인공 와우 세포 변성을 유도하기위한 신속하고 신뢰할 수있는 기술 : Ototoxic 에이전트 배달을 위해 마우스 라운드 창 접근

요약

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

초록

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

서문

수사관들은 청각 시스템의 정상적인 기능뿐만 아니라 청력 손실의 병태 생리를 연구하는 동물 모델의 광범위한 배열을 사용했다. 이러한 모델은 다양한 병리학 적 과정에 대한 개입 연구를 수행하기위한 매우 유용하며 인체에 번역 응용 프로그램에 대한 기초 역할을합니다. 달팽이관과 연관된 청각 경로를 포함하는 대부분의 연구, 손상 또는 파괴의 정도는 몇몇 시스템에 도입해야한다. 종종 손상 의도적 연구자들은 정상적인 기능에 해당 병변뿐만 아니라 그것을 복구하는 능력 달팽이관의 효과를 연구 할 수 있도록, 특정 병변을 생성하는 것을 목표로한다. 데미지를 도입하기위한 특정 동물 모델 및 / 또는 기법 (들)을 선택했을 때, 여러 가지 요인이 최상의 결과를 달성하기 위해 고려되어야한다. 기술의 직접 및 간접 효과가있을 수 있지만 다양한 동물 모델은, 개입에 다르게 반응 할 수있다원하는 결과에 전적으로 해로운. 대부분의 경우에, 이상적인 내이 손상 프로토콜은 빠르게, 전신 독성을 방지하고 신뢰성을 손상 제조, 정밀하고 일관된 병변을 생성하고, 기능적인 세포와 분자의 변화의 추가적인 연구를 허용하기에 존속 할 것이다. 이상적으로, 이러한 방법은 가능한 최대 범위 달팽이관의 섬세한 마이크로 아키텍처 및 전기 화학적 구배를 유지한다.

지금까지 연구자 내이 손상을 유도하기 위해 다수의 기술을 확립에 성공 하였다. 이들의 대부분은 중 전신 또는 수술 적 접근을 통해 ototoxic 에이전트 달팽이관을 노출 수반한다. 기술은 perilymphatic 관류와 비경 주입, 복강 내 주사, 트랜스 고막 주사, 림프 낭 주입 및 cochleostomy을 포함한다. 이들 기술은 푸로 세 미드, 겐타 마이신, 인 ouabain 및 헵탄 등 ototoxic 제제의 다양한 도입하는데 사용되어왔다. ^1-5특정 인공 병변 생성에 성공하지만, 상기 기술들은 제한을 인정하고있다. 전신 주사는 동물을 매우 독성이 될 수 있고, 의도하지 않은 인공 욕설과 일치 결과와 연관 될 수있다. 후자의 단점은 트랜스 고막 주사와 관련이있다. 이러한 cochleostomy 및 perilymphatic 관류 같은 기술은 신속하고 신뢰성이 높은 병변을 유도 할 수있는 반면, 내이의 구조와 기능에 직접적으로 침입한다. 수술 방법의 대부분은 기술적 인 어려움의 높은 수준과 관련된 및 마이크로의 주입기와 같은 동물의 이물질을 떠날 필요로 할 수있다. ^2-4,6-8 단일 기술은 결점이없는없고, 연구자들은 선택해야합니다 방법은 신중하게 실험의 요구에 맞게. 여기, 우리는 구체적으로, 성인 마우스의 ototoxic 에이전트의 국소 전달을 위해, 둥근 창 틈새 (RWN) 응용 기술에 대해 설명합니다.

인터넷조류 모델 감각 머리 셀 변질 겐타 마이신의 효과를 연구하는 동안 처음 1998 년 알 Husmann 등에 의해 설명 된이 기술은 관련 독성을 피하면서, 전신 젠타 프로그램보다 훨씬 더 신뢰성있는 병변을 생성 할 수있는 것으로 밝혀졌다. ⁽⁹⁾ 그 후, 우리의 실험실을 포함한 다른 연구자의 수는 큰 성공에이 기술을 활용하고있다. 2004 년, HEYDT 등. 마우스 모델에 적합 화 및 겐타 마이신의 농도를 변화 배어 흡수성 젤라틴 스폰지 RWN를 충전함으로써 병변의 크기를 제어하는 향상된 능력을 설명했다. ⁽¹⁰⁾ 외., 2010, 베타 Bungarotoxin의 ototoxic 효과를 연구 팜 그렌, 유력한 대만의 독에 요소가 성인 쥐의 RWN에의 수성 형태를 적용하여, 상자를 줄무늬. ⁽¹¹⁾ 또한, 우리 실험실에서 이전 연구의 수는 furosemid의 ototoxic 효과를 연구 할 수있는 둥근 창 접근법을 활용 한전자, 인 ouabain과 헵탄. 이러한 연구의 ^5,6,12-15 결과 인공 유체 및 정상 청력에 이온 항상성의 중요성을 증명하고있다, 나선 신경절 및 인공 측면 벽에서 세포 증식 능력을 발견하고, 우리의 이해를 발전했다 노인성 난청.

다음 방법은 수술 후이 절개하고 뼈 고막의 수포의 부분 unroofing을 통해 중이에 액세스하는 것을 포함한다. 이것은 선택된 ototoxic 에이전트가 직접 적용될 수있는 RWN와 막의 우수한 노광을 허용한다. 액체 에이전트 다음 RWN의 컵 모양의 중공의 풀 (또는 천천히 RWN로 포장 포화 흡수성 젤라틴 스폰지 캐리어에서 배수) 및 인공 현관의 perilymphatic 공간으로 둥근 창 막을 통해 확산. 직접적인 cochleostomy이 접근 방식에 이루어지지 않습니다. 이 기술의 장점은 내이 마이크로 아키텍처, 회피의 보존을 포함내 동물 관리 귀 전신 독성, 수당, 효과 빠른 시작, 특정 인공 세포 유형에 선택적 변성 (예., I 형은 ouabain과 노출과 인공 형 헵탄의 치료에 의해 ​​유도 II 섬유 세포와 신경절 신경 세포 나선형), 및 재현 / 신뢰할 수있는 결과. 이 기술은 래트, 기니아 피그 및 모래 쥐를 포함하여 다른 설치류 사이 약간 변경하여 적용 할 수있다. 단점은 가파른 기술 학습 곡선과 시간에 하나의 점으로 제한됩니다 ototoxic 모욕의 상대적 제한이 포함됩니다.

프로토콜

동물 연구의 모든 측면은 해당 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 실시 하였다. 여기에 설명 된 모든 척추 동물 실험 절차는 사우스 캐롤라이나의 (MUSC) 기관 동물 관리 및 사용위원회의 의과 대학 (IACUC)의 지침에 따라 승인되었습니다.

1. 모델 선택

1. 사용할 준비가 될 때까지 기관 프로토콜 당 루틴 보살 피는와 낮은 노이즈 동식물 사육장의 동물 모델을 유지한다. 동물 연구 시설 (ARFs)에서, NIH 기준을 충족 진동 안정성, 소음 감쇠, 낮의 조명, 준비 공간, 표면 처리, 실링 및 코킹, 및 환기를 유지합니다.
   참고 : ARFs 및 저잡음 동식물 사육장의 유지 보수를 위해 국립 보건원 (NIH) 가이드 라인을 검토 할 수있다 : http://www.orf.od.nih.gov/PoliciesAndGuidelines/BiomedicalandAnimalResearchFacilitiesDesignPoliciesandGuidelines/
2. 모든 실험에서, 실험 귀으로 오른쪽 귀를 사용합니다. 왼쪽 귀는 내 동물 관리의 역할 및 수술 변경되지 않습니다.
3. 중간 또는 외부 귀 감염의 징후를 사전에 작동 모델 동물을 검사합니다. 잠재적 인 징후 동물의 귀에서 유체 또는 고름의 배수, 귓바퀴 염증 조직, 및 / 또는 혼수를 포함 할 수있다. 이는 이례적인 일이다, 그러나주의 경우, 추가 수술을 피하고 적절하게 동물을 취급합니다.

2. 수술 전 절차

1. 수술 전 및 케타민 (100 ㎎ / ㎏ IP)과 자일 라진 (20 ㎎ / ㎏ IP)의 복강 내 (IP) 주입을 통해 어떤 수술 절차에 동물 30 분 마취. 긍정적 발가락 - 핀치 반사에 의해 판단으로 케타민 (25 ㎎ / ㎏ IP)과 자일 라진 (5 ㎎ / ㎏ IP)의 낮은 복용량으로, 필요에 따라 마취를 보충합니다. 용량의 나이 적절한 조정과 마우스에 대한 제도적으로 허용 프로토콜을 준수 투여를 결정합니다.
2. 전체의 확인모델의 edation. 일반 호흡 속도, (쥐) 반사를 바로 잡고 부족하고, 페달과 눈꺼풀의 부족 (발가락 핀치) 반사에 의해 표시 설명 프로토콜의 전체 마취의 단계 3면을 확인합니다. 마취의 수준에서 동물을 유지한다. 이는 수술 중 통증과 수술 중 운동, 출혈, 간질 액의 누출을 최소화하기위한 가장 중요하다.
3. 폐쇄 - 루프 가열 패드와 37.5 ° C에서 동물의 체온을 유지한다.
4. 부 프레 노르 핀의 피하 주사를 통해 통증을 관리합니다. 어떤 수술의 불편을 최소화하기 위해 진통제로 부 프레 노르 핀 (수술 전 0.1 ㎎ / ㎏ SQ 한 번 30 분)를 제공합니다. 제도적으로 승인 된 프로토콜에 선택된 모델에 적합한 자료​​ 투여 및 대안. 좋은 무균 기술이 실행 된 경우 항생제 사용이 필요하지 않습니다. 고통과 고통의 흔적이있는 경우 동물은 수술 후 진통제를받을 수 있습니다.
5. 산도를 수행수술 전 ysiologic 테스트합니다. 동물의 희생 청성 뇌간 반응 (ABR) 시험 및 / 또는 사전에 동작 및 직전 모두 왜곡 제품 광 음향 방출 시험 (DPOAE)를 실행하면 마우스의 청력에 선택한 ototoxic 에이전트의 효과를 객관적으로 측정 역할을한다.

3. 수술 준비 및 위치

1. 사전에 동작 제도 표준에 모든 악기를 소독. 절차를 수행하는 동안 불필요한 노력과 움직임을 방지하기 위해, 일관된 멸균 및 조직 방식으로 수술 도구 및 필드를 준비합니다. 일반적인 악기 날카로운 해부 가위, 보석의 팁, 이과 선택, 이과 큐렛 및 양극성 전기 소 장치 (그림 1)과 금속 집게의 여러 쌍을 포함이 필요합니다.
2. 준비하고 X 1 X 1.25에 와이프 ​​(~ 0.7의 작은 삼각형 조각을 절단하여 사전에 labwipes로 만든 종이 심지를 소독.75) 한 손 (~ 1.25)을의 엄지 손가락과 집게 손가락 사이에 단단히 사실을 왜곡. 단단히 꼬인, 매우 얇은 심지의 창조 과정의 성공에 매우 중요합니다. 수술에 앞서 15 ~ 20 심지 (그림 2)의 총을 준비합니다.
3. 신속하게 제어 방식으로 고막 수포의 뼈를 관통하는 치과 용 드릴을 사용합니다. 1 또는 2mm 테이퍼 팁 벨트 구동 치과 용 핸드 드릴의 사용이 바람직하다. 수술 현미경 프로토콜을 완료하는 것이 필요하다. (단계 4.7 참조​​)
4. G (28), 1/2 '바늘 1ml의 투베르쿨린 주사기로 선택된 ototoxic 제를 함유하는 수용액 0.2ml를 미리 그려. 에이전트의 일반적으로 1 방울 (~ 10 μL)을 완전히 마우스 RWN을 채우기에 충분하다. 날카로운 팁으로 경사 구조를 기본으로 손상을 방지하면서 금속은 무딘 팁 주사기 바늘은 제의 전달을 용이. 거품 실수 RWN을 채우기 및 / 또는 적절한 방지 할 수 있습니다로 주사기 내의 모든 공기를 추방둥근 창 자체에 에이전트의 응용 프로그램입니다.
5. 전기 미용 가위를 사용 후 귀의 피부에서 털을 제거합니다. 어깨 거들 꼬리 쪽을 rostrally auriculo - 두개의 주름에서 연장 된 영역에서 모피를​​ 제거합니다. 옆으로 하악 각도에 지느러미, 시상 중간 선에서 머리 제거를 확장 할 수 있습니다. 적절한 모피 제거는 맑고 깨끗한 수술 필드를 유지하는 데 매우 중요합니다. 부드럽게 의도 수술 부위에서 스크랩을 브러시.
6. 기관 프로토콜에 따라 준비 영역의 피부를 소독. 2 분 동안 순환 방식으로 국소 에탄올로 교대 betadine (포비돈 / 요오드)를 적용합니다. 다른 에이전트는 제도적 가이드 라인을 대체 할 수 있습니다.
7. 절차를 수행하는 동안 일정한 몸의 위치를​​ 유지하기 위해 평평한 표면에 동물을 배치합니다. 36-38 ℃에서 동물의 체온을 유지하는 과정 동안 체온을 제어하기 위해 플랫폼에 몸체 아래에 배치 작은 가열 패드를 사용한다. 비켜하지 마십시오이 심한 피부 손상 및 / 또는 조기 안락사에 온화한로 이어질 수 있으므로 동물을 rheat.
   1. 물린 블록 / 헤드 홀더 장치를 통해 동물의 머리를 고정합니다. 장축을 따라 5mm 간격으로 뚫고이를 통해 2-4mm 직경 구멍 황동 가공 2cm 물린 블록 0.5 cm를 이용한다. 이기구의 주위에 동물의 입을 열고 동물의 크기에 따라 구멍 중 하나에 상단 중앙 앞니에 맞​​게. 부드럽게 동물의 주둥이 제자리에 고정 (그림 3)의 배부 위에 작은 클램프를 조입니다.
   2. 바이트 블록 / 헤드 홀더가 견고 U 자형 관절 암 (그림 3)의 중심에 연결되어 있는지 확인합니다. "U"의 왼쪽 팔에 1cm 폭 넓은 막대를 고정하고 왼쪽 헤드 레스트로로드를 사용 (오른쪽은 항상 작동 쪽).
   3. 일단 단단히 머리 홀더에 고정, 좌와 위치에 마우스를 회전합니다. 몸 carefu의 위치를에서야 평면 운영 표면에이 절차 전반에 걸쳐 안정 될 것입니다 확인하고 자궁 경부 척추에 과도한 비틀림 응력을 방지 할 수 있습니다.
8. 운영 4 배, 10 배 수있는 현미경과 수술 필드 위에 20 배 배율을 배치합니다. 이 아래에 설명 양손 수술 프로토콜에 적합으로 현미경은 핸즈프리 방식으로 자신의 위치를​​ 유지할 수 있는지 확인합니다.
9. 소형 선박 및 조직의 절개의 소작에 도움을 즉시 사용할 수있는 위치에 뾰족한 보석의 핸드 피스와 바이폴라 사용 소작 장치를 놓습니다. 이것은 또한 무거운 출혈이 발생한다 필요할 수 있습니다.

4. 외과 접근

1. 현미경 배율에서 1.5 센티미터 후이 절개, auriculocephalic 주름에 약 6-8mm의 꼬리를 만들 날카로운 가위 또는 메스 블레이드를 사용합니다. 지느러미 중간 선에서 성인 마우스에서, 절개옆으로 하악의 각도 가까운 지점에 적합합니다. 조심스럽게 기본 혈관 구조를 유지하기 위해 깊이 절단하지 마십시오.
2. 가변 두께 될 수있는 피하 지방 층을 조심 무딘 절개를 실시한다. 개선 된 노출에 필요한 경우 지방을 안전하게 제거 할 수 있습니다. 외부 경정맥이 지역을 통과하고이 구조의 손상은 혈액 손실 및 수술 분야의 홍수 많은 양의 원인이 될 수 복부 - 내측 방향으로 해부 할 때주의하십시오. 흡수성 젤라틴 스폰지 및 / 또는면 알약과 과도한 출혈을 제어합니다. 무거운 출혈 양극성 소작을 사용합니다.
3. 지방층이 제대로 분리되면, 자궁 근육을 노출. rostrally 하악골의 각도 위에 놓인 중앙에 노출 된 수술 분야 내에서 cleidomastoideus의 큰 근육 몸, 복부 외부 경정맥 및 이하선 조직을 포함한 중요한 구조를합니다. 중요한 랜드 마크는 작은 신경 branc입니다cleidomastoideus의 후방 / 지느러미 가장자리를 감싸는 (뇌신경 XI의) 시간은 날개 (그림 4)을 향해 rostrally 확장합니다.
4. 부드럽게 후방 / 등쪽 방향 cleidomastoideus 근육 본체를 후퇴 (도 4, 5). 부드럽게 근육의 몸을 감싸는 투명한 밴드를 나눕니다. 유사한 방식으로, 부드럽게 반대 (전방 / 복부) 방향 (그림 5)에서 이하선 및 외부 경정맥을 철회.
5. cleidomastoideus 근육 본체의 좋은 수축으로, 고막 수포의 골막의 빛나는 돔보기 (그림 6)에 올 것이다. 수포의 꼬리 측면에서, 깊은 자궁 근육, sternomastoideus의 삽입은보기 (그림 6)에 올 것이다. 지느러미와 수포 돔의 주동이의 측면에서 볼이되는 안면 신경을 보존합니다. 자체 유지 견인기를 놓습니다 (멸균 티타늄은 일회용 실리콘에 포함 shaft--드릴링 이전에) 붙여 넣습니다.
6. 양손 기술로 부드럽게 기본 뼈를 노출 바이폴라 투열 요법과 수포의 골막을 나눕니다. 부드럽게 상승과 둘레 방향으로 골막을 밀어 집게 또는 이과 큐렛을 사용하여 널리 수포 돔을 노출.
   참고 : 단계 4.6 중이 공간 수술 뷰를 극대화하는 것이 중요합니다. 드릴링 후에 수포 공동 내로 출혈 및 / 또는 간질 액의 누출을 방지하기 위해 세심한 부드러운 티슈 처리를 이용한다.
7. 제대로 노출 수포 돔시, 수포의 주동이의 측면을 가로 질러 연장 돔의 꼬리 마진 (고막을 나타내는) 눈에 띄게 불투명 한 선 사이의 치과 수술 드릴 수포 뼈를 통해 2mm 파일럿 구멍을 드릴 (그림 7). 이러한 stapedial 동맥과 같은 기본 구조를 유지하기 만 뼈를 드릴주의하십시오. <(수포 뼈의 취소 지붕을 용이하게하기 위해 인근에 제 2 파일럿 구멍을 드릴강한> 그림 7).
8. 보석의 팁 포셉 한 쌍을 사용하여, 지느러미와 꼬리 방향 (그림 8)에 수포 뼈를 뚜껑을 벗기다. 고배율에서 단편적인 방식으로 뼈를 제거합니다. 이 동맥에서 출혈 절차를 손상시킬 수 있으므로, 수포 캡 바로 아래에 놓여 stapedial 동맥에 구멍을 내거나하지 마십시오. 여전히 우수한 시각화 및 원형 윈도우의 틈새에 접속 (도 8)를 허용하면서 과도한 중이 유체 진입을 방지하기 위해 제거 된 뼈의 양을 최소화한다.

Ototoxic 에이전트의 5 라운드 윈도우 응용 프로그램

1. 보기에 정면 RWN을 가지고 머리 홀더에 미묘한 회전 조정합니다. RWN는 일반적 중이 공간의 지느러미와 꼬리 측면에 위치하며, 귀의 캡슐 뼈의 컵 같은 들여 쓰기로 표시됩니다. 대부분의 경우, stapedial 동맥이 1 ~ 2 밀리미터 복부 / 주동이 실행. RWN 때로는 TUC 될 수 있습니다수포 돔의 급성 각 형성에서 주변으로 KED. 이러한 경우에, 동물의 머리의 위치는 조심 최고이다.
   1. 마른 뼈가 가시화 될 때까지 수술 전 준비 종이 심지를 사용 중이과 RWN에 보이는 모든 유체를 제거합니다.
      주 :이 ototoxic ~ 제 10 μL (1 방울)이 유체에 의해 용이하게 희석 될 수 RWN에 적용이 전체 프로토콜의 가장 중요한 단계이다.
2. 최대 배율에서 완전히 충전, RWN에 직접 ototoxic 에이전트의 한 방울 (~ 10 μL)를 적용하는 1 ML의 투베르쿨린 주사기에 좋은 구경 바늘을 사용합니다. stapedial 동맥을 방해하고 틈새가 제대로 작성되었는지 지표로 둔 헷갈리는 유체 메 니스 커스 (meniscus)와 건조 틈새의 기지에서 작은 빛의 반사의 교체를 위해 긴밀하게 관찰하지 않도록주의하십시오.
   1. 에이전트가 약 10 분 노출 시간 RWN 내에서 휴식을 허용합니다. 그 후, 완전히 w에이전트를 ICK와 같은 에이전트의 새로운 응용 프로그램과 함께 교체합니다. 에이전트 사양에 따라 응용 프로그램의 반복을 결정합니다. 이 절차의 총 노출 시간은 일반적으로 30 내지 60 분 사이의 범위이다.
   2. 프로 시저의 끝에서 완전하게 제 마지막 시간을 얻어 심지 및 RWN 신선한 화제를 적용. 상한선이 수포를두고 수술 부위를 통해 부드러운 조직을 닫습니다 집게를 사용합니다.
3. 4-0, 비 흡수성 모노 필라멘트 봉합사로 피부의 수준에서 수술 부위를 밀봉. 복구 케이지 / 역에서 동물을 놓습니다. 정기적으로 수술 후 동물의 임상 상태를 모니터링합니다. 스트레스를 최소화하기 위해 부드러운 음식과 부드러운 침구 및 보완과 주택을 포함하여 적절한 환경 조건에서 동물을 유지한다. 기관 IACUC 프로토콜에 따라 향후 절차 및 수술 후 상태를 확인합니다.
4. 악기를 소독 기관 IACUC 프로토콜을 사용하여다음 동물에 사용하기 전에들. 악기 사용 사이의 적절한 냉각 시간을 허용합니다.

6. 수술 후 절차 및 인공 와우 조직 수확

1. 단계 2.5에서 설명한 바와 같이, 수술 후 원하는 지점에서 심리 생리 학적 검사를 수행하고 이전에 희생. 실험 목적에 따라 수술 후 절차를 수행합니다. 원하는 수술 후 하루에 동물을 희생.
2. IP 주입을 통해 완전 마취되면, 기관 IACUC 프로토콜마다 필요에 따라 동물을 희생. 날카로운 가위를 사용하여, 후두부에 바로 꼬리 동물의 목을 벨. 급격히 지느러미와 복부 정중선을 따라 가위로 두개골 볼트를 열고 널리 퍼졌다. 부드럽게 시간적 뼈를 노출 뇌 조직을 특종.
   참고 : 달팽이관의 포스트 노출 변경의 조사 절차의 숫자는이 시점에서 분기 할 수 및 토론 섹션에서 언급 될 것이다. 가장 relevan 조사 방법을 결정실험 목적에 T. 달팽이관이 절단 된 후 전자 현미경을 계획하는 경우, 조직을 사전에 해결하기 위해 심장 카테터를 사용합니다. 이이 토론의 범위를 벗어과 다른 깊이에 덮여있다. ⁽¹³⁾
3. 가위로 두개골베이스에서 시간적 뼈를 잘라 즉시 정착액 솔루션에 배치. RT에서 1.5 시간 동안 4 % 파라 포름 알데히드에 직접 담그지 뼈. 긴 기간은 이후 단계에서 조직 학적 분석 결과를 제한 할 수 있기 때문에, 고정 시간을 모니터한다. 석회는 1mM의 에틸렌 디아민 산 (EDTA)의 침수 시간을 통해 가변 기간 동안 뼈를 해부.

결과

위의 프로토콜을 사용 스티븐스 등의 최근 연구에서는 남녀의 성인 CBA / CAJ 마우스는 헵탄하는 라운드 창 확산을 통해 노출되었다. ⁽¹⁵⁾ 헵탄을 대상으로 생산하는 것으로 알려져 갭 접합되지 않은 커플러의 세포 복구 부상입니다 인공 측벽. 연구의 목적은 어떠한 손상 요소의 수술 - 후 재생의 조사를 허용 대상 달팽이관 손상 모델에 대한 신뢰성을 제조 하였다. 기능 엔드 포인트 역할을 수술 전 및 수술 후 청력 임계 값. 현미경 및 면역 조직 화학 염색 기술은 형태 학적 변화를 연구하는 데 사용되었다. ABR 임계 값 대폭 증가 헵탄 처리 된 마우스 (그림 9)에서 관찰되었다. 대신 헵탄의 식염수 배달, 가짜 수술을받은 제어 동물은 어떤 시험 주파수에서 중요한 임계 값 변화를 보여주지 않았다.

안쪽으로 정류에 대한 면역 염색칼륨 채널 (키르) 4.1 인공 구조물의 손상 / 복구를 시각화하는 간접적 인 방법으로 봉사했다. 이 치료 및 제어 귀 사이의 높은 재현성의 차이를 보여 주었다. 전체 염색 강도가 현저 이들 영역을 타겟으로 손상 다량 나타내는, 맥리의 vascularis (STV) 내 및 1~3일 헵탄 노광 후 나선형 인대 (SLF)의 사이에 섬유 세포 감소 하였다. 유형 II와 유형 IV SLFs의 영역 (그림 10)와 STV (그림 11)에서 키르 4.1 염색 강도의 특정 감소가 있었다. 중단 핵 무결성 및 염색체 응축 / 세포 사멸의 전형적인 소포의 증거는 이러한 인공 와우 지역에서 핵 대조 염색 (그림 10)에 보였다. 키르 4.1의 공포 형성 영역 7 일에 현저하게 해결 14 일에서 완전히 결석 있었다의 염색. 키르 4.1 염색 강도 STV의 분야에서 정량 때, 치료 귀 initi을 보여 주었다칠일 헵탄 노출 (그림 12) 후 다시 제어 강도위한 중요한 변화 (P <0.05) 다음에 알 통.

그림 1. 악기 설정합니다. 장비의 수술 전 셋업의 묘사를. 모든 장비는 무균 수술 분야 내에서 쉽게 접근 할 수 있어야합니다. 미세 곡선 팁 보석상의 집게로하고, 전기 소작 장치 - 일반 장비 2 날카로운 해부 가위, 2-3 직선 및 / 또는 귀 큐렛 (curettes)와 곡선 팁 보석상의 집게, 곡선 축 이과 예상 (미도 나중에 로젠으로 치환 선택합니다) 포함 투구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 외과 용 용품을 그림. RWN 환경을 유지하기위한 추가 공급하고 있습니다. 종이 심지 형성 (왼쪽)에 대한 살균 labwipe 컷 아웃은 밀접하게 형성 용지는 멸균 실험실 와이프 (가운데) 및 4mm면 펠릿 (오른쪽) 둥근 창 틈새에서 초과 유체 및 혈액 홍수를 닦아하는 데 사용됩니다 만든 위크가. 를 클릭하십시오 여기에이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.

그림 3. 동물 머리 홀더. 헤드 홀더와 바이트 블록을 묘사 한 이미지. 블록 내의 구멍과 맞 상부 중절치 확보. 클램프 부드럽게 장소에서 동물을 보호하는 등의 주둥이를 통해 강화된다. 머리 홀더의 사용은 성공적인 수술 OUTC 중요하다오메. 이상적으로,이 절차를 수행하는 동안 수포의 수술 뷰를 최적화 할 수있는 동물의 주동이의 - 꼬리 축을 중심으로 회전 할 수 있어야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. Cleidomastoideus 분. 기본적인 설치류 자궁 근육의 해부학과 외부 경정맥과의 관계를 묘사. 회로도 그래프. cleidomastoideus 근육 수술 방법 중 가장 쉽게 확인 된 근육이다. 고막 수포 (검은 색 원)을 향해 외과 해부를 직접 것 근육 본체의 후방 / 지느러미 후퇴 다음에 감싸는 밴드의 릴리스. 알을 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 arger 버전.

5. 외과 노광 영역도. 피부 및 피하 지방 층을 통해 절개 후 노출을 보여줍니다. 메모의 최적 구조는 cleidomastoideus 근육 (A), 외부 경정맥 (B)를 덮는 뇌신경 XI의 분기 및 노출 이하선 조직 (C)를 포함한다. 뇌신경 XI 분기 종종 작은 혈관과 관련된 사전 절차로 나눌 수 있어야합니다. 오른쪽 이미지는 동물의 주동이의 - 꼬리 축에 해당하는 왼쪽에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6. BU 노출LLA. cleidomastoideus의 수축과 주변 구조 후 고막 수포의 노출. 주목할 랜드 마크 cleidomastoideus 근육 본체 (A)는 / 후방 반사 등쪽 포함 안면 신경 (B), 및 고막 수포 골막 (C)의 반짝이 돔. 또한, 고막 수포 (별표)의 왼쪽 꼬리 측면에서 sternomastoideus 근육의 삽입을 확인합니다. 수포의 지느러미와 주동이의 측면에서 안면 신경의 존재는 수포의 사실 확인을위한 중요한 랜드 마크입니다. 오른쪽 이미지는 동물의 주동이의 - 꼬리 축에 해당하는 왼쪽에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7. 라운드 창 틈새 시장을 노출 나는. 이미지가 tympa을 묘사NIC의 수포는 완전히 덮고있는 골막의 박리 후 노출. 파일럿 홀은 가장 수포 돔의 꼬리 가장자리와 주동이의 측면 (고막을 나타내는) 수포 내에 가시화 미묘한 불투명 한 선 사이의 중간 지점에 위치한다. 두 번째, 인접 파일럿 구멍이 수포 뼈를 쉽게 해제 지붕을 용이하게 할 수있다. 기본 stapedial 동맥을 손상하지 않도록 깊은 드릴링의 회피는주의해야한다. 이미지의 맨 아래에있는 어두운, 금속 물체가 티타늄 연부 조직 트랙터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 8. 라운드 창 틈새 II 노출. 둥근 창 틈새 (화살표)과 stapedial 동맥의 노출 상한선 고막 수포 (빨간색 구조20 배 배율에서 볼 때 1-2mm)는 틈새 시장 측 방향. 틈새 시장은 종종 돔의 꼬리 측면에서 귀의 캡슐 수포 돔에 의해 형성된 예각 아래에 자리 잡고있는 위치에 낳는다. 그것은 틈새 시장의 전체 시각화 전에 ototoxic 에이전트 또는 심지의 응용 프로그램에 달성하는 것이 필수적이다. 간질 액 / 피가 큰 구멍이 생성 될 때 공동 홍수하는 경향으로 uncapping 동안 과도한 뼈 제거도 피해야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 9. 대표 결과 -. 헵탄 난청 및 복구가 청성 뇌간 반응을 평균 (ABR) 임계 값 (dB SPL)은 톤 핍의 함수로 꾸몄다회수. 측정은 사전 노출 (블랙 제어) 및 수술 후 하루 (POD) 1, 7, 14 (적색)에 따라 그룹화됩니다. 오차 막대는 SEM을 나타냅니다. 그림은 스티븐스 등의 알에서 다시 그려졌다. 2014 년 ⁽¹⁵⁾ 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 10. 대표 결과 - 헵탄 노출 부분 I. 헵탄으로 치료 귀 칼륨 내부 정류기의 변화 (키르) 채널 4.1 염색 맥리의 vascularis 내 (STV)과 귀를 제어 한 후 인공 손상을 표적으로 한. (A) 일반 키르 4.1 키르 4.1 (녹색)에 대한 강력한 strial 세포 친 화성으로 제어 귀 일반적인 염색. POD1에 (B) 치료 귀. DECR의 대형 vacuolized 영역완화 키르 4.1 선호도 STV 키르 4.1 염색 강도의 전반적인 감소와 함께 STV (화살촉)에서 볼 수 있습니다. 핵는 프로피 듐 요오드 (적색) (B)와 대조된다. 스케일 바는 15 μm의 =. 그림은 스티븐스 등에서 다시 그려되었으며, 2014 년 ^(15)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 11. 대표 결과 - 헵탄 노출 부분 대전 후 인공 손상을 표적으로 헵탄 처리 귀 나선 인대 (SL)의 변화가 귀를 제어 할 수 비교.. 정상 나타나는 유형 II 나선 인대 섬유 세포 (II)와 제어 귀 전형적인 SL 내에서 (A) 일반 키르 4.1 염색 (녹색). (B) 헵탄 t유형 II 나선 인대 섬유 세포, 핵 분열 및 세포 사멸 (화살표)과 일치 염색체 응축 / 소포의 영역에서 키르 4.1 염색 강도의 현저한 감소와 reated 귀. 핵은 프로피 디움 요오드 (빨간색)으로 대조된다. 스케일 바는 15 μm의 =. 그림은 스티븐스 등에서 다시 그려되었으며, 2014 년 ^(15)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 12. 대표 결과 -. 헵탄 노출 다음 인공 염색 강도의 회복은 4.1 염색은 노출 후 하루의 함수로 꾸몄다 키르의 상대 휘도를 의미한다. 상대 휘도는 헵탄 치료에 공 초점 현미경 아래에서 키르 4.1 반사 강도를 계산한다에드 귀를 제어 귀에서 동일한의 비율로한다. 참고 POD14-28 데이터는 곡선의 단일 지점으로 풀링됩니다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 표현하면서 솔리드 원은 평균 값을 나타냅니다. 상대 휘도의 중요한 복구 POD 7 이상 날짜 (학생의 t- 테스트 P <0.05, 별표) 사이에서 증명되었다. 그림은 스티븐스 등.에서 다시 그려되었으며, 2014 년 ^(15)는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

상기 프로토콜 및 대표적인 결과는 남녀 모두 포함 CBA / CAJ 마우스 모델에서 얻어졌다. 이 근친 변형이 잘 연구를 듣고 "좋은 청력"표준 "정상적인 노화"모델로 설정됩니다. 다른 포유 동물 모델에이 프로토콜의 사용의 ^{16 ~ 23} 설명이 텍스트의 범위를 벗어납니다. 독자는 RWN 응용 기술은 포유류의 내이 공부에 여러 가지 이점을 제공한다는 점에 유의해야한다. 이들 중에서 가장 두드러진은 민감한 해부학 적 구조를 직접 파괴 및 귀 캡슐의 벽 내에 존재하는 생화학 적 구배를 피할 수 있다는 점이다. 이러한 cochleostomy 및 주입 펌프의 주입 등의 절차는 직접 영구 임계 값의 변화를 선도하는 내이 구조를 위반하는 경향이있다; 결과를 분석 할 때 고려되어야 사실. 침략 운전 방식에 의한 인공 측벽 구조의 중단DS는 또한 특정 영역 효과의 위치로 제한됩니다. 이러한 트랜스 고막 주사와 정맥 주입 ^15,24 대체 비 침습적 방법을 신뢰할 수없는 결과에 의해 괴롭혀 된 푸로 세 마이드 또는 헵탄 등 ototoxic 에이전트의 사용을 제한 할 수있다 / 또는 동물 모델에 전신 독성. 이 도포 방법은 상술 침습적 방법의 접근 일관성의 레벨을 달성 이러한 단점을 모두 방지 입증되었다.

이 기술의 또 다른 장점은 동물 모델과 가능성의 수에 넓은 적용이 기존의 실험실 인프라에 통합되어 있습니다. 후자에 대해 어떠한 전문 시약이나 화학 물질이 선택한 ototoxic 제, 마취제 및 진통제 제외하고 필요하지 않습니다. Ototoxic 화제는 전형적으로 고려 장시간 지속하는 용액 (5 ㎖)의 충분한 양의 고정 농도로 사용하고 혼합각 응용 프로그램을 보내고하면 (마우스) 10 μl를 사용합니다. 따라서, 소모품 및 기기의 초기 구매 후, 연구자들은 시간이 소요 솔루션 준비 또는 재료의 잦은 교체에서 상대적으로 자유 롭다. 이 기술은 또한 perilymphatic 주입 펌프 또는 cochleostomies의 주입을 포함하는 절차에 비해 중요 할 수 있습니다 수술 시간의 감소를 제공합니다. 기술적 능력의 레벨에 도달하면, 고정 초기 절개에서 우리의 평균 완료 시간 ototoxic 에이전트 원하는 노출의 길이에 따라 일반적으로 20 분 내지 1.5 시간이었다. 세 가지 또는 네 개의 수술은 쉽게 효율성 향상 및 성공적인 결과를 얻기위한 증가 가능성을 허용, 단 하루 만에 완료 할 수있다. 전술 한 바와 같이,이 기술은 또한 쉽게 마우스, 래트, 기니아 피그 및 모래 쥐 설치류를 포함한 다양한 모델에 적용될 수있다.

이 방법의 한계에 집중되어적당히 가파른 학습 곡선을 습득하는데 필요한 기술적 능력에 도달 할 때까지 기대되는 결과를 감소. 아래에서 더 상세히 논의되는 바와 같이, 외과 수술 방식 또는 필드의 불충분 시각화하는 동안 작은 오류는 거의 변함 불량한 결과로 이어질 것이다. 이러한 에이전트를 희석 둥근 창 막 또는 간질 액에 에이전트의 서브 밀리미터 두께의 기포 차단 액세스와 같은 초보자가 인식하지 못할 수 있습니다 미묘한 결과는 감사하고 해결하기 위해 필요한 정신 능력을 개발하는 데 시간이 걸릴. 그러나 이러한 장애물을 쉽게 극복하고 상기 침습적 방법 중 일부에 비해 연구자에 덜 어려운 기술적 과제를 구성하는 절차의 반복되는 성능. 마지막으로,이 방법은 인공 와우 부상에서만 수술 중에 노출 시간에 단일 지점에서 발생 될 수있는 상대적으로 한계와 연관된다. 이것은 어느 정도 극복 될 수있다, HEYDT 등에 의해 설명 된 바와 같이 제 배어 흡수성 젤라틴 스폰지 RWN 채워서. ¹⁰ 흡수성 젤라틴 스폰지는 시간에 재 흡수되지만, 단독으로 수용액의 적용을 통해 달성 가능한 것보다 더 긴 노출 기간을 허용 할 수있다.

이 기술의 모든 이점을 인식하고 함정을 피하기위한 조사자 위해,이 기술의 두 핵심 요소가 인식하는 것이 중요하다 : 1)로 일관 중이 공간 RWN 시각화 유지하는 단계; 2) 능력 간질 액 및 / 또는 혈액의 무료 수술 필드를 유지합니다. 이들의 전 달성을, 적절한 헤드 홀더의 중요성이 강조 오버 될 수 없다. 동물의 머리를 안전하게 고정은 현미경 안정적인 전망을 보장; 미묘한 기기가 급격히 확대 하에서 구조의 위치가 변경 될 때의 중요성은 쉽게 명백해진다. 좋은 시간동물의 주동이의 - 꼬리 축을 중심으로 회전 할 수 EAD 홀더는 사이트의 조사의 라인에서 중요한 동적 변경을 용이하게한다. 종종,이 축을 중심으로 회전 몇 밀리미터 RWN 시각화 만 귀 캡슐 뼈 시각화의 차이를 의미 할 수있다. 계속보기를 변경하는 기능도 제대로 틈새와 깊이에서 제거 간질 액을 보장하는 가장 중요 또한 우리의 경험, 혈액, 응축, 또는 간질 액에서 제 5 부에서 논의 된 바와 같이 ototoxic 에이전트는 완전히 응용 프로그램 사이에 제거됩니다 즉 중이 공간은 전체 실험을 방해하는 기능을 가지고 들어간다. ototoxic 에이전트의 작은 양이 쉽게 외부 유체의 아주 작은 볼륨으로 접촉에 의해 희석 될 수있는 둥근 창 (~ 10 μL)에 적용 이것은 놀라운 일이 아니다. 이 때문에, 세심한 수술 해부, 고막 수포 및주의 preservat의 단편 uncappingstapedial 동맥의 이온은 성공적인 실험 결과와 동등하다.

위의 중요한 단계는 관찰과 예상 결과는 아직 달성되지 않은 경우, 문제 해결을 시작해야합니다. 우리의 경험에 의하면, 두 개의 절차 적 요소의 시험 변형을 수행하는 것이 도움이된다. 첫째는 ototoxic 에이전트 둥근 창 보충되는 빈도를 변경하는 것이다. 사용되는 에이전트에 따라 총 노출 시간은 완전한 위킹 및 제 매 10 분 이후 여분으로, 30 분 및 1 시간 사이이다. 짧은 기간에 대한 노출되면, 전체의 노출을 증가시키는 것은 에이전트 더 많은 시간이 둥근 창 막에 걸쳐 확산 할 수있다. 추가 노광 및 보충 또한 전술 한 바와 같이 혈액, 축합 또는 간질 의해 ototoxic 제의 불필요한 희석을 방지하는 데 도움이된다. 이 방법을 사용할 때 부주의의 위험을 증가시키는 경향으로주의 그러나 유지되어야LY는 stapedial 동맥 부상 및 / 또는 RWN에 간질 액을 소개합니다.

이 기술은 인공 생리 및 병태 생리의 조사에 제공하는 것에에서 중요하다. 이러한 최소 침습 기술은 섬세한 생화학 적 과정의 상세한 연구를 허용하고 인공 회생 가능성을 평가할 목적으로 연구를 발전에 동등했다. ^{12, 24이} 수술 방법과 노출 또는 다른 파생 기술의 다양한 통해 재생되고, 성공적인 결과는이를 이용 방법은 인공 줄기 세포 주입의 연구에서보고되고있다. ⁽¹⁴⁾ 많은 그러나, 연구자가 사용할 수있는 넓은 필수품 전반과 함께이 기술은,이 기술 격차를 좁히는 데 도움이됩니다, 달팽이관에 대한 알 수없는 남아 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Heptanol 98%	Sigma-Aldrich	H2805	PubChem Substance ID 24895536
Ketaset Injectable	Patterson Veterinary	07-803-6637	Concentrate 100mg/ml
(Ketamine HCl)	10 ml	Schedule CIII controlled substance
Anased Injectable	Lloyd Laboratories	NADA# 139-236	Concentrate 20mg/ml
Buprenex Injectable	Patterson Veterinary	07-850-2280	Concentrate 0.3 mg/ml
(Buprenorphine HCl)	5 ampules per box	Schedule CIII controlled substance
Betadine Skin Prep Solution	Medline	MDS093941	1 Quart screw top bottle
0.9% Sterile Saline	Variable		For mixing solutions and injections
Operating Microscope	Carl Zeiss	32192
Controlled Acoustics Environment Sound Booth	Industrial Acoustics Company
Surgical Head Holder	Custom Made –	Please see Figure 3
Medical University of South Carolina
Neck Soft-Tissue Retractor (Wire Speculum, Titanium) 1.75 inch	World Precision Instruments	555801L	Maximum spread 20 mm
Embedded in disposable putty to affix dynamically to head holder
90N Dental Belt Driven Hand Drill	Emesco	Vintage Item
Scalpel Handle Size 6	Bard-Parker	MEDC-011990
#15c Stainless Steel Surgical Scalpel Blade	Bard-Parker	SKU: 097-7215	50 Blades/Box
Via ACE Surgical Supply Code
Straight Tip Jewelers Forceps	Bernell	MIL17304
Iris Scissors Curved	Medline	DYND04026
Iris Scissors Straight	Medline	DYND04025
Stevens Tenotomy Scissors Straight	Medline	MDG3222111
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Lightly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.00	Figure 1 demonstrates angled shaft picks. This was later substituted for the Rosen picks
Rosen Ear Needle Straight Shaft, Strongly Curved Tip	MytaMed	Item# 6.56.01
Kimwipes Delicate Task Wipers	Kimtech Science	CODE 34155	White, Size 4.4x8.4 Inch. Cut to triangles and rolled into fine tip wicks.
House Ear Curette, 6” shaft, light angle	Medline	MDG0396486
Gelfoam (absorbable gelatin sponge) Size 100	Medline	IIS34201	Substitutions may be made
Cotton pellets #3 4 mm	Richmond	Manufacturer Code 100108
ElectroSurgical Unit 100 E M/M	Elmed	List No. 52-5770	Bipolar and Monopolar Capable
1cc U-100 Insulin Syringe 28G, 0.5” length needle	BD	Product Number: 329410	Optional for delivery of Ototoxic agent
23G, blunt tip, 1” length needle	Kendall	Product Code 8881202397	For controlled delivery of Ototoxic agent with less risk of damaging stapedial artery
Surgical Mask	U-line	S-10478
Exam Grade Nitrile Surgical Gloves	U-line	S-12549
Precision Hair Clippers	Wahl		Multiple models may be substituted
5-0 Nylon black monofilament suture on PC-1 13 mm 3/8 circle needle	Ethilon	1855G	Substitutions may be made.
Instant Sealing Sterilization Pouch	Fisher	01-812054
Dry Sterilizer	ROBOZ	Germinator TM 500