차 인간 간세포의 분리 및 비 실질 간 세포의 주요 집단 대응을위한 프로토콜

요약

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

초록

실질 간세포 옆에, 간은 비 실질 세포 (NPC) 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)로 구성되어 있습니다. 차 인간 간세포 (PHH)의 두 차원 (2D) 문화는 여전히 약물 대사 및 간독성의 시험관 테스트를위한 "골드 표준"으로 간주됩니다. 그것은 PHH의 2 차원 단일 문화는 탈분화 및 기능의 상실을 앓고 것으로 잘 알려져있다. 최근이 간 NPC 간 (병리) 생리학의 중심 역할과 PHH 기능의 유지 보수를 재생 것으로 나타났다. 현재의 연구는 2 차원 단일 재배의 한계를 극복하기 위해 3D- 공동 배양 모델에 의해 생체 내 조직 구조의 복원에 초점을 맞추고있다. 이전에, 우리는 인간 간 세포를 분리하는 방법을 발간 실험 생물학 및 의학 ¹ 세포 배양 물에서의 사용을위한 이들 세포의 적합성을 연구 하였다. 이 테의 폭 넓은 관심을 바탕으로이 문서의 목적을 chnique하는이 기술을 쉽게 재생 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다.

인간 간세포는 두 단계 EGTA / 콜라게나 제 P 관류 기술에 의해 수술 개입 인간의 간 조직 샘플로부터 분리 하였다. PHH 50 x g에서 초기 원심 NPC로부터 분리 하였다. 밀도 구배 원심 분리 단계 사균의 제거를 위해 사용 하였다. 개인 간 세포 집단은 특정 세포 성 및 세포 선별 방법을 사용하여 농축 된 NPC 분획으로부터 분리 하였다. PHH 격리 옆에 우리는 더 재배 KC, LEC와 HSC를 분리 할 수​​ 있었다.

함께, 제시된 프로토콜은 한 기증자의 조직 샘플에서 높은 품질과 수량에 PHH 및 NPC의 분리를 할 수 있습니다. 정제 간 세포 집단에 대한 접근은 인간의 리 같은 생체의 생성을 허용 할 수 있습니다버전 모델.

서문

인간의 간 조직은 매우 복잡하고 여러 개의 셀 엔티티 실질 세포 및 비 실질 세포 (NPC)로 구성된다. 실질 간 세포는 간세포와 담관을 포함한다. 간세포는 전체 간세포의 60 ~ 70 %를 차지하며 대사성 간 기능의 대부분을 차지하고, 예를 들면, 담즙산 및 인자 합성, 생물 전환 및 에너지 대사 ^{2,3- 보완.}

작은 NPC 분획 총 간세포 30-40 %로 구성한다. NPC는 서로 다른 세포 집단, 즉 쿠퍼 세포 (KC), 간 내피 세포 (LEC)와 간 성상 세포 (HSC)를 포함한다. 이 이종의 세포 분획 간의 생리적 과정에서 중요한 역할을한다. 또한, NPC는 예를 들어, 약물 - 유도 간 손상 (딜리)뿐만 아니라 만성 간 손상, 간경화 ⁴ 급성 간 손상을 중재에 참여한다.

최근, H잃어버린 간 세포는 간 질환에 점점 더 중요한 연구 및 약물 검사, 약물 개발 및 새로운 생화학 적 경로의 식별 개발되고있다. 시험관 테스트를 위해 PHH의 단일 재배는 여전히 "황금 표준"으로 간주됩니다 ^5. 현재 동형 간 모델의 주요 제한은 수일 내에 ⁴ 탈분화 및 간세포의 기능의 상실이다. 3 차원 (3D) 배양 기술의 확립이 제한 ^{4,6- 보상} 될 수 있다는 것을 보여 주었다. 그러나, 현대 3D 배양 기술 액션 ⁷ 모두 간독성 모드를 표시 할 수 없다. 기존의 체외 모델에서 누락 NPC 인구는 생체 내 상황이 차이에 대한 가능한 이유로 설명합니다. 또한 pathophy의 다른 간세포 집단의 세포 간 통신 생리적 항상성에서 중심 역할을하는 것으로 밝혀졌다siologic ^{8을 처리합니다.} 따라서 과학주의는 NPC 및 세포 - 세포 상호 작용에 점점 더 초점을 맞추고있다. 공동 문화 및 조직 설계 시스템에서 그들의 목적 사용 가능한 생체 내 상황에 가까운 있습니다 체외 간 모델 ^8,9의 높은 수요에 대한 해결책이 될 수 있습니다.

현재의 주요 과제는 PHH 및 NPC의 명확하게 정의 부분을 포함하는 표준화 된 인간 간 공동 배양 모델의 개발이다. 결과적으로, 매우 이종의 간 세포 분리 기술이 필요하고 그 순수한 세포 집단을 얻기 위해 최적화 될 필요가있다. PHH 격리를위한 표준화 된 프로토콜 ¹⁰ 존재하지만, 인간의 NPC의 표준화 분리는 아직 개발 중입니다. 대부분의 출판 NPC 분리 프로토콜은 비 - 인간 세포 ^11,12 실험에 기초한다. 불과 몇 간행물은 인간의 NPC의 분리 과정을 설명하고 대부분은 커버단일 세포의 분리 방법은 ^{11 ~ 16을 입력합니다.} 세포 분리 무력화 된 전지의 가장 중요한 특성은 크기, 밀도, 부착 거동 및 표면 단백질을 발현한다. 이러한 특성을 바탕으로 우리는 실험 생물학 및 의학 ¹ 년 이전에 출판 된 PHH, KC, LEC와 HSC를 분리하는 간단한 프로토콜을 개발했다. 때문에이 기술의 광범위한 관심이 문서의 목적은보다 용이하게 재생 기술을 허용하는 비디오를 포함하는 간 세포 분리 방법에 대한 상세한 프로토콜을 제공하는 것이다. 이 프로토콜은 또한 수율과 생존의 평가뿐만 아니라 특정 immunostainings를 사용하여 식별 및 순도 평가를위한 품질 관리 방법을 포함한다.

프로토콜

참고 : 모든 세포가 기본 또는 보조 간 종양 부분 간 절제술 후 남아 절제된 비 종 양성 인간의 간 조직에서 분리 하였다. Universitätsmedizin 베를린 - 환자의 동의는 샤리 테의 윤리적 지침에 따라 얻었다.

재료 및 솔루션 1. 준비

1. 분리 과정 중에 박테리아 오염을 방지하기 위해 미리 모든 장비 및 재료 멸균.
2. 갓 제조 소화 용액 제외 간 조직 샘플 간세포 비 실질 간세포의 단리 공정 및 표 1 및 2에 따른 차 인간 간세포의 배양 관류에 필요한 용액을 준비 사용 전에. 모든 솔루션은 4 ° C에 저장할 수 있습니다 준비 후 4 주 이내에 사용할 것을 권장합니다.
3. 소독하다0.22 μm의 병 상단 필터를 사용하여 모든 솔루션을 제공합니다.

관류 장비 2. 준비

1. 도 1a에 도시 된 바와 같이 간 조직 샘플의 관류 및 소화 장치를 설정한다.
2. 관류 및 소화하는 동안 최적의 콜라게나 P 활동을 보장하기 위해 39 ° C의 물 목욕 온도를 조정합니다.

간 조직 샘플 3. 관류 및 소화 (1.5 시간)

1. 절제 간 조직에서 그대로 Glisson의 캡슐과 조직 샘플을 선택합니다. 조직 샘플을 절단하는 경우, 좋은 가시 용기와 작은 절단면을 수득보십시오. 수송 및 관류 때까지 얼음에 간 조직 샘플을 처리하여 따뜻한 허혈 시간을 피하십시오.
2. 무균 조건 하에서 조직의 무게를 가지고 층류 공기 흐름에 페트리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 재로부터 무균 압축과 조직 샘플의 표면을 청소피를 maining 모든 정맥이 투과되었는지 확인하기 위해 1 배 관류-솔루션 I을 사용하여 정맥 세트를 세척합니다.
3. 일부 큰 혈관의 캐 뉼러의 올리브를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용합니다. 간 조직 샘플의 크기 및 표면의 혈관의 수에 따라 3 내지 8 뉼러 설정 캐뉼라를 사용한다. 관류를 테스트하고 누출을 확인합니다. 조직 접착제 맑은 1 배 관류-솔루션 I를, 누출 모든 닫기 혈관,.
4. 그 구멍 필터 디스크 (그림 1A)의 흡인 여과기로 유관 간 조직 샘플을 놓습니다.
5. 7.5 ㎖ / 분으로 이용 캐 뉼러의 수 및 간 조직의 저항에 따라 14.6 ml / 분의 연동 펌프의 유량을 설정한다. 현재 그러나 느린 관류가되도록 유량 매번 조정한다. 전혈은 플러시하지만 20 분 이상까지 조직을 관류. 좋은 perfusi와 지역에 밝은 될 조직을 관찰에.
   주 : 일부 경우에, 플라스틱 클램프와 캐 뉼러 중 하나를 고정 할 필요가있을 수도 있고, 관류 최적화 간 캡슐 대하여 주걱으로 부드럽게 눌러 영역의 내부 압력을 증가시키기 위해. 밝은 갈색 컬러에 밝은 노란색에 전체 색상 변경은 좋은 관류를 나타냅니다.
6. 콜라게나 제 P (표 1)를 포함 소화-솔루션으로 관류 액을 변경합니다.
7. 소화 단계의 설치 (그림 1A)를 재 배열. 따라서 최대 15 분 동안 그림 1B에 따라 소화 - 솔루션의 순환 흐름을 수행합니다.
   주 : 간 조직 샘플을 충분히 분해 할 때 즉시 재관류 중단하는 것이 중요하다. 좋은 소화가 주걱으로 밀어 경우, 캡슐 변형의 유지 보수에 의해 평가로 조직 탄성의 흔적을 보여줍니다 때, 관찰 할 수있다.

간세포 4. 단열 (1 시간)

1. 티오프 연동 펌프를 항아리와 유리 접시에 간 조직 샘플을 배치합니다. 차가운 얼음 스톱 솔루션 (표 1)과 조직 샘플의 외부를 헹군다. 간 조직 샘플에서 캐 뉼러를 제거합니다. 캐뉼라가 부착 된 영역의 중앙에 절개하여 간 조직 샘플을 열 메스를 사용한다. Glisson's 캡슐은 그대로 유지 치료를 유지합니다.
2. 조직 샘플의 내부를 씻어 후 차가운 얼음 스톱 솔루션을 통해 전체 조직 샘플을 커버합니다. 조직에서 세포를 분리 부드럽게 조직을 흔들어.
3. 세포 현탁액을 수집하고 50 ML의 플라스틱 튜브로 시선 깔때기 (가제 압축 늘어서 플라스틱 깔때기)를 통해 필터링합니다. 500 ml의 최종 부피가 소모 될 때까지 간 조직 샘플 더 스톱 용액을 첨가.
4. 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 나중에 비 실질 세포 분리를위한 뜨는을 수집합니다. PBS (그림 2와 세포 펠렛을 씻으십시오A).
5. 50 XG, 5 분, 4 ℃에서 다시 세포 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 수집하고 간세포 배양 배지에서 펠렛 (표 2, 그림 2B)를 다시 일시 중지합니다.
6. 트리 판 블루 염색을 이용하여 생성 된 세포 현탁액 중의 세포 수 및 생존력을 결정한다. 노이 바 우어 계산 실에서 산 자와 죽은 세포를 계산합니다. 아래의 공식을 사용 PHH의 세포 수, 생존 능력 및 수율을 계산합니다.
   
   세포 현탁액 (ML)의 수율 (세포 계수) = 카운트 셀 X 희석 인자 X 부피는 10,000 X
   
   수율 (간세포 / (g 간 조직 샘플)) = (세포 현탁액 (ML)의 수율 (간세포 / (ML 매체)) × 양) / (간 조직 샘플의 중량 (g))
   
   생존율 (%) = 100 % × (생균 수) / (전체 세포 수)

간세포 5. 정제 (1 시간)

참고 : 생존 경우 정제 단계가 좋습니다70 %보다 낮다.

1. 얼음의 모든 단계를 수행합니다. 5 ㎖ 밀도 구배 용액의 밀도 구배 원심 분리는 15 mL의 PBS을 혼합하여 25 %의 농도 구배를 준비한다.
2. 양 층의 명확한 분리 (도 2C)을 확보하기 위해 25 %의 농도 구배 층의 상부에 조심스럽게 천천히 간세포 풍부한 세포 현탁액에서 총 50 미오 셀의 최대 넣는다. 1250 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2D)에서 원심 분리기 원심 분리기로 조심스럽게 튜브를 넣습니다.
3. 나머지 세포 현탁액 및 계면에있는 죽은 세포를 대기음. 지방 함량 하나에 따라 또한 밀도 구배-솔루션을 대기음 수 있습니다.
   주 : PHH 낮은 지질 함량은 치밀한 펠릿 및 밀도 구배가 완전히 흡입 수를 형성한다. 높은 지질 함량 PHH 펠릿 위 밀도 구배 용액에 남아있을 수보다 확산 펠릿 생세포 많이 형성한다.
4. 50 XG, 5 분, 4 ° C에서 다시 PBS와 원심 분리기와 간세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 펠릿 수영장, PBS로 다시 씻어 ​​간세포 배양 배지에서 정제 PHH 다시 일시 중지합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다.

간세포의 6 재배

1. 예 래트 꼬리 콜라겐 (콜라겐 타입 I)를 들면, 세포 외 기질로 코팅함으로써 PHH의 시딩을위한 세포 배양 접시를 준비한다. 라잔 등에 의해 설립 된 프로토콜에 따라 쥐의 꼬리 콜라겐을 준비합니다. ⁽¹⁷⁾
2. 쥐의 꼬리 콜라겐 원액 1을 희석 : (200)을 PBS에. 표면 전체가 포함 된 배양 접시에 전송 100 μL / ^㎠ 쥐 꼬리 콜라겐 솔루션, 돌보는. 실온에서 20 분 동안 세포 배양 플라스틱 인큐베이션. 나머지 쥐의 꼬리 콜라겐 솔루션을 대기음.
3. 문화 dishe에 간세포 배양 배지에서 종자 15 × ¹⁰⁴ 간세포 / cm ²쥐의 꼬리 콜라겐으로 코팅 s의. 적어도 4 시간 동안 37 ° C, 5 % CO _2의 가습 된 배양기에서 세포를 배양. 4 시간 후, 간세포 부착하고 배지를 변경할 수있다.
4. 실험 설정에 따라 조사를 수행합니다. 48 시간의 배양 시간은 세포 분리 과정에서 복구 할 것을 권장한다.

비 실질 간 세포의 7 격리 (1.5 시간)

1. 원심 분리기 (72) XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 4.5 및 4.6) 남은 적혈구와 간세포를 제거합니다. 상층 액을 수영장과 두 개의 세포 펠렛을 얻기 위해 두 번을 원심 분리기 : 300 XG, 5 분, HSC, LEC 부분적 KC 650 XG, 7 분, 나머지 KC의 침강 4 ° C의 침강 4 ° C를.
2. 풀 펠릿 모두 HBSS에서 그들을 다시는 일시 중지합니다. 25 % 및 밀도 구배 centrif 믹싱 밀도 구배 용액 및 PBS에 의해 50 %의 농도 구배를 준비ugation (25 % 밀도 구배 용액 5 ml의 밀도 구배 용액을 15 ml의 PBS 50 % 밀도 구배 용액을 10 ml의 밀도 구배 용액 10 ㎖ PBS,도 2 참조). 50 % 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 25 % 밀도 구배 용액을 놓는다.
3. 양 층의 명확한 분리가 달성되는 방식으로 25 %의 밀도 구배 용액 층의 상부에 조심스럽게 천천히 NPC 현탁액을 넣어.
4. 원심 분리기 1800 XG, 20 분, 브레이크없이 4 ° C (그림 2.2)의 농도 구배에 세포 현탁액.
5. 대기음 사균과 최상층으로부터 세포 파편. 전인대는 25 %와 50 % 밀도 구배 층 (그림 2) 사이의 계면에 있습니다. HBSS와 원심 분리기와 상기 이중 원심 분리 단계 적용 세포 현탁액을 씻어 NPC를 수집한다 (단계 7.2.).

쿠퍼 세포의 분리 제 (준수분리 단계) (1 시간)

1. 단계 4.6에 기재된 바와 같이 NPC 분획의 KC하는 세포 수를 수행한다. (현탁액 KC의 모양은 그림 (b) 참조). 원심 분리기 상기 이중 원심 분리 단계 (단계 7.2) 및 NPC 쿠퍼의 셀 시드 매체 (표 2)를 다시 일시 중지와 NPC의 일부.
2. 5 × ⁵ KC / ^㎠의 밀도로 플라스틱 세포 배양 용기에 KC 함유 분획을 시드. 37 ° C에서 가습 인큐베이터에서 20 분 동안 KC 문화를 품어, 5 % CO _2. 기본 KC 단시간 (도 23) 내에서 세포 배양 플라스틱에 부착.
3. 주로 LEC와 HSC로 구성하지 부착 된 NPC를 포함하는 상층 액을 수집합니다. LEC 이후 분리를위한 상층 액을 풀 (섹션 9 참조) HSC는 (10 항 참조). HBSS로 부착 KC를 세척하고 37 ℃, 5 % CO에서 쿠퍼 세포 배양 배지 (표 2)에서 그들을 육성가습 인큐베이터에서 _2.

내피 세포의 9 분리 (1.5 시간)

1. 원심 분리기 300 XG, 5 분, 4 ° C에서 수집 된 뜨는 (단계 8.5.). PBS와 펠렛을 씻으십시오. 300 × g으로 5 분, 39 ° C를 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 세포를 다시 정지 단계 4.6에 기재된 바와 같이 나머지 모든 세포에 대한 세포 수를 수행 한 후 원심 분리.
2. immunolabeling의 MACS-KIT에서 솔루션을 차단 20 μL와 CD31 마이크로 비즈의 20 μl를 추가, 1 ml의 성상 세포 / 내피 세포 분리 배지에서 1 × 10 ⁷ 미오 셀을 다시 중단하고 4에서 15 분 동안 생성 된 현탁액을 품어 ° C 온도 (그림 2.4).
3. 자화 활성 세포 선별 시스템 MACS (그림 2.5)에 대한 제조자의 프로토콜에 설명 된대로 HSC에서 별도의 LEC. 자기 유지 CD31 양성 LEC을 용출 및 성상 C에서 그들을 중지엘 / 내피 세포 배양 배지 (표 2).
4. 단계 4.6에 설명 된대로 LEC에 대한 계산 셀을 수행합니다. 1.25 × ¹⁰⁵ 세포를 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에서 / ^㎠의 밀도 시드 LEC (단계 6.1 참조). 가습 인큐베이터에서 37 ℃로, 5 % CO _2에서 세포 배양.

성상 세포 (10) 분리 (0.5 시간)

1. 레이블이없는 HSC는 MACS 과정에서 분리 컬럼을 전달합니다. HSC 분율 (그림 2.5 단계 9.5 참조)를 수집합니다. 단계 4.6에 설명 된대로 셀 계산을 수행합니다.
2. 래트 꼬리 콜라겐으로 코팅 된 세포 배양 용기에 5 × ¹⁰⁴ 세포 / ^㎠의 밀도로 시드 HSC는 성상 세포 / 내피 세포 배양 배지 (표 2)에서 (단계 6.1 참조), 37 ° C, 5 %을 육성 가습 인큐베이터에서 CO _2.

표 1 : 관류 및 격리 솔루션입니다.

표 2 : 문화 절연 매체.

결과

준수의 특성과 맥의 사용과 결합 정리 절차로 밀도 기울기 원심 분리를 이용하여 실질이 아닌 실질 부분에 분리는 성공 PHH 및 NPC 분리로 연결됩니다. PHH 및 NPC는 높은 품질과 수량에 고립 될 수있다. (1) 간 관류 및 소화 용 장비의 대표 설정을 보여줍니다. 프로테아제 단백질 분해 활성을 감소시키는 대가로 콜라게나 제 P 활성 안정화 용액 II - 10 % ...

토론

게시 된 프로토콜은 동시에 인간의 간 조직의 동일한 샘플에서 높은 품질과 순도, 순수 PHH 및 NPC, 즉 KC, HSC와 LEC를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 간세포 아이솔레이션 다루는 문헌의 대부분은 인간 조직 수행 그 세포 집단 ^18-20 및 분리 절차들 중 하나 ⁽²¹⁾ (당국이 외. 검토) 희소 커버. 인간의 간을 동물 조직 (예를 들면, 쥐의 간) 설립 방법의 적응력 동물과 인간?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G