Protocollo per l'isolamento di epatociti umani primari e corrispondenti principali popolazioni di cellule del fegato non-parenchimali

Riepilogo

A technique to isolate human hepatocytes and non-parenchymal liver cells from the same donor is described. The different liver cell types build the basis for functional liver models and tissue engineering. This new method aims to isolate liver cells in a high yield and viability.

Abstract

Accanto epatociti parenchimali, il fegato è costituito da cellule non parenchimali (NPC) vale a dire cellule di Kupffer (KC), fegato le cellule endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Bidimensionale (2D) cultura di primaria epatociti umani (PHH) è ancora considerato come il "gold standard" per i test in vitro del metabolismo dei farmaci e di epatotossicità. È ben noto che la monocultura 2D PHH soffre dedifferentiation e perdita di funzione. Recentemente è stato dimostrato che epatica NPC giocano un ruolo centrale nel fegato (patologica) fisiologia e il mantenimento delle funzioni PHH. La ricerca attuale si concentra sulla ricostruzione di vivo dell'architettura tessuto da 3D-e co-coltura modelli di superare i limiti di monocolture 2D. In precedenza abbiamo pubblicato un metodo per isolare le cellule di fegato umano e studiato l'idoneità di queste cellule per il loro impiego in colture cellulari in Biologia e Medicina Sperimentale ^1. Sulla base del vasto interesse in questo technique lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che permetterà un facile riproduzione di questa tecnica.

cellule epatiche umane sono state isolate da campioni di tessuto di fegato umano di interventi chirurgici da un EGTA / collagenasi tecnica P perfusione in due fasi. PHH stati separati dal NPC da una centrifugazione iniziale a 50 x g. Densità fasi di centrifugazione a gradiente sono stati usati per la rimozione delle cellule morte. popolazioni di cellule individuali del fegato sono stati isolati dalla frazione arricchita NPC utilizzando le proprietà cellulari specifici e le procedure di separazione delle cellule. Accanto l'isolamento PHH siamo stati in grado di separare KC, LEC e HSC per ulteriori coltivazione.

Nel loro insieme, il protocollo presentato permette l'isolamento di PHH e NPC in alta qualità e la quantità di campione di tessuto da un donatore. L'accesso alle popolazioni di cellule del fegato purificati potrebbe consentire la creazione di in vivo come Li umanamodelli ver.

Introduzione

tessuto epatico umano è molto complesso e consiste di due diverse entità cellulari, cellule parenchimali e cellule non parenchimali (NPC). cellule epatiche parenchimali includono epatociti e colangiociti. Gli epatociti rappresentano dal 60 al 70% delle cellule del fegato totali e rappresentano la maggior parte delle funzioni epatiche metaboliche, ad esempio, acidi biliari e completano la sintesi fattore, biotrasformazione ed energia metabolismo ^2,3.

La frazione NPC minore costituisce il 30-40% delle cellule epatiche totali. NPC includono diverse popolazioni di cellule, ovvero cellule di Kupffer (KC), le cellule del fegato endoteliali (LEC) e le cellule stellate epatiche (HSC). Questa frazione cellulare eterogenico gioca un ruolo centrale in processi fisiologici del fegato. Inoltre, NPC partecipare a mediare danno epatico acuto, ad esempio, lesioni indotte dal farmaco fegato (DILI), così come nelle lesioni croniche del fegato, come la cirrosi ^4.

Negli ultimi anni, hcellule epatiche Uman sono diventati sempre più essenziale nella ricerca e nello sviluppo di test anti-droga, lo sviluppo di farmaci e l'identificazione di nuove vie biochimiche nelle malattie del fegato. Per i test in vitro monocolture PHH sono ancora considerati come il "gold standard" ^5. La principale limitazione degli attuali modelli di fegato omotipiche è dedifferentiation e perdita di funzione degli epatociti nel giro di pochi giorni ^4. La creazione di tecniche (3D) cultura 3-dimensionale ha dimostrato che questi limiti possono essere compensate ^4,6. Tuttavia, anche le moderne tecniche di coltura 3D non sono in grado di visualizzare tutte le modalità epatotossici di azioni ^7. Manca popolazioni NPC nei modelli esistenti in vitro sono discussi come possibile motivo di questa discrepanza per la situazione in vivo. È stato dimostrato che la comunicazione cellula-cellula tra le diverse popolazioni cellulari fegato gioca un ruolo centrale nella omeostasi fisiologica, ma anche in pathophysiologic elabora ^8. Pertanto l'attenzione scientifica si concentra sempre di più sulla NPC e le loro interazioni cellula-cellula. Il loro utilizzo mirato in co-coltura e sistemi di ingegneria tessutale potrebbe essere una soluzione per la forte domanda di modelli di fegato in vitro ^8,9 che sono il più vicino alla situazione in vivo possibile.

Attualmente la sfida principale è lo sviluppo di un modello di fegato di co-cultura umana standardizzata, che contiene porzioni ben definite di PHH e NPC. Di conseguenza, tecniche di isolamento per le cellule del fegato molto eterogenei sono necessari e quelli devono essere ottimizzate per ottenere popolazioni di cellule pure. Mentre esistono protocolli standardizzati per l'isolamento PHH ^10, l'isolamento standardizzato di NPC umano è ancora in fase di sviluppo. Protocolli di isolamento NPC più pubblicati sono basati su esperimenti con le cellule non umane ^11,12. Solo pochi pubblicazioni descrivono il processo di isolamento della NPC umana e la maggior parte coprono soloMetodi per l'isolamento di una singola cellula tipo ^11-16. Le caratteristiche cellulari più importanti che sono stati sfruttati per la separazione cellulare sono dimensione, densità, comportamento di attaccamento, e l'espressione di proteine ​​di superficie. Sulla base di queste caratteristiche abbiamo sviluppato un protocollo semplificato per isolare PHH, KC, LEC e HSC, che è stato pubblicato in precedenza in Biologia e Medicina Sperimentale ^1. A causa del grande interesse in questa tecnica, lo scopo di questo articolo è quello di fornire un protocollo più dettagliata del processo di isolamento delle cellule epatiche tra cui un video, che consentirà riproducendo la tecnica più facilmente. Il protocollo include anche i metodi di controllo di qualità per la valutazione della resa e la vitalità, nonché per l'identificazione e la purezza valutazione con immunostainings specifici.

Protocollo

Nota: Tutte le cellule sono state isolate da tessuto epatico resecato non tumorale umano, che è rimasto dopo resezione parziale del fegato con tumori epatici primari o secondari. Il consenso informato dei pazienti è stato ottenuto secondo le linee guida etiche del Charité - Universitätsmedizin Berlino.

1. Preparazione di materiali e soluzioni

1. Sterilizzare tutti gli strumenti ed i materiali in anticipo per evitare contaminazione batterica durante il processo di isolamento.
2. Preparare le soluzioni richieste per la perfusione del campione di tessuto epatico, il processo di isolamento di epatociti e cellule epatiche non parenchimali e la coltivazione di cellule epatiche umane primarie secondo le tabelle 1 e 2, ad eccezione di digestione-Solution che viene preparato fresco prima dell'uso. Tutte le soluzioni possono essere conservati a 4 ° C e si raccomanda di utilizzarle entro 4 settimane dopo la preparazione.
3. Sterilizzaretutte le soluzioni che utilizzano un filtro alto 0,22 micron bottiglia.

2. Preparazione di perfusione attrezzature

1. Impostare l'apparecchiatura per la perfusione e la digestione del campione di tessuto epatico come mostrato nella Figura 1A.
2. Regolare la temperatura del bagno di acqua a 39 ° C per garantire un'attività P ottimale collagenasi durante la perfusione e la digestione.

3. perfusione e la digestione del Campione tessuto di fegato (1,5 ore)

1. Selezionare un campione di tessuto con la capsula intatta di Glisson dal tessuto epatico asportato. Quando si taglia il campione di tessuto, cercare di ottenere una piccola superficie di taglio con buoni vasi visibili. Evitare tempi di ischemia calda per il trasporto e la manipolazione del campione di tessuto epatico in ghiaccio fino perfusione.
2. Prendere il peso del tessuto in condizioni sterili e posizionare il campione di tessuto epatico in una capsula di Petri nel flusso d'aria laminare. Pulire la superficie del campione di tessuto con una compressa sterile reprodotti minerali di sangue e lavare il set cannula utilizzando 1x perfusione-Soluzione per assicurare che tutte cannula erano permeabili.
3. Utilizzare colla tessuto per fissare le olive delle cannule in alcuni vasi sanguigni più grandi. A seconda della dimensione del campione di tessuto epatico e il numero dei vasi sulla superficie, utilizzare una cannula set con 3 a 8 cannule. Testare la perfusione e verificare la presenza di perdite. Chiudere tutti i vasi sanguigni, che fuoriescono 1x perfusione-Soluzione, con la colla del tessuto.
4. Posizionare il campione di tessuto epatico cannulato nell'imbuto Büchner sul suo disco filtrante forato (Figura 1A).
5. Impostare la portata della pompa peristaltica tra 7,5 ml / min e 14,6 ml / min a seconda del numero di cannule utilizzati e sulla resistenza del tessuto epatico. Regolare la portata ogni volta per garantire che vi sia una perfusione corrente ma lento. Profumato il tessuto fino al sangue intero viene risciacquato ma almeno 20 min. Osservare il tessuto diventerà più luminosa in aree con buone perfusisopra.
   Nota: In alcuni casi, può essere necessario bloccare uno dei cannule con fascette di plastica o per aumentare la pressione interna di una zona spingendo dolcemente con una spatola contro la capsula epatica, per ottimizzare la perfusione. Un cambiamento di colore completo ad un giallo chiaro al colore marrone chiaro indica un buon perfusione.
6. Cambiare il liquido di perfusione alla digestione-Soluzione contenente collagenasi P (Tabella 1).
7. Riorganizzare la configurazione (Figura 1A) per la fase di digestione. Pertanto eseguire un flusso circolare di digestione-Solution di figura 1B per un massimo di 15 min.
   Nota: E 'fondamentale per fermare immediatamente la perfusione quando il campione di tessuto epatico è sufficientemente digerito. Una buona digestione può essere osservato, quando il tessuto non mostra alcun segno di elasticità valutata mediante manutenzione di deformazioni capsula, quando viene spinto con una spatola.

4. L'isolamento degli epatociti (1 ora)

1. Turna la pompa peristaltica off e collocare il campione di tessuto epatico in un piatto di vetro. Risciacquare l'esterno del campione di tessuto con ghiaccio freddo Stop-Solution (Tabella 1). Rimuovere le cannule dal campione di tessuto epatico. Utilizzare un bisturi per aprire il campione di tessuto epatico, incidendo in mezzo alla zona in cui erano attaccate le cannule. Mantenere la cura che la capsula Glisson's rimane intatto.
2. Risciacquare l'interno del campione di tessuto e quindi coprire l'intera campione di tessuto con ghiaccio freddo Stop-Solution. Agitare il tessuto delicatamente per rilasciare le cellule di tessuto.
3. Raccogliere la sospensione cellulare e filtrare attraverso un imbuto di sguardo (imbuto di plastica rivestito con garza compressa) in 50 ml tubi di plastica. Aggiungere più Stop-Solution al campione di tessuto epatico fino consumato un volume finale di 500 ml.
4. Centrifugare la sospensione cellulare a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Raccogliere il surnatante per l'isolamento delle cellule non parenchimali in seguito. Lavare il pellet di cellule con PBS (Figura 2A).
5. Centrifugare nuovamente la sospensione cellulare a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Raccogliere il surnatante e risospendere il pellet in mezzo epatociti incubazione (Tabella 2, Figura 2B).
6. Determinare il numero di cellulare e la vitalità nella sospensione cellulare risultante utilizzando trypan colorazione blu. Contare le cellule vive e morte in una camera di conta Neubauer. Calcolare il numero di cellule, la vitalità e la resa dei PHH utilizzando le formule seguenti.
   
   rendimento (cellule contate) = cellule contate x fattore di diluizione x volume di sospensione cellulare (ml) x 10.000
   
   Resa (epatociti / (g fegato campione di tessuto)) = (resa (epatociti / (supporti ml)) x volume di sospensione cellulare (ml)) / (peso del campione di tessuto epatico (g))
   
   redditività (%) = 100% x (numero di cellule vive) / (numero totale di cellule)

5. Purificazione degli epatociti (1 ora)

Nota: Si raccomanda Questa fase di purificazione, la vitalitàè inferiore al 70%.

1. Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio. Preparare un gradiente di densità 25% mescolando 5 ml di soluzione gradiente di densità e 15 ml di PBS per centrifugazione in gradiente di densità.
2. Mettere un massimo di 50 celle Mio totale fuori dalla ricca sospensione cellulare di epatociti lentamente e sopra dello strato gradiente di densità 25% per garantire che una chiara separazione dei due strati è ottenuto (Figura 2C). Mettere attentamente le valvole nella centrifuga e centrifugare a 1250 xg, 20 min, 4 ° C senza freno (Figura 2D).
3. Aspirare il restante sospensione cellulare e le cellule morte della interfase. A seconda del contenuto di grasso uno potrebbe anche aspirare il gradiente-soluzione densità.
   Nota: PHH con basso contenuto lipidico formare un pellet denso e il gradiente di densità può essere aspirato completamente. PHH con alto contenuto lipidico formare un pellet più diffuso e un sacco di cellule vitali possono rimanere nella soluzione gradiente di densità sopra il pellet.
4. Risospendere il pellet di epatociti con PBS e centrifugare di nuovo a 50 xg, 5 min, 4 ° C. Si riuniscono gli pellets, sciacquare con PBS e risospendere purificata PHH in mezzo Hepatocyte incubazione. Effettuare il conteggio delle cellule, come descritto al punto 4.6.

6. La coltivazione di epatociti

1. Preparare i piatti di coltura cellulare per la semina di PHH da rivestimento con una matrice extracellulare, per il collagene coda esempio di ratto (collagene di tipo I). Preparare il collagene coda di ratto secondo il protocollo stabilito da Rajan et al. ¹⁷
2. Diluire la coda di topo collagene Soluzione 1: 200 in PBS. Trasferire 100 microlitri / cm ² di ratto soluzione di collagene di coda nei piatti di coltura, avendo cura che l'intera superficie è coperta. Incubare le plastiche di coltura cellulare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione rimanente collagene coda di topo.
3. Seme di 15 x 10 ⁴ epatociti / cm ² a mezzo di epatociti di incubazione sulla cultura dishes rivestito con collagene coda di topo. Coltivare le cellule in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO ₂ per almeno 4 ore. Dopo 4 ore epatociti hanno aderito e il mezzo può essere modificato.
4. Eseguire ricerche a seconda del setup sperimentale. Si consiglia un tempo di coltura 48 h per permettere alle cellule di recuperare dal processo di isolamento.

7. L'isolamento delle cellule epatiche non parenchimali (1,5-2 ore)

1. Centrifugare il supernatante raccolto (passo 4.5 e 4.6) a 72 xg, 5 min, 4 ° C per eliminare gli eritrociti e epatociti. Pool i supernatanti e centrifugare due volte per ottenere due pellet cellulari: 300 xg, 5 min, 4 ° C per la sedimentazione di HSC, LEC e parzialmente KC e 650 xg, 7 min, 4 ° C per sedimentazione dei rimanenti KC.
2. Pool entrambi i pellet e li ri-sospendere in HBSS. Preparare un 25% e una densità del 50% gradienti di miscelazione soluzione gradiente di densità e PBS per gradiente di densità centrifugation (25% soluzione gradiente di densità: 5 soluzione gradiente di densità e ml 15 ml PBS, soluzione al 50% in gradiente di densità: soluzione gradiente di 10 ml di densità e 10 ml di PBS, vedere Figura 2). Posizionare la soluzione gradiente di densità 25% attenzione sulla parte superiore dello strato soluzione gradiente di densità 50%.
3. Mettere la sospensione NPC cura e lentamente sulla parte superiore dello strato soluzione gradiente di densità 25% in modo da ottenere una netta separazione dei due strati.
4. Centrifugare la sospensione cellulare sul gradiente di densità a 1.800 xg, 20 min, 4 ° C senza freno (Figura 2.2).
5. Aspirare le cellule morte e detriti cellulari dal livello più alto. L'NPC si trovano nella interfase tra lo strato gradiente di densità 25% e 50% (Figura 2). Raccogliere NPC, lavarli con HBSS e centrifugare la sospensione cellulare applicando la fase di centrifugazione sopra descritta doppia (punto 7.2.).

8. separazione delle cellule di Kupffer (aderenzaSeparazione Step) (1 ora)

1. Eseguire una conta di cellule per la KC nella frazione NPC come descritto al punto 4.6. (Per la comparsa di KC in sospensione vedi Figura 3B). Centrifugare la frazione NPC con la fase di centrifugazione dual descritto sopra (passo 7.2) e risospendere il NPC in Kupffer cellulare semina medio (Tabella 2).
2. Seme della frazione contenente KC in serbatoi di plastica coltura cellulare ad una densità di 5 x 10 ⁵ KC / cm ^2. Incubare le culture KC per 20 min in un incubatore umidificato a 37 ° C, 5% CO _2. Primaria KC aderire su plastica coltura cellulare entro un breve periodo di tempo (Figura 2.3).
3. Raccogliere il surnatante contenente non abbia aderito NPC, che consiste principalmente di LEC e HSC. PISCINA La surnatanti per dopo la separazione di LEC (vedere la sezione 9) e HSC (vedi punto 10). Lavare l'aderente KC con HBSS e coltivare Kupffer coltura cellulare medio (Tabella 2) a 37 ° C, 5% CO₂ in un incubatore umidificato.

9. separazione delle cellule endoteliali (1,5 ore)

1. Centrifugare il surnatante raccolto (fase 8.5.) A 300 xg, 5 min, 4 ° C. Lavare il pellet con PBS. Dopo centrifugazione a 300 xg, 5 min, 4 ° C risospendere le cellule in cellule stellato / mezzo di separazione delle cellule endoteliali ed eseguire un conteggio delle cellule per tutte le celle rimanenti come descritto al punto 4.6.
2. Risospendere 1 x 10 ⁷ cellule Mio in 1 ml cella stellato / endoteliale mezzo di separazione cellulare, aggiungere 20 ml soluzione bloccante dal MACS-kit e 20 ml delle perline CD31 Micro per immunomarcatura e incubare la sospensione risultante per 15 minuti a 4 ° C di temperatura (Figura 2.4).
3. LEC separata da HSC come descritto nel protocollo del produttore di sistema per cell sorting attivato magneticamente MACS (Figura 2.5). Eluire magneticamente mantenuto LEC CD31-positivo e sospenderle in stellato CEll / terreno di coltura di cellule endoteliali (Tabella 2).
4. Eseguire cella conta per LEC come descritto al punto 4.6. Seed LEC in una densità di 1,25 x 10 ⁵ cellule / cm ² in recipienti di coltura delle cellule rivestite di collagene coda di ratto (vedi punto 6.1). Coltivare le cellule a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.

10. La separazione delle cellule stellate (0,5 ore)

1. Senza etichetta HSC passare la colonna di separazione durante la procedura MACS. Raccogliere la frazione HSC (vedi punto 9.5, figura 2.5). Effettuare il conteggio delle cellule, come descritto al punto 4.6.
2. HSC Seed con una densità di 5 x 10 ⁴ cellule / cm ² in recipienti di coltura delle cellule rivestite di collagene coda di ratto (vedere il punto 6.1) nel stellato cellulare / terreno di coltura di cellule endoteliali (Tabella 2) e li coltivano a 37 ° C, 5% CO ₂ in un incubatore umidificato.

Tabella 1: Perfusione e soluzione di isolamento.

Tabella 2: cultura e di isolamento dei media.

Risultati

La separazione in una frazione parenchimale e non parenchimali, con densità centrifugazione in gradiente come una procedura di pulizia combinato con l'uso di proprietà di aderenza e MACS porta a successo isolamento PHH e NPC. PHH e NPC possono essere isolati in alta qualità e quantità. Figura 1 mostra la configurazione rappresentante delle attrezzature per la perfusione del fegato e la digestione. 10% FCS è stato aggiunto alla collagenasi P contenente perfusione...

Discussione

Il protocollo pubblicato descrive una tecnica per isolare puro PHH e NPC, cioè KC, HSC e LEC, simultaneamente in alta qualità e purezza dallo stesso campione di tessuto epatico umano. La maggior parte delle pubblicazioni che si occupano di isolamenti cellule del fegato coprono solo una di quelle popolazioni cellulari ^18-20 e le procedure di isolamento eseguiti con i tessuti umani sono rari (recensito da Damm et al.) ^21. Adattamento dei metodi stabiliti con tessuto animale (ad esempio...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Equipment
PIPETBOY	Eppendorf
pipettes	Eppendorf
microscope	Carl Zeiss
microscope	Olympus
CO2-incubator	Binder
Lamin Air	Heraeus
Centrifuge Varifuge 3.0R	Heraeus
Urine Beaker	Sarstedt	2041101
perfusor syringe 50 ml	B.Braun	12F0482022
Bottle Top Filter	Nalgene	1058787
Falcon 50 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352070
Falcon 15 ml Polypropylene Conical Tube	BD Biosciences	352096
Tissue Culture plate	BD Biosciences	533047	24 well
serological pipettes	BD Biosciences	357525, 357551, 357543	25 ml, 10 ml, 5 ml
pipette tips	SARSTEDT	0220/2278014, 0005/2242011, 0817/2222011	100 µl, 200 µl, 1,000 µl
Name	Company	Catalog Number	Comments
Isolation Equipment
water bath	Lauda
peristaltic pump	Carl Roth
circulation thermostat	Lauda
pH meter	Schott
fine scales	Sartorius
stand
Büchner funnel	Haldenwanger
plastic funnel
silicone tube
cannulae with olive tips
glass dish
forceps
scalpel	Feather	12068760
Neubauer counting chamber	Optic Labor
cell lifter	Costar
Surgical Drape	Charité Universitätsmedizin Berlin	A2013027
compress	Fuhrmann	40013331
sterile surgical gloves	Gammex PF	1203441104
Tissue glue	B. Braun	1050052
glass bottle	VWR
Collagenase P	Roche	13349524
Percoll Separating Solution	Biochrom	L6145	Density 1.124 g/ml
Hank’s BSS	PAA	H00911-3938
Dulbecco’s PBS	PAA	H15 - 002	without Mg/Ca
Ampuwa	Plastipur	13CKP151
Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
NaCl	Merck	1,064,041,000
KCl	Merck	49,361,000
Hepes Pufferan	Roth	133196836
EDTA	Sigma	E-5134
Name	Company	Catalog Number	Comments
Media Equipment
DMEM	PAA	E15-005	Low Glucose (1 g/L) (without L-Glutamine)
HEPES Buffer Solution 1 M	GIBCO	1135546
L-Glutamine	GIBCO	25030-024	200 mM
MEM NEAA	GIBCO	11140-035
penicillin/streptomycin	GIBCO	15140-122
RPMI 1640	PAA	E15 - 039	without L-Glutamine
Sodium Pyruvate	GIBCO	1137663	100 mM
Trypan Blue Solution	Sigma-Aldrich	T8154	0.4%
William’s E	GIBCO	32551-020
with GlutaMAX™
EGTA	Sigma-Aldrich	03780-50G
Fortecortin	Merck	49367	8 mg/2 ml
Human-Insulin	Lilly	HI0210	100 I.E./ml
N-Acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
Fetal calf serum (FCS)	PAA	A15-101
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment for Immunostainings
CD 68	R&D Systems, USA		monoclonal
CK 19	Santa Cruz	D2309	polyclonal
CK18	Santa Cruz	K2105	monoclonal
Vimentin	Santa Cruz		monoclonal
GFAP	Sigma Aldrich		monoclonal
Triton X-100	Sigma Aldrich	23.472-9
Goat anti-Mouse IgG1-PE	Santa Cruz	C0712
Goat anti-rabbit IgG-FITC	Santa Cruz	L0412
Methanol	J.T.Baker	1104509006
Formaldehyde 4%	Herbeta Arzneimittel	200-001-8
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G