidir. Sonuç olarak, çok heterojen karaciğer hücreleri için izolasyon teknikleri gerekli ve bu saf hücre popülasyonlarının kazanmak için optimize edilmiş olması vardır. PHH izolasyonu için standart protokoller ¹⁰ varken, insan NPC standartlaştırılmış izolasyon hala geliştirilme aşamasındadır. En yayınlanan NPC izolasyon protokolleri olmayan insan hücreleri ^11,12 ile deneylere dayanmaktadır. Sadece birkaç yayınlar insan NPC izolasyon işlemini açıklar ve çoğu sadece kapakTek bir hücrenin izole edilmesi için yöntemler ^11-16 yazın. Hücre ayrılması için kullanıldı edilmiştir en önemli hücre özelliklerinin boyutu, yoğunluğu, bağlanma davranışı ve yüzey proteinleri ifadesidir. Bu özellikleri temelinde biz Deneysel Biyoloji ve Tıp ¹ daha önce yayımlanan PHH, KC, LEC ve HSC, izole etmek basitleştirilmiş bir protokol geliştirmiştir. Çünkü bu teknikle geniş ilgi, bu makalenin amacı daha kolay tekniği üreten sağlayacak bir videoda da dahil olmak üzere karaciğer hücre izolasyon işlemi için daha ayrıntılı bir protokol sağlamak oldu. Protokol de verim ve canlılığının değerlendirilmesi için ve belirli immunostainings kullanılarak kimlik ve saflık değerlendirmesi için bir kalite kontrol yöntemleri içerir.

Protokol

Not: Tüm hücreler birincil ya da ikincil karaciğer tümörlerinde parsiyel karaciğer rezeksiyonu sonra kalan rezeke olmayan tümörlü insan karaciğer dokusu, izole edilmiştir. Universitätsmedizin Berlin - hastaların aydınlatılmış onam Charité etik kurallarına göre elde edilmiştir.

Malzemelerin ve Çözümleri 1. Hazırlık

1. izolasyon işlemi sırasında bakteri kontaminasyonu önlemek için önceden tüm enstrümanları ve malzemeleri sterilize edin.
2. Taze hazırlanmış Sindirime Çözüm hariç olmak üzere, karaciğer doku numunesi, hepatositler ve non-parenkimal karaciğer hücrelerinin izolasyonu işlemi ve Tablo 1 ve 2'ye göre birincil insan karaciğer hücreleri yetiştirme perfüzyon için gerekli çözümler hazırlanması kullanımdan önce. Bütün çözeltiler 4 ° C 'de muhafaza edilebilir ve hazırlandıktan sonra 4 hafta içinde kullanılması önerilmektedir.
3. sterilize etmek0.22 mikron şişe üst filtre kullanarak tüm çözümleri.

Perfüzyon Ekipman 2. Hazırlık

1. Şekil 1A gösterildiği gibi karaciğer doku örneğinin perfüzyon ve sindirim için donatım ayarlayın.
2. perfüzyon ve sindirim sırasında optimum kollajenaz P aktivitesini sağlamak için 39 ° C'ye kadar su banyosu sıcaklığını ayarlayın.

Karaciğer Doku Örneği 3. perfüzyon ve Sindirim (1.5 saat)

1. rezeke karaciğer dokusundan dokunulmamış Glisson kapsülü bir doku numunesi seçin. Doku örneği keserken, iyi görünür damarlar ile küçük bir kesme yüzeyi elde etmek için deneyin. taşınması ve perfüzyon kadar buz üzerinde karaciğer doku örneği ele alarak sıcak iskemi süreleri kaçının.
2. steril koşullar altında, doku ağırlığı alın ve laminer hava akışının bir Petri kabındaki karaciğer doku numuneyi. yeniden steril bir kompres ile doku örneğinin yüzeyini temizleyinkan isti ve tüm kanül geçirgen olmasını sağlamak için 1x Perfüzyon-Çözüm kullanıyorum kanül seti yıkayın.
3. Bazı büyük kan damarlarında kanüller zeytin düzeltmek için doku yapıştırıcısı kullanın. Karaciğer doku numunesi uzunluğuna ve yüzeyde damarların sayısına bağlı olarak, 3 ila 8 kanüllü ayarlanmış bir kanül kullanın. perfüzyon test ve sızıntı olup olmadığını kontrol edin. doku yapıştırıcısı ile net 1x Perfüzyon-Çözüm I sızıntısı tüm yakın kan damarları.
4. Kendi delikli bir filtre diski (Şekil 1a) Buchner hunisi içine kanüle karaciğer doku numunesi yerleştirin.
5. 7.5 ml / dak ve ikinci kanül sayısına ve karaciğer dokusunda direncine bağlı olarak 14.6 ml / dk peristaltik pompa akış hızını ayarlayın. bir akım ama yavaş perfüzyon orada olduğundan emin olmak için akış hızı her zaman ayarlayın. tam kan dışarı atılırlar ama en azından 20 dk kadar doku serpmek. İyi perfusi olan alanlarda daha parlak hale doku gözlemlemeküzerinde.
   Not: Bazı durumlarda, plastik parçaları ile kanüller bir kelepçe gerekli olabilir ya da perfüzyon optimize etmek için, karaciğer kapsülünün karşı bir spatula ile hafifçe iterek bir alan iç basıncı artırmak için. açık kahverengimsi renkte açık sarı için tam bir renk değişikliği iyi perfüzyon gösterir.
6. Kollajenaz P (Tablo 1) içeren Sindirim-Çözüm perfüzyon sıvısını değiştirin.
7. Sindirim adımı için kurulum (Şekil 1A) yeniden düzenleyin. Bu nedenle, en fazla 15 dakika süreyle Şekil 1B uyarınca Sindirime Çözüm dairesel bir akış yapar.
   Not: karaciğer doku numunesi yeterince sindirilir zaman hemen perfüzyon durdurmak için kritik öneme sahiptir. İyi bir sindirim bir spatula ile itildiğinde, kapsül deformasyonların bakımı ile değerlendirilen doku elastikiyeti belirtisi gösterdiğinde, görülebilir.

Hepatositlerin 4. izolasyonu (1 saat)

1. Trahatsız peristaltik pompa urn bir cam tabak içinde karaciğer doku numuneyi. Buz Stop çözeltisi (Tablo 1), doku numunesi dışında yıkayın. karaciğer doku örneğinden kanüller çıkarın. kanüller bağlanmıştır alanının ortasında incising, karaciğer doku örneği açmak için bir neşter kullanın. Glisson's kapsül sağlam kalır dikkat tutun.
2. doku örneğinin içini durulayın ve sonra buz soğuk Dur-Çözüm ile tüm doku örneği kapsamaktadır. doku dışarı hücreleri serbest bırakmak için hafifçe doku sallayın.
3. hücre süspansiyonu toplamak ve 50 ml plastik tüplere bir bakış hunisi (gazlı kompres ile kaplı plastik huni) aracılığıyla filtre. 500 ml'lik bir nihai hacim tüketilene kadar, karaciğer doku numunesi daha Stop çözeltisi ilave edilir.
4. 50 x g'de, 5 dakika, 4 ° C 'de bir hücre süspansiyonu santrifüj. Daha sonra olmayan parankimal hücre izolasyonu için süpernatant toplayın. PBS (Şekil 2 hücre pelletini yıkayınA).
5. 50 x g'de, 5 dakika, 4 ° C sıcaklıkta tekrar hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatant toplayın ve Hepatosit Kuluçka ortamı pelet (Tablo 2, Şekil 2B) yeniden askıya.
6. Tripan mavi boya ile elde edilen hücre süspansiyonu, hücre sayısı ve canlılığı belirler. Bir Neubauer sayım odasında canlı ve ölü hücreleri saymak. Aşağıdaki formüller kullanılarak PHH hücre sayısı, canlılığı ve verim hesaplayın.
   
   hücre süspansiyonu (ml) verimi (hücreler sayılır) = sayılan hücre x seyreltme faktörü x hacim 10.000 x
   
   Verim (hepatositler / (g karaciğer doku örneği)) = (hücre süspansiyonu (mi) verimi (hepatositler / (ml ortamı)) x hacim) / (karaciğer doku numunesinin ağırlığı (g))
   
   canlılığı (%) =% 100 x (canlı hücre sayısı) / (toplam hücre sayısı)

Hepatositlerin 5. saflaştırma (1 saat)

Not: canlılığı, bu saflaştırma aşaması önerilir% 70 daha düşüktür.

1. Buz üzerinde tüm adımları uygulayın. 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve yoğunluk dereceli santrifüj 15 ml PBS karıştırılarak% 25 yoğunluk gradient hazırlayın.
2. Her iki tabakada arasında net bir ayrım (Şekil 2C) elde edilmesini sağlamak için% 25 yoğunluk gradyan tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş, hepatosit zengin hücre süspansiyonu üzerinden toplam 50 Milyon hücre fazla koyun. 1250 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2B) de santrifüj ve santrifüj içine dikkatlice tüpleri koyun.
3. Kalan hücre süspansiyonu ve interfaz ölü hücreleri aspire. yağ içeriği biri bağlı da yoğunluk gradyan-çözüm aspire olabilir.
   Not: PHH düşük lipit içerikli yoğun pelet ve yoğunluk gradyan tamamen aspire edilebilir oluştururlar. yüksek lipit içerikli PHH pelet yukarıdaki yoğunluk gradyan çözeltisi içinde kalabilir, daha yaygın pelet ve canlı hücrelerin bir sürü oluşturur.
4. 50 xg, 5 dakika, 4 ° C'de tekrar PBS ve santrifüj ile hepatosit pelet yeniden askıya. pelet Havuz, PBS ile tekrar yıkayın ve Hepatosit Kuluçka ortamında saflaştırılmış PHH yeniden askıya. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın.

Hepatositlerin 6. Yetiştirme

1. Örnek fare kuyruk kolajeni (kolajen tip I), bir hücre-dışı matris ile kaplanarak PhH tohumlanmasından hücre kültür kaplarına hazırlayın. Rajan ve arkadaşları tarafından kurulan protokole göre sıçan kuyruğu kollajen hazırlayın. ¹⁷
2. sıçan kuyruğu kollajen stok solüsyonu 1 seyreltilir: 200 PBS içinde. Tüm yüzeyi kaplı kültür kaplarına transferi 100 ul / cm ² sıçan kuyruğu kollajen çözüm, dikkat çekici. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca hücre kültürü plastik inkübe edin. Kalan sıçan kuyruğu kollajen çözüm aspire.
3. Kültür dishe ilgili Hepatosit inkübasyon ortamı içinde tohum 15 x 10 ⁴ hepatositler / ^cm2fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış s. En az 4 saat süreyle 37 ° C'de,% 5 _CO2 nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde hücrelerin kültive edilmesi. 4 saat sonra hepatositler yapıştırılır ve orta değiştirilebilir.
4. deney düzeneği bağlı soruşturmaları gerçekleştirin. 48 saat bir kültür süresi hücreleri izolasyon sürecinden kurtarmak için izin önerilir.

Sigara parankimal karaciğer hücrelerinin 7. izolasyonu (1.5-2 saat)

1. Santrifüj 72 x g'de, 5 dakika, 4 ° C 'de toplanan süpernatan (aşama 4,5 4.6) geri kalan eritrosit ve hepatositleri elemek için kullanılan. süpernatantlar havuzu ve iki hücre pelletleri elde etmek için iki kez santrifüj: 300 xg, 5 dk, HSC, LEC ve kısmen KC 650 xg, 7 dakika, kalan KC çökmesi için 4 ° C sedimantasyon 4 ° C.
2. Havuz topakları hem HBSS onları yeniden askıya. % 25 ve yoğunluk gradyan Santrifüj için karıştırma yoğunluk gradyan çözeltisi ve PBS tarafından% 50 yoğunlukta renk geçişlerini hazırlayınugation (% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi: 5 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 15 ml PBS,% 50 yoğunluk gradyan çözeltisi: 10 mi yoğunluk gradyan çözeltisi ve 10 ml PBS, bakınız Şekil 2). % 50 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi yerleştirin.
3. Her iki tabakada arasında net bir ayrım elde edilir şekilde% 25 yoğunluk gradyan çözeltisi tabakanın üzerine dikkatli bir şekilde yavaş yavaş NPC süspansiyon koyun.
4. Santrifüj 1800 xg, 20 dakika, frensiz 4 ° C (Şekil 2.2) yoğunluk gradyanı üzerinde hücre süspansiyonu.
5. Aspire ölü hücreler ve üst tabakadan hücre enkaz. NPC% 25 ve% 50 yoğunluk gradyan tabaka (Şekil 2) arasında arayüz içinde yer almaktadır. HBSS ve santrifüj ile yukarıda açıklanan çift santrifüj adımı uygulayarak hücre süspansiyonu yıkayın, NPC toplayın (adım 7.2.).

Kupffer hücrelerinin 8. Ayırma (bağlılıkAyırma Aşaması) (1 saat)

1. Adım 4.6 açıklandığı gibi NPC fraksiyonu KC için bir hücre sayımı gerçekleştirin. (Süspansiyon KC'nin görünüm için Şekil 3B). Santrifüj, yukarıda tarif edilen çift santrifüj leme, aşama (aşama 7.2) NPC Kupffer hücre ekim ortamı (Tablo 2) yeniden askıya NPC fraksiyonu.
2. 5 x 10 ⁵ KC / ^cm2 'lik bir yoğunlukta plastik hücre kültür kaplarına KC içeren fraksiyonu tohumu. 37 ° C'de nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 20 dakika için KC kültürleri inkübe,% 5 _CO2. İlköğretim KC kısa bir süre (Şekil 2.3) içinde hücre kültürü plastik üzerine yapışır.
3. başta LEC ve HSC oluşan değil yapıştırılır NPC içeren süpernatant toplayın. LEC sonraki ayrılması için süpernatantlar Havuz (bölüm 9) ve HSC (bakınız bölüm 10). HBSS ile yapışık KC yıkayın ve 37 ° C'de,% 5 CO de Kupffer hücre kültür aracı maddesi (Tablo 2) 'de onları yetiştirmekNemli bir kuluçka makinesi içinde _2.

Endotel Hücreleri 9. Ayırma (1.5 saat)

1. Santrifüj 300 x g'de 5 dakika, 4 ° C 'de toplanan süpernatan (aşama 8,5).. PBS ile pelet yıkayın. 300 x g'de 5 dakika, 4 ° C Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı hücrelerin yeniden askıya ve adım 4.6 de tarif edildiği gibi geri kalan hücreler için bir hücre sayımı gerçekleştirmek santrifüjlemeden sonra.
2. Immunolabeling için Mac-kitinden bloke etme çözeltisi 20 ul ve CD31 Micro Beads 20 ul, 1 ml Stellat hücre / endotel hücre ayırma ortamı içinde, 1 x 10 ⁷ Mio hücrelerin yeniden askıya ve 4 ° C'de 15 dakika için sonuçtaki süspansiyon inkübe ° C sıcaklık (Şekil 2.4).
3. Manyetik aktif hücre sıralama sistemi MACS (Şekil 2.5) için imalatçının protokol açıklandığı gibi HSC ayırın LEC. manyetik muhafaza CD31-pozitif LEC Zehir ve Stellate C askıyaell / endotel hücre kültür ortamı (Tablo 2).
4. Adım 4.6 açıklandığı gibi LEC için sayma hücre gerçekleştirin. 1.25 x 10 ⁵ hücre fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültürü damarlarda / ^cm2 yoğunluğunda Tohum LEC (adım 6.1). Nemli bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de,% 5 _CO2 de hücrelerin kültive edilmesi.

Stellat Hücreleri 10. Ayırma (0.5 saat)

1. Etiketsiz HSC MACS işlemi sırasında ayırma sütunu geçmektedir. HSC fraksiyonu (Şekil 2.5 adım 9.5) toplayın. Adım 4.6 açıklandığı gibi hücre sayımını yapın.
2. Fare kuyruk kolajeni ile kaplanmış hücre kültür kaplarında 5 x 10 ⁴ hücre / ^cm2'lik bir yoğunlukla tohum HSC Stellat hücre / endotel hücre kültür ortamında (Tablo 2) (aşama 6.1) ve 37 ° C'de,% 5 onları yetiştirmek nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde _CO2.

Tablo 1: Perfüzyon ve izolasyon çözümü.

Tablo 2: Kültür ve izolasyon ortamı.

Sonuçlar

yapışma özellikleri ve MACS kullanımı ile birlikte temizlik prosedürü olarak yoğunluk gradyan santrifüj kullanarak bir parankimal ve non-parankimal fraksiyonu içine ayrılık, başarılı PHH ve NPC izolasyona yol açar. PHH ve NPC yüksek kalite ve miktarda izole edilebilir. 1 karaciğer perfüzyon ve sindirim için ekipman temsilcisi kurulumunu göstermektedir. proteazlar proteolitik aktivitesini azaltmak ve karşılığında kolajenaz p akti...

Tartışmalar

yayınlanan protokol aynı zamanda insan karaciğer dokusunda aynı örnekten yüksek kalitede ve saflıkta, saf PHH ve NPC, yani KC, HSC ve LEC izole etmek için bir yöntem açıklanır. Karaciğer hücre izolasyonları ile ilgili yayınlar çoğunluğu sadece insan dokusu ile gerçekleştirildi, bu hücre popülasyonu ^18-20 ve izolasyon prosedürlerinin biri ²¹ (Damm ve ark., Tarafından) nadirdir kapsamaktadır. İnsan karaciğer hayvan dokusu (örneğin, sıçan karaciğer) i...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G