Koklear Hücre Dejenerasyonu Inducing için hızlı ve Güvenilir Teknik: Ototoksik Ajan Teslimat için Fare Yuvarlak pencere Yaklaşımı

Özet

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

Özet

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Giriş

Müfettişler işitme sisteminin normal fonksiyonunu yanı sıra işitme kaybı patofizyolojisini incelemek için hayvan modellerinde geniş bir yelpazeye kullandık. Bu modeller aynı zamanda çeşitli patolojik süreçler karşı müdahale çalışmaların yapılması için son derece yararlı ve insan deneklerde translasyonel uygulamaları için temel olarak hizmet vermektedir. Koklea ve bununla ilişkili işitsel yolları içeren en araştırma, hasar veya bozulma bazı derece sistemine verilmesi gerekir. Genellikle, hasar kasten araştırmacılar, normal işlevi o lezyon yanı sıra ondan kurtarmak için koklear yeteneği etkisini araştırmak için izin belirli bir lezyon oluşturmak amaçlanmaktadır. Hasar verilmesi için belirli bir hayvan modeli ve / veya teknik (ler) seçilirken, bir dizi faktöre mümkün olan en iyi sonuçları elde etmek için kabul edilmelidir. Bir tekniğin doğrudan ve dolaylı etkileri olabilir iken çeşitli hayvan modelleri, müdahalelere farklı tepkiler verebilirİstenilen sonuca tamamen zararlı. Çoğu durumda, ideal bir iç kulak hasarı protokolü hızla sistemik toksisite önlemek ve güvenilir hasara sebep, hassas ve tutarlı lezyon oluşturmak ve fonksiyonel hücresel ve moleküler değişikliklerin daha fazla çalışma izin survivable olacaktır. İdeal olarak, bu yöntemleri de mümkün olduğunca Kokleanın hassas mikro mimari ve elektrokimyasal geçişlerini korumak istiyorum.

Bugüne kadar, araştırmacılar iç kulak hasarı ikna etmek için bir takım teknikler kurarak başardı. Bunların çoğu ya sistemik veya cerrahi yaklaşımla bir ototoksik ajana kokleayı açığa gerektirir. Teknikler perilenfatik perfüzyon ile parenteral enjeksiyon, intra-peritoneal enjeksiyonu, trans-timpanik enjeksiyon, endolenfatik kese enjeksiyon ve kokleostomisi sayılabilir. Bu teknikler furosemid, gentamisin, ouabain ve heptanol olarak ototoksik maddeler, çeşitli tanıtmak için kullanılmıştır. ^1-5Belirli koklear lezyonlar oluştururken başarılı olsa da, yukarıdaki teknikler de sınırlamaları kabul ettiler. Sistemik enjeksiyonları hayvan derece toksik olabilir ve istenmeyen koklear hakaret ve tutarsız sonuçlar ile ilişkili olabilir. Ikinci eksiklik trans-timpanik enjeksiyonları ile ilişkilendirilmiştir. Böyle kokleostomisi ve perilenfatik perfüzyon gibi teknikler, hızlı ve son derece güvenilir lezyonlar indükleyebilen iken, iç kulak yapısı ve fonksiyonu doğrudan invaziv. Cerrahi yaklaşımların çoğu da teknik zorluk yüksek derecede ilişkilidir ve böyle bir mikropompa demlik olarak hayvanda yabancı nesneler bırakarak gerekebilir. ^2-4,6-8 Tek bir tekniktir eksikliklerin ücretsiz ve araştırmacılar seçmelisiniz yöntemler dikkatle deneysel ihtiyaçlarına uygun. Burada, detaylı, yetişkin farelerde ototoksik maddelerin topikal teslimat için, yuvarlak pencere niş (RWN) uygulaması tekniğini açıklar.

Fibir kuş modelinde duyusal saçlı hücre dejenerasyonunun gentamisin etkisini okurken ilk 1998'de al Husmann ve tarif, bu teknik, ilgili zehirlenmelerden kaçınılarak, sistemik gentamisin uygulama göre önemli ölçüde daha güvenilir lezyonlar üretme yeteneğine sahip olduğu bulunmuştur. ⁹ O zamandan beri, Laboratuvarımızda dahil olmak üzere diğer araştırmacılar, sayıları, büyük bir başarı ile bu tekniği kullanmışlardır. 2004 yılında, Heydt ve ark. bir fare modelinde uygun bu ve gentamisin çeşitli konsantrasyonlarda emdirilmiş jelatin süngerle RWN doldurarak lezyon büyüklüğü kontrol etmek için gelişmiş bir yeteneğini,. ¹⁰ ve diğ., 2010, p-Bungarotoxin ototoksik etkileri üzerinde çalıştılar Palmgren, güçlü bir Tayvanlı zehiri element erişkin farelerin RWN için bunun sulu bir formu uygulanarak, sandık bantlı. ¹¹ Ayrıca, laboratuvarda önceki çalışmalarda çok sayıda furosemid ototoksik etkisini incelemek için yuvarlak pencere yaklaşımı kullanmış olmasıe ouabain ve heptanol. Bu çalışmalardan ^5,6,12-15 sonuçları koklear sıvısı ve normal işitme iyon homeostasisin önemini göstermiştir, spiral ganglion ve koklear yan duvarda hücre çoğalması yeteneğini keşfetti ve anlayışımızı daha da ileriye Yaşa bağlı işitme kaybı.

Aşağıdaki yaklaşım cerrahi bir kesi postaurikuler ve kemik timpan bulla kısmi yüzeylemenin yoluyla orta kulağa erişen içerir. Bu seçilmiş ototoksik madde doğrudan tatbik edilebilir olduğu RWN ile zarın daha iyi görüntülenmesi için izin verir. Sıvı madde daha sonra RWN fincan gibi içi boş havuzları (veya yavaş RWN içine paketlenmiş doymuş emilebilir jelatin sünger taşıyıcıdan drene) ve koklear vestibülün perilenfatik uzaya yuvarlak pencere zarından yayılır. Hiçbir doğrudan kokleostomisi bu yaklaşımın yapılır. Bu tekniğin avantajları iç kulak mikro mimarisi, kaçınma korunması dahiliçi hayvan kontrol kulağın sistemik toksisite, yardımının, etkinin hızlı bir başlangıç, belirli bir koklear hücre tiplerinde seçici bir dejenerasyon (örneğin., tip I Ouabain maruz kalma ve koklear Çeşidi heptanolden tedavisinin neden olduğu II fibrositler gangliyon nöronları, spiral), ve tekrarlanabilir / güvenilir sonuçlar. Bu teknik, sıçan, gine domuzu ve Gerbils dahil olmak üzere diğer kemirgen türleri arasında birkaç değişiklik ile uygulanabilir. Dezavantajları dik teknik bir öğrenme eğrisi ve zaman içinde tek bir noktaya sınırlandırılmıştır ototoksik hakaret göreli sınırlamayı içerir.

Protokol

Hayvan araştırma tüm yönleriyle uygun Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi kurallarına uygun olarak yapılmıştır. Burada açıklanan tüm omurgalı hayvan deney prosedürleri Güney Carolina'nın (MUSC) Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Tıp Üniversitesi (IACUC) yönergelerine altında onaylanmıştır.

1. Model Seçimi

1. Kullanıma hazır olana kadar kurumsal protokollere göre rutin bakıcılık ile düşük gürültü vivaryum hayvan modeli koruyun. Hayvan araştırma tesisleri (ARF'lerdir) ise, NIH standartlarını karşılamak titreşim istikrar, gürültü sönümleme, gündüz aydınlatma, hazırlık alanı, yüzey bitirir, sızdırmazlık ve caulking ve havalandırma korumak.
   Not: ARF'lerdir ve düşük gürültü vivari bakımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) yönergeleri gözden edilebilir: http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. Tüm deneyler için, deneysel kulak gibi sağ kulağını kullanın. Sol kulak içi bir hayvan kontrolü olarak hizmet vermektedir ve cerrahi değişmiş değil.
3. Orta veya dış kulak enfeksiyonu belirtileri için önceden ameliyat modeli hayvan kontrol edin. Potansiyel işaretler hayvanın kulak sıvı veya irin drenajı, iltihaplı pinna doku ve / veya uyuşukluk içerebilir. Bu sıradışı, ama belirtildiği takdirde, ileri cerrahi önlemek ve uygun hayvan davranın.

2. Ameliyat öncesi prosedürler

1. Ameliyat öncesinde ve ketamin (100 mg / kg IP) ve xylazine (20 mg / kg IP) intra-peritoneal (IP) enjeksiyon yoluyla bir perioperatif prosedürlere hayvan, 30 dakika anestezisi. Pozitif ayak parmağı sıkıştırma refleks ile değerlendirildiği gibi ketamin (25 mg / kg IP) ve xylazine (5 mg / kg IP) daha düşük bir doz ile, gerektiğinde anestezi Supplement. Doz yaşa uygun ayarlamaları ile fareler için kurumsal izin protokoller uyarınca dozaj belirleme.
2. Tam s için kontrol edinModelin edation. Düzenli nefes oranı, bir (farelerde) refleksi eksikliği ve pedalı ve üst kapağında eksikliği (ayak-tutam) refleksleri ile işaretlenmiş açıklanan protokol bütünlüğü için anestezi aşaması 3 düzlemde kontrol edin. Anestezi bu düzeyde hayvan koruyun. Bu ameliyat sırasında ağrı ve ameliyat hareketi, kanama ve interstisyel sıvıların sızıntı azaltılması için her şeyden önemlidir.
3. Kapalı döngülü bir ısıtma yastığı ile 37.5 ° C 'de, hayvanın vücut sıcaklığı muhafaza edin.
4. Buprenorfin subkutan enjeksiyon yoluyla analjezi yönetin. Herhangi bir cerrahi rahatsızlığı en aza indirmek için analjezi olarak buprenorfin (ameliyattan önce 0.1 mg / kg SQ kez 30 dk) sunun. Kurumsal onaylanmış protokoller seçilen modele uygun Bankası dozaj ve alternatifleri. İyi aseptik teknik tatbik edilmiştir ise Antibiyotikler kullanımı gerekli değildir. Acı ve sıkıntı belirtileri varsa hayvanlar post-operatif analjezi alırsınız.
5. Ph gerçekleştirinpreoperatif ysiologic testler. Hayvan kurban etmek işitsel beyinsapı cevabı (ABR) testi ve / veya pre-operatif ve hemen önce hem bozulma ürünü optoacoustic emisyon testi (DPOAE) Sahne farenin işitme seçilen ototoksik ajanın etkisi için objektif ölçüm olarak hizmet vermektedir.

3. Cerrahi Hazırlama ve Konumlandırma

1. Ameliyat öncesi kurumsal standartlara göre tüm enstrümanları sterilize edin. İşlem sırasında gereksiz çaba ve hareketi önlemek için tutarlı, steril ve organize bir şekilde cerrahi aletler ve alanını hazırlayın. Tipik araçlar keskin diseksiyon makas, kuyumcu ipuçları, bir otolojik seçim, bir otolojik küret ve bipolar elektrokoter ünitesi (Şekil 1) ile metalik forseps birkaç çift içerir gereklidir.
2. Hazırlayın ve x 1 x 1,25 silin (~ 0.7 küçük bir üçgen parça keserek önceden labwipes yapılan kağıt fitilleri sterilize edin.75) ve bir yandan (~ içinde 1.25) baş ve işaret parmağı arasında sıkıca büküm. Sıkıca bükülmüş, son derece ince fitil oluşturulması prosedürün başarısı için her şeyden önemlidir. Cerrahi öncesi 15-20 fitiller (Şekil 2) toplam hazırlayın.
3. Hızlı bir şekilde kontrollü olarak kulak bül kemiğini delmek için bir dental sonda kullanın. 1 veya 2 mm konik ucu ile bir kayış tahrikli diş el matkap kullanılması tercih edilir. Bir ameliyat mikroskobu protokolünü tamamlamak için gereklidir. (Adım 4.7 bakınız)
4. Bir 28 G, 1/2 'iğne ile 1 ml tüberkülin şırınga seçilen ototoksik maddeyi ihtiva eden bir sulu çözeltinin 0,2 ml önceden çizin. Maddenin Tipik 1 damla (~ 10 ul) tamamen fare RWN doldurmak için yeterli değildir. Keskin konik ucu ile yapıların temel hasar önlerken bir metalik, kör uç şırınga iğnesi ajanın teslim kolaylaştırır. Kabarcıklar yanlışlıkla RWN doldurmak ve / veya uygun önleyebilirsiniz olarak şırınga içinde herhangi bir havayı dışarı atmakyuvarlak pencere kendisine maddenin uygulanması.
5. Elektrik tımar makası kullanarak post-aurikular deriden kürk çıkarın. Omuz kuşağı kaudale için rostrally auriculo-sefalik kırışık uzanan bir bölgede kürk çıkarın. Yanal mandibula açı dorsal, sagital orta hattan epilasyon uzatın. Doğru kürk kaldırılması temiz ve berrak bir cerrahi alan sürdürmek için her şeyden önemlidir. Yavaşça amaçlanan cerrahi siteden kupürleri fırçalayın.
6. Kurumsal protokollere başına hazırlanan alanın cilt sterilize edin. 2 dakika süreyle dairesel şekilde topikal etanol ile dönüşümlü betadin (povidon / iyot) uygulayın. Diğer ajanlar kurumsal rehberlere başına sübstitüe edilmiş olabilir.
7. İşlem sırasında sürekli vücut konumlandırma korumak için düz bir yüzeye hayvan yerleştirin. 36-38 ° C'de hayvanın vücut ısısını korumak için işlem sırasında vücut sıcaklığını kontrol etmek platform üzerine vücudun altına yerleştirilen küçük bir ısıtma yastığı kullanın. Ove etmeyinBu ciddi cilt hasarı ve / veya erken ötanazi hafif yol açabilir olarak hayvan rheat.
   1. Bir lokma blok / kafa tutucu aparatlar aracılığıyla hayvanın başını sabitleyin. Uzun ekseni boyunca 5 mm aralıklarla içinden delinmiş 2-4 mm çapında delikleri olan pirinç işlenmiş 2 cm ısırma bloğu ile 0,5 cm kullanmaktadır. Bu fikstür etrafında hayvanın ağzını açın ve hayvanın büyüklüğüne göre deliklerden birine ön üst dişleri uygun. Yavaşça hayvanın burnu yerinde tutmak için (Şekil 3) sırtı üzerinde küçük bir kelepçe sıkın.
   2. Isırık blok / kafa tutucu katı U-şekilli artikülasyon kolu (Şekil 3) merkeze bağlı olduğundan emin olun. "U" sol koluna bir 1 cm genişliğinde çubuk Güvenli ve sol yan kafa geri kalanı çubuk kullanın (sağ taraf her zaman ameliyat tarafıdır).
   3. Bir kez sıkıca kafa tutucu güvenli bir sol lateral dekübit pozisyonunda fare döndürün. Vücut dikkatli bir şekild yerleştirinLly düz çalışma yüzeyinde o prosedür boyunca istikrarlı olacak sağlamak ve boyun omurları üzerinde aşırı burulma stres önlemek için.
8. Bir işletim 4x, 10x yetenekli mikroskop ve cerrahi alanın üzerine 20x büyütme yerleştirin. Bu aşağıda ele iki elle cerrahi protokol için ideal olarak mikroskop eller serbest bir şekilde konumunu koruyabilirsiniz onaylayın.
9. Küçük damarların ve dokunun diseksiyonu koterizasyonun yardım için hemen kullanılabilir bir konumda ince uçlu kuyumcu el parçası ile iki kutuplu bir etkin koter ünitesi yerleştirin. Bu aynı zamanda, daha ağır kanama karşılaşılan gereken gerekli olabilir.

4. Cerrahi Yaklaşım

1. Mikroskopik büyütme altında, 1-1,5 cm postauriküler kesi, auriculocephalic kırışık yaklaşık 6-8 mm kaudal oluşturmak için keskin bir makas veya neşter bıçak kullanın. Dorsal orta hat yetişkin farelerde, bir kesiyanal mandibula açısına yakın bir noktaya yeterlidir. Dikkatle altta yatan vasküler yapıları korumak için derin kesme kaçının.
2. Değişken kalınlıkta olabilir deri altı yağ katmanı sayesinde dikkatli künt diseksiyon yürütün. Geliştirilmiş maruz gerekiyorsa Yağ güvenle kaldırılabilir. Eksternal juguler ven bu alanda erişir ve bu yapıya zarar kan kaybı ve ameliyat alanın sel büyük miktarda neden olabilir gibi ventral-medial yönde diseksiyon dikkatli olunuz. Emilebilir jelatin sünger ve / veya pamuk pelet ile herhangi bir aşırı kanamayı kontrol edin. Ağır kanama bipolar koter kullanın.
3. Yağ tabakası düzgün bölündükten sonra, servikal kas maruz kalmaktadır. Rostrally mandibulanın açısını örten merkezi maruz cerrahi alanındaki cleidomastoideus büyük kas vücut ventral eksternal juguler ven ve parotis dokusu da dahil olmak üzere önemli yapıları unutmayın. Önemli bir dönüm noktası, küçük bir sinir branc olduğunucleidomastoideus posterior / dorsal kenarı sarar (kranial sinir XI) h pinna (Şekil 4) doğru rostrally uzatmak için.
4. Yavaşça posterior / dorsal yönde cleidomastoideus kas gövdesini geri (Şekil 4, 5). Yavaşça kas vücudu saran şeffaf fasya bölün. Benzer bir şekilde, hafifçe ters (anterior / ventral) yönünde (Şekil 5) parotid ve dış juguler ven geri çekin.
5. Cleidomastoideus kas vücudun iyi geri çekilmesi ile birlikte, timpanik bulla periost parlak kubbe görünümünde (Şekil 6) girecek. Bulla kaudal, derin servikal kas, sternomastoideus yerleştirilmesi, görünümü (Şekil 6) girecek. Dorsal ve bulla kubbe rostral yönü görünür hale yüz siniri, koruyun. Kendi kendine istinat retraktörü yerleştirin (Steril titanyum atılabilir silikon gömülü shaft--sondaj öncesinde) yapıştırın.
6. Iki elle tekniği ile hafifçe altta yatan kemik maruz bipolar diatermi ile bül periost bölün. Hafifçe yükseltmek ve çevresel yönde periost itin, forseps veya Otolojik küret kullanılarak yaygın bül kubbe ortaya çıkarmak.
   Not: Adım 4,6 orta kulak boşluğuna cerrahi görünümü maksimize etmek için önemlidir. Delme sonra bül boşluğuna kanama ve / veya interstisyel sıvı sızıntısını önlemek için titiz ve nazik yumuşak doku işleme yararlanın.
7. Düzgün maruz bulla kubbe üzerine, bül rostral yönü boyunca uzanan kubbe kaudal marjı ve (kulak zarına temsil eden) gözle opak hattı arasında bir diş cerrahi matkap ile bül kemiğin içinden 2 mm pilot delik delme (Şekil 7). Böyle stapes arter gibi altta yatan yapıları korumak için sadece kemik yoluyla delmek için özen gösterin. <(Bulla kemiğin un-çatı kolaylaştırmak için yakın bir ikinci pilot delik açınstrong> Şekil 7).
8. Takı ucu forseps bir çift kullanarak, dorsal ve kaudal yönde (Şekil 8) 'de bulla kemik kapağını açmak. Yüksek büyütme altında parça parça moda kemik çıkarın. Bu arterden kanama prosedürü tehlikeye olabilir, bül kap altında doğrudan yatıyor stapes arter, delmeyin. Hala mükemmel görselleştirme ve yuvarlak pencere niş erişimi (Şekil 8) izin verirken, orta kulağa aşırı sıvı girişini önlemek için çıkarılan kemik miktarını en aza indirin.

Ototoksik Agent 5. Yuvarlak Pencere Uygulaması

1. Görünümüne kare RWN getirmek için kafa sahibine ince dönme ayarlamalar yapın. RWN tipik olarak orta kulak boşluğuna dorsal ve kaudal bulunur ve otik kapsül, kemiğin bir fincan benzeri bir girinti olarak görünür. Çoğu durumda, stapedial arter bu 1-2 mm ventral / rostral çalışır. RWN zaman tuc olabilirbulla kubbenin akut açılanma altında periferik ked. Bu gibi durumlarda, hayvanın baş dikkatli pozisyon önemlidir.
   1. Kuru kemik görülünceye kadar preoperatif hazırlanmış kağıt fitilleri kullanılarak, orta kulak ve RWN görünür tüm sıvıyı çıkarın.
      Not: ~ ototoksik madde 10 ul (1 damla) kolayca sıvı ile seyreltilebilen RWN uygulandığı gibi bu, tüm protokol en kritik adımdır.
2. Maksimum büyütme altında, tamamen doldurarak, RWN doğrudan ototoksik ajanın bir damla (~ 10 ul) uygulamak için 1 ml tüberkülin şırınga ince bir kalibreli iğne kullanın. Stapes arter bozabilir ve niş düzgün dolum olduğunu bir göstergesi olarak donuk ve puslu sıvı menisküs ile kuru niş dibinde küçük bir ışık yansıması değiştirilmesi için yakından gözlemek değil özen gösterin.
   1. Ajan yaklaşık 10 dakika maruz kalma süresi için RWN içinde dinlenmek için izin verin. Bundan sonra, tamamen wajan dışarı Ick ve aynı maddenin yeni bir uygulama ile değiştirin. Madde özelliklerine göre uygulama tekrarları belirler. Bu prosedürde toplam maruz kalma süresi tipik olarak 30 ila 60 dakika arasında değişmektedir.
   2. Prosedürün sonunda, tamamen ajan son bir kez uzak fitil ve RWN taze ajan uygulanır. Kapatılmamış bül bırakın ve cerrahi sitesi üzerinden yumuşak doku kapatmak için forseps kullanabilir.
3. 4-0, emilemeyen monofilament sütür ile cilt seviyesinde cerrahi siteyi kapatın. Kurtarma kafesi / istasyon hayvan yerleştirin. Düzenli operasyondan sonra hayvanın klinik durumunu izleyin. Stresi en aza indirmek için, yumuşak gıda ile yumuşak yatak ve takviyesi ile konut da dahil olmak üzere, uygun ortam şartlarında, hayvan koruyun. Kurumsal IACUC protokollerine göre gelecek prosedürler ve post-operatif koşulları belirlemek.
4. Cihazı sterilize etmek için kurumsal IACUC protokolleri kullanmaBir sonraki hayvan kullanılmadan önce s. Enstrüman kullanımı arasındaki uygun soğutma süre bekleyin.

6. Ameliyat sonrası Usul ve Koklear Doku Hasat

1. Aşama 2,5 anlatıldığı gibi, ameliyat sonrası istenilen noktalarda işitme fizyolojik testinin yapılmasını ve öncesinde kurban. Deneysel amaçlarına göre postoperatif prosedürleri gerçekleştirin. Istenilen postoperatif günde hayvan kurban.
2. IP enjeksiyon yoluyla tam anestezi üzerine, kurumsal IACUC protokolleri başına gerektiği gibi, hayvan kurban. Keskin bir makas kullanarak, oksiputa sadece kuyruk hayvan başını kesmek. Keskin dorsal ve ventral orta hat boyunca makasla kranial tonoz açın ve yaygın. Yavaşça zamansal kemikler ortaya çıkarmak için beyin dokusuna kepçe.
   Not: kokleadaki sonrası maruziyet değişikliklerinin soruşturma prosedürlerinin bir dizi bu noktadan şube ve tartışma bölümünde söz edilecektir. En relevan soruşturma yöntemi belirlemeDeneysel amaçlara t. Koklea kesitli sonra elektron mikroskobu planlanıyor ise, doku ön düzeltmek için kalp kateterizasyonu kullanın. Bu, bu tartışmanın kapsamı dışındadır ve başka derinlemesine katedilmiştir. ¹³
3. Makasla kafa tabanı üzerinden zamansal kemikler kesin ve derhal fiksatif çözüm yerleştirilir. Oda sıcaklığında 1.5 saat süreyle% 4 paraformaldehid içinde, doğrudan kemik bırakın. Uzun süreli İlerleyen aşamada histolojik analiz sonuçlarını sınırlamak gibi, tespit süresini izleyin. Kirecini 1 mM etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) içinde altında kalma ile zaman değişken bir süre için kemiklerin kesilir.

Sonuçlar

Yukarıdaki protokolü kullanılarak Stevens ve ark tarafından yapılan son çalışmada, her iki cinsiyette yetişkin CBA / CAJ fareler heptanol yuvarlak pencere difüzyon yoluyla maruz bırakıldı. ¹⁵ Heptanol hedeflenen üretmek için bilinen bir boşluk kavşak un-elemanı, hücrelerine geri kazanılabilir bir yaralanmadır Koklear yanal duvar. Bu çalışmanın amacı hasarlı elemanların ameliyat sonrası rejenerasyon soruşturma için izin hedeflenen koklear hasar için güvenilir bir model üretmek için oldu. Fonksiyonel son nokta olarak görev öncesi cerrahi ve ameliyat sonrası işitme eşikleri. Mikroskopi ve immünohistokimyasal boyama teknikleri morfolojik değişiklikleri incelemek için kullanılmıştır. ABR eşiklerinde önemli artışlar heptanol ile tedavi edilmiş farelerde (Şekil 9) gözlendi. Yerine heptanolden tuzlu teslim ile, sahte cerrahi alan kontrol hayvanları, herhangi bir test frekansta önemli eşik vardiya olmadığı görülmüştür.

Bir içeri doğru rektifiye karşı immüno-potasyum kanalı (Kir) 4,1 Kohleanın hasar / kurtarma görselleştirmek için dolaylı bir yöntem olarak görev yaptı. Bu tedavi ile kontrol kulakları arasındaki yüksek tekrarlanabilir farklılıklar göstermiştir. Genel boyama yoğunluğu belirgin bu alanlarda hedeflenen hasar büyük miktarda gösteren, stria vaskularis (STV) içinde ve 1-3 gün heptanol maruziyetten sonra spiral ligaman (SLF) fibrositlerinin arasında azalmıştır. Tip II ve tip IV ÖİDÖ alanları (Şekil 10) ve stv (Şekil 11) Kir 4,1 boyama yoğunluğu, belirli bir azalma vardı. Bozulmuş nükleer bütünlüğü ve kromozomal yoğunlaşma / hücresel apoptoz tipik kabarcıkların kanıtlar ayrıca koklear alanlarda nükleer counterstains (Şekil 10) görüldü. Kir 4.1 boşluklu bölgeler 7 gün belirgin çözülmüş ve 14 gün sonra tamamen yok olduğunu lekeleme. Kir 4.1 boyama yoğunluğu STV alanlarında ölçüldü zaman tedavi kulakları bir initi gösterdi7 gün heptanol maruz (Şekil 12) sonra geri kontrol yoğunluğu doğru önemli bir kayma (p <0.05) izledi al yalak.

Şekil 1. Enstrüman kurdu. Enstrümantasyon ameliyat öncesi set-up Tasvir. Tüm ekipman steril cerrahi alanında kolayca erişilebilir olmalıdır. İnce kavisli ucu Kuyumcu forseps ile ve elektro-koter ünitesi - Tipik enstrümantasyon 2 keskin diseksiyon makas, 2-3 düz ve / veya kulak küretler kavisli ucu Kuyumcu forseps, kavisli mil otolojik tüyo (gösterilmemiştir sonra Rosen ile ikame alır) içerir headpiece. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

2. Cerrahi malzemeleri rakam. RWN ortamını korumak için ek malzemeler. Kağıt fitil formasyonu (solda) sterilize labwipe kesikler, sıkı biçimlenmiş kağıt sterilize laboratuvar mendil (merkezi) ve 4 mm pamuk pelet (sağda) yuvarlak pencere niş aşırı sıvı ve kan sel silmek için kullanılır yapılan fitiller. Tıklayınız Burada bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için.

Şekil 3. Hayvan kafa tutucu. Kafa tutucu ve ısırma bloğunu gösteren bir görüntü. Bloktaki delikler uygun ve üst santral kesici dişler sabitleyin. Bir kelepçe yavaşça yerine hayvan sabitlemek için dorsal burun üzerine sıkılır. Bir kafa tutucu kullanılması başarılı cerrahi outc için kritikome. İdeal olarak, bu işlem sırasında bül cerrahi görüşlerini optimize etmek için hayvanın rostral-kaudal ekseni etrafında döndürmek gerekir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4. Cleidomastoideus m. Temel kemirgen servikal kas anatomisi ve dış juguler ven ile ilişkisini gösteren. Şematik grafik. Cleidomastoideus kas cerrahi yaklaşım sırasında en kolay tespit kastır. Timpanik bulla (siyah daire) doğru cerrahi diseksiyon yönlendirecektir kas vücudun posterior / dorsal geri çekilmesi ardından kuşatıcı fasya Yayın. Al görüntülemek için tıklayınızBu rakamın arger sürümü.

5. Cerrahi pozlama alanı Şekil. Deri ve deri altı yağ katmanları üzerinden diseksiyonu sonrası pozlama resmediyor. Notun Yapısal görülecek bir cleidomastoideus kas (A), eksternal juguler ven (B) örten kranial sinir XI şube ve maruz parotis dokuyu (C) içerir. Kranial sinir XI dalı genellikle küçük bir gemi ile ilişkili ve önceki davanın bölünmüş olması gerekir. Sağ görüntü hayvanın rostral-kaudal eksenine karşılık sola. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6. met maruzlla. cleidomastoideus geri çekilmesi ve çevre yapılara sonra timpanik bulla Poz. Kayda değer görülecek cleidomastoideus kas gövdesi (A) / posterior yansıyan dorsal dahil, fasial sinir (B) ve timpanik bulla periosteum (C) parlak kubbe. Ayrıca, timpanik bulla (yıldız) sol kaudal yönü de sternomastoideus kas ekleme not edin. Bül dorsal ve rostral yönü de fasial sinirin varlığı bulla gerçek tanımlanması için kritik bir dönüm noktası olduğunu. Sağ görüntü hayvanın rostral-kaudal eksenine karşılık sola. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 7. yuvarlak pencere niş maruz ben. Görüntü tympa resmedennic bül tamamen örten periost diseksiyonu sonrasında gözler önüne serdi. Pilot delik iyi bulla kubbe kaudal kenarı ve rostral yönü (kulak zarına temsil eden) bül içinde görüntülendi ince opak bir çizgi arasındaki yarım noktada yer almaktadır. İkinci bitişik bir pilot delik bulla kemik kolay un-çatı kolaylaştırabilir. Altta yatan stapes arter kesmemeye kadar derin sondaj Kaçınma alınmalıdır. Görüntünün alt kısmındaki koyu metalik nesne titanyum yumuşak doku retraktörü olduğunu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 8. yuvarlak pencere niş II maruz. Yuvarlak pencere niş (ok) ve stapes arter maruz kalma ile kapaksız timpanik bulla (kırmızı yapı20x büyütme altında bakıldığında 1-2 mm) niş yanal. Niş genellikle kubbe kaudal yönü de otik kapsül ile bül kubbe ile oluşturulan akut açı altında sıkışmış bir konumda bırakır. Bu niş tam görselleştirme önce ototoksik ajanın veya esneklik uygulanmasına elde edilmesi zorunludur. Interstisyel sıvı / kan büyük delikler oluşturulan zaman boşluğu sel eğiliminde kapağını açmak sırasında aşırı kemik çıkarma da kaçınılmalıdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 9. Temsilcisi sonuçları -. Heptanol bağlı işitme kaybı ve kurtarma işitsel beyin sapı cevabı Ortalama (ABR) eşikleri (dB SPL) ton pip bir fonksiyonu olarak çizilensıklığı. Ölçümler öncesi maruz kalma (Siyah-Kontrol) ve post-operatif gün (POD) 1, 7 ve 14 (Kırmızı) göre gruplandırılmış. Hata çubukları SEM'i temsil etmektedir. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir. 2014 ¹⁵ bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 10. Temsilcisi Sonuçlar - heptanol poz bölüm I'de heptanol ile tedavi kulak Potasyum İç Redresör Değişiklikler (Kir) Kanal 4.1 boyama stria vaskularis içinde (STV) ve kulakları kontrol sonrası koklear hasara Hedefli. (A) Normal Kir 4.1 Kir 4.1 (yeşil) için güçlü strial hücre afinite ile kontrol kulakları tipik boyanarak. POD1 (B) Tedavi kulak. DECR geniş vacuolized bölgelerihafifletti Kir 4.1 afinite STV Kir 4.1 boyanma yoğunluğu genel bir azalma ile birlikte STV (Ok uçları) içinde görülür. Çekirdekler propidyum iyot (kırmızı) (B) ile zıt olan. Ölçek çubuğu 15 mikron =. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir, 2014 ¹⁵ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 11. Temsilcisi Sonuçlar - heptanol maruz bölüm II'de sonra koklear hasara Hedefli heptanol tedavi kulak spiral ligaman (SL) değişiklikler kulak kontrole göre.. Normal görünen tip II spiral ligaman fibrositlerden (II) ile kontrol kulağın tipik SL içinde (A) Normal Kir 4.1 boyama (yeşil). (B) Heptanol ttip II spiral ligaman fibrositlerden, nükleer bozulma ve apoptoz (Oklar) ile tutarlı kromozomal yoğunlaşma / kabarcıkların alanında Kir 4.1 boyama yoğunluğu belirgin azalma ile reated kulak. Çekirdekler propidyum iyot (kırmızı) ile zıt olan. Ölçek çubuğu 15 mikron =. Şekil Stevens ve ark re-çizilmiştir, 2014 ¹⁵ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 12. Temsilcisi Sonuçlar -. Heptanol maruziyeti takiben koklear boyama yoğunluğu Recovery 4.1 boyama maruziyet sonrası günün bir fonksiyonu olarak çizilmiştir kır göreli parlaklık ortalama. Bağıl parlaklık heptanol tedavi olarak konfokal mikroskobu altında kır olarak 4.1 yansıtıcı yoğunluğu hesaplanıred kulaklar kontrol kulakla aynı bir yüzdesi olarak alındı. Not POD14-28 verileri eğrisi üzerinde tek bir nokta olarak bir araya getirilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil ederken katı daireler, ortalama değerleri temsil etmektedir. Göreli parlaklık önemli bir iyileşme POD 7 ve üstü tarihleri ​​(Student t testi p <0.05, yıldız) arasında gösterilmiştir. Şekil Stevens et al. Re-çizilmiştir, 2014 ¹⁵ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Yukarıda açıklanan protokol ve temsilcisi sonuçları her iki cinsiyette de dahil olmak üzere bir CBA / CAJ fare modelinde elde edilmiştir. Bu doğuştan zorlanma iyi araştırma işitme bir "iyi işitme" standart ve "normal yaşlanma" modeli olarak kuruldu. Diğer memeli modellerinde bu protokol kullanımının ^16-23 açıklaması bu metnin kapsamı dışındadır. Okuyucu RWN uygulama tekniği memeli iç kulak eğitimi için çeşitli avantajlar sunuyor, ancak, dikkat etmelisiniz. Bunlardan en önemlisi o narin anatomik yapısı direkt bozulmaya ve otik kapsülün duvarları içinde mevcut biyokimyasal geçişlerini engeller olduğunu. Böyle kokleostomisi ve infüzyon pompası implantasyonu olarak Prosedürler doğrudan kalıcı eşik vardiya giden iç kulak yapıları ihlal etmek eğilimi var; sonuçlarını analiz edilirken göz önünde bulundurulması gereken bir gerçektir. Invaziv metho tarafından koklear yanal duvar yapılarının bozulmasıds ayrıca belirli bölge etkisi o konuma sınırlıdır. Bu tür trans-timpanik enjeksiyon ve parenteral enjeksiyon olarak ^15,24 Alternatif non-invaziv yaklaşımlar güvenilmez sonuçlar ve boğulmuş olan furosemid veya heptanol gibi ototoksik maddelerin kullanımını kısıtlayabilir / veya hayvan modeli sistemik toksisite. Bu uygulama yöntemi, yukarıda tartışılan diğer invazif yöntemler yaklaşan bir tutarlılık seviyesi elde bu eksikliklerin sakınmayı kanıtlanmıştır.

Bu tekniğin diğer avantajları, hayvan modelleri ve fizibilite bir dizi geniş uygulanabilirliği varolan Laboratuvar alt içine dahil etmektir içerir. İkincisi ile ilgili olarak, herhangi bir özel reaktif veya kimyasal seçilmiş ototoksik maddeler, Anesteziyoloji ve analjezikler kenara gereklidir. Ototoksik ajanlar tipik olarak dikkate uzun süreler son çözeltisi (5 mi) içindeki bir yeterince büyük bir hacim içinde sabit bir konsantrasyonda kullanılmaktadır ve karıştırılırher uygulama ing (farelerde) içerisinde, yaklaşık 10 ul kullanır. Böylece, malzeme ve araçların ilk ihaleden sonra, araştırmacılar zaman alıcı Çözelti hazırlama veya malzemelerin sık sık değiştirilmesi görece ücretsizdir. Bu teknik aynı zamanda perilenfatik infüzyon pompaları veya cochleostomies implante ilgili prosedürlere göre önemli olabilir ameliyat süresi azalma sunmaktadır. Teknik yeterlilik seviyesine ulaştıktan sonra, kapatılmasına ilk kesi bizim ortalama tamamlanma süresi ototoksik ajan için istenen maruz kalma süresine bağlı olarak genelde 20 dakika ile 1.5 saat oldu. Üç ya da dört ameliyat kolayca artan verimlilik ve başarılı sonuçlar elde etmek için artan potansiyeli sağlayan, tek bir günde tamamlanabilir. Yukarıda tarif edildiği gibi, bu teknik aynı zamanda kolayca fareler, sıçanlar, kobaylar ve Gerbils da dahil olmak üzere, kemirgen modellerinde çeşitli uygulanabilir.

Bu yöntemin Sınırlamalar merkezli olanorta dik bir öğrenme eğrisi usta için gerekli teknik yeterlilik ulaşılana kadar beklenen sonuçları azalmıştır. Aşağıda daha ayrıntılı olarak ele alınacağı gibi, cerrahi yaklaşım ya da cerrahi alanın yetersiz görselleştirme sırasında küçük hatalar hemen her zaman kötü sonuca yol açacaktır. Böyle ajan seyreltilmesi yuvarlak pencere membran veya interstisyel sıvıya maddenin bir alt milimetre kalınlığında hava kabarcığı engelleme erişimi gibi bir acemi tanımak için başarısız olabilir ince bulgular, takdir ve bunları düzeltmek için gerekli psikomotor becerilerini geliştirmek için zaman ayırın. Ancak, bu engeller kolayca üstesinden gelmek ve yukarıda belirtilen invaziv yöntemlerin bazıları daha araştırmacılara az yıldırıcı teknik meydan oluştururlar prosedürün tekrarlanan performansı ile. Son olarak, bu teknik, koklear yaralanması, sadece cerrahi müdahale sırasında bir zaman tek bir noktada indüklenebilir göreceli sınırlama ile ilişkilidir. Bu, belirli bir dereceye kadar aşılabilir, Heydt ve arkadaşları tarafından tarif edildiği gibi madde içinde emdirilmiş jelatin sünger ile RWN doldurularak. ^10, jelatin süngerin zamanla resorbe, ancak tek başına sulu çözeltinin uygulanması yoluyla elde edilebilir daha uzun bir maruz bırakma dönemi için izin verebilir.

Bu tekniğin tam avantajları gerçekleştirmek ve herhangi tuzaklardan kaçınmak için bir araştırmacı için, bu tekniğin iki kritik unsurları tanımak önemlidir: 1) sürekli orta kulak boşluğuna ve RWN görselleştirme korumak; ve 2) yeteneği interstisyel sıvı ve / veya kan serbest cerrahi alanında tutmak için. Bu eski ulaşmada uygun bir kafa tutucu önemi vurgulanmıştır aşırı olamaz. Hayvanın başının güvenli sabitleme mikroskop altında istikrarlı bir görünüm sağlar; ince enstrümantasyon ölçüde büyütme altında yapıların konumlandırma değiştirdiğinde önemi kolayca belirginleşmektedir. İyi bir hHayvanın rostral-kaudal ekseni etrafında dönebilir ead sahibi de sitenin araştırmacının doğrultusunda önemli dinamik değişiklikleri kolaylaştırır. Çoğu zaman, bu eksen etrafında dönme birkaç milimetre RWN görselleştirme ve tek otik kapsül kemik görselleştirme arasındaki fark anlamına gelebilir. Sürekli görünümünü değiştirme yeteneği de düzgün niş ve derinliklerinden çıkarılır interstisyel sıvıyı sağlamak için her şeyden önemlidir, aynı zamanda bizim deneyim, kan, yoğunlaşma veya interstisyel sıvıda Bölüm 5'de tartışıldığı gibi ototoksik ajan tamamen uygulamalar arasında kaldırılır O orta kulak alan tüm deney müdahale etme yeteneğine sahiptir girer. Ototoksik maddenin küçük bir miktan, konu dışı sıvı daha küçük hacimlerde temas ile seyreltilebilen yuvarlak pencere (~ 10 ul) tatbik Bu durum şaşırtıcı değildir. Bu nedenle, titiz cerrahi diseksiyon, kulak bül ve dikkatli preservat parça parça kapağını açmakstapes arter iyon başarılı deneysel sonuçlar eşdeğer bulunmaktadır.

Yukarıdaki kritik adımlar gözlenir ve beklenen sonuçlar hala elde değilse, sorun başlamalıdır. Bizim tecrübelerimize göre, bu iki usul elemanların deneme varyasyonlarını gerçekleştirmek için genellikle yararlı olur. İlk ototoksik ajan yuvarlak pencerede doldurulan sıklığını değiştirmek için. Kullanılan ajana bağlı olarak, toplam maruz kalma süresi tamamlandıktan fitilleme ve ajan, her 10 dakika daha sonra değiştirme ile, 30 dakika ve 1 saat arasında değişmektedir. Kısa süreler için maruz ise, toplam olarak maruz artan ajan daha fazla zaman yuvarlak pencere zarından diffüz izin verebilir. Ek pozlama ve Yenileyici da yukarıda bahsedildiği gibi kan, yoğuşma veya interstisyel tarafından ototoksik ajanın istenmeyen seyreltme önlemek için yardımcı olabilir. Bu yaklaşımı kullanarak zaman istenmeyen riskini artırma eğilimi olarak Dikkat Bununla birlikte, muhafaza edilmelidirly stapes arter yaralanmasına ve / veya RWN için interstisyel sıvının tanıtan.

Bu teknik koklear fizyoloji ve fizyopatolojisi soruşturmalara sunduğu için ne önemlidir. Bu minimal invaziv teknik narin biyokimyasal süreçlerin detaylı çalışma sağlar ve koklear rejeneratif potansiyelinin değerlendirilmesi amacıyla bizim araştırma sürdürmek anlamına olmuştur. ^12,24 Bu cerrahi yaklaşım ve poz diğer dalı çeşitli teknikler üzerinde çoğaltılamaz ve başarılı sonuçlar istimal bu yöntem Koklear kök hücre implantasyonu çalışmalarda bildirilmiştir. ¹⁴ A great deal Ancak araştırmacılara mevcut geniş donanmasını birlikte bu teknik, bu bilgi boşluğunu daralma yardımcı olacak, koklea hakkında bilinmemektedir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Heptanol 98%	Sigma-Aldrich	H2805	PubChem Substance ID 24895536
Ketaset Injectable	Patterson Veterinary	07-803-6637	Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl)	10 ml	Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable	Lloyd Laboratories	NADA# 139-236	Concentrate 20mg/ml
Buprenex Injectable	Patterson Veterinary	07-850-2280	Concentrate 0.3 mg/ml
(Buprenorphine HCl)	5 ampules per box	Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution	Medline	MDS093941	1 Quart screw top bottle
0.9% Sterile Saline	Variable		For mixing solutions and injections
Operating Microscope	Carl Zeiss	32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth	Industrial Acoustics Company
Surgical Head Holder	Custom Made –	Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch	World Precision Instruments	555801L	Maximum spread 20 mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill	Emesco	Vintage Item
Scalpel Handle Size 6	Bard-Parker	MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade	Bard-Parker	SKU: 097-7215	50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps	Bernell	MIL17304
Iris Scissors Curved	Medline	DYND04026
Iris Scissors Straight	Medline	DYND04025
Stevens Tenotomy Scissors Straight	Medline	MDG3222111
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.00	Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	CODE 34155	White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle	Medline	MDG0396486
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100	Medline	IIS34201	Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4 mm	Richmond	Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M	Elmed	List No. 52-5770	Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle	BD	Product Number: 329410	Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle	Kendall	Product Code 8881202397	For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask	U-line	S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves	U-line	S-12549
Precision Hair Clippers	Wahl		Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle	Ethilon	1855G	Substitutions may be made.
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisher	01-812054
Dry Sterilizer	ROBOZ	Germinator TM 500