Kolon Kök Hücre Mutasyonların Kantitasyonu

Özet

We report significant improvements for the reproducible measurement of somatic colonic stem cell mutations after exposure of mice to potential DNA damaging agents.

Özet

Kök hücre mutasyonları ölçmek için yeteneği, kimyasal potansiyel kansere yol mutasyonlar neden olabilir eğer ve ne ölçüde eleştirel bir hücre popülasyonu ölçmek için güçlü bir araçtır. X-bağlantılı glikoz-6-fosfat dehidrojenaz geni kök hücre mutasyonlan ölçmek için bir enzim testi kullanımı daha önce bildirilmiştir. ¹ Bu yöntem, bir veren bir reaksiyon karışımı ile kesitli doku dondurulmuş bölümleri ve inkübasyon hazırlık gerektirir Hücreler fonksiyonel glikoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD) enzim üreten eğer mavi renk. Eğer değilse, hücreler beyaz görünür. Bu polivinil alkol yerine optimal kesme sıcaklık Bileşik (Ekim) ortamı kullanılarak reaksiyon karışımı olarak var. Bu pH ölçme kolaylaştırır G6PD boyama bileşenlerin çözünürlüğünü arttırır ve G6PD enzimin yayılmasını engellemektedir. Bir mutasyonun kök hücre meydana geldiğini göstermek için, tüm kript G6PD enzimatik yoksun olmalıdırfaaliyet. Bir kök hücre barındıran Sadece eğer bir fenotipik G6PD mutasyon crypt döl tüm G6PD enzimatik aktivitesini yoksun olacak. Kök hücre mutasyonu olan crypts belirlemek için, arka arkaya dört bitişik dondurulmuş kesitler (seviye) 7 um kalınlığında kesildi. Bitişik kesim yapma Bu yaklaşım, aynı mutasyona uğramış crypt bitişik bölümlerde görüleceği beri crypt tam mutasyona edildi uymasını sağlar. 50'den fazla um ayrı olan doku örnekleri ile slaytlar fare başına> 10 ⁴ crypts toplam değerlendirmek için hazırlanmıştır. Mutasyon sıklığı tedavi grubunda yabani tip (mavi) kript sayısına göre ÷ gözlemlenen mutasyona uğramış (beyaz) kript sayısıdır.

Giriş

Kolon kanseri DNA zarar verebilir çevresel ajanlar ve diyet bileşenlerin etkilenmemesi içerir ve (örneğin, APC), tümör baskılayıcı genler mutasyonları onkojenler somatik mutasyonlar aktive (örneğin, ß-katenin) ya da inaktive üretmek düşünülmektedir. Bu kritik mutasyonlar kolon kök hücrelerinde meydana geldiği kabul edilir. Çünkü kolon epitel eşsiz kript mimarisi, bu kolon kanserinin ilişkili kimyasallara maruz hayvanların sonra kolonda kök hücre mutasyonları ölçmek mümkündür. Mutasyonlar, bir kript içinde tüm hücrelerde mevcut olacak şekilde çeşitli X-bağlantılı enzimler, kök hücrelerin meydana mutasyon için gösterge olarak görev yapabilir.

Daha önce, bir prosedür farelerde kalın bağırsak tümörlerini neden kimyasallar da X-bağlı glukoz-6-fosfat dehidrojenaz (G6PD) geni mutasyonlarının analizi ile kolon somatik kök hücre mutasyonlan oluşturulan gösteren basıldı. ^1-3Yöntem herhangi bir seçim baskısı olmadan kolon kök hücrelerin rastgele somatik mutasyon sıklığı quantifies. Prosedür muamele edilmiş olan ve kontrol farelerinin sabitlenmemiş dondurulmuş kolon bölümlerinin üretimi ve işlevsel G6PD aktiviteye hücrelerinden yoksun kript tanımlanmasını içerir. , Beyaz görünmesini bu mutasyona uğramış kriptler, mutasyon da mutasyona uğramış G6PD geni barındıran soyu doğurdu kök hücre meydana geldiğini göstermektedir. Enzimatik tahlilde, G6PD eksikli mutant kript nitro mavi tetrazolium (NBT) azalması için gerekli olan glikoz-6-fosfat, okside edilemez. G6PD enzimi işlevsel olduğu zaman, boyama karışımında NBT enzim ve mavi "boyama" hücre yerde biriken çözünmeyen formazana ve çökeltileri düşürülür. G6PD mutantlar hücreler mavi lekeli vahşi tip crypts aksine beyazımsı kalır. Bu yöntem, bir "boş" fenotipe sahip mutasyonları ölçer. Tr Çünküenzimler, örneğin G6PD gibi bölümler, sulu bir çözeltiye yerleştirilmiş ise, bir tespit edilmemiş dokuda bölümündeki hücrelerin üzerinden difüze olabilir, bu analiz edilecek doku kesitlerinde enzim stabilize etmek için gerekli olan. ⁴ enzim stabilizasyon Doku G6PD enzimatik reaksiyon için gerekli olan küçük reajan moleküllerinin difüzyon engel olmamalıdır.

Biz orijinal prosedüre önemli bir dizi değişiklik yaptık. Kritik enzimatik boyama ortam pH'ının kontrolüne ve deneyde kullanılan bileşenlerin çözünürlüğünü kolaylaştırır Optimal Kesme Sıcaklık Bileşim (Ekim), polivinil alkolden değiştirilmiştir. Her bir doku kesiti G6PD reaksiyon karışımının, aynı hacimde, böylece çelik pullar imal 0,5 mi kuyu - boyama 0,4 kullanılarak gerçekleştirilir. Bir prosedür kalmadan kolon dokusunun büyük bir örnekleme sağlayan görüntülü bölümünde kriptalarının sayısını tahmin için geliştirilmiştirEl> Her kolon için 10 ⁵ crypts saymak. Bitişik 7 mikron doku kesitlerinde analizi, potansiyel boyama eserler azaltır birden fazla slayt üzerinde bir mutant crypt görselleştirme tanıyor. Bu değişiklikler prosedürü daha verimli ve tekrarlanabilir hale.

Bu yeniden protokolü kullanarak, kemirgenlerde iyi bilinen kolon kanserojen azoksimetan C57BL / 6 farelerinin maruz kaldıktan sonra kolon kök hücrelerinde mutasyon sıklığı sayısal var. ^5-7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Deney prosedürleri ve hayvanların etik tedavi Pittsburgh IACUC Üniversitesi (protokol # 1104674) tarafından onaylanmıştır.

G6PD Boyama karışımının hazırlanması 1.

NOT: Her birinin reaktiflerin nihai konsantrasyon olduğunu temin etmek; 5 mM glikoz-6-fosfat (G6P); 2 mM NADP, 5 _mM MgCl2, 0.35 mM 1-metoksi-5-methylphenazinium metil sülfat (MMPMS) ve 0,8 mM NBT. Başlangıç ​​konsantrasyonu, 40 ml'lik bir nihai hacim için elde edilmiştir, her bir reaktif için ^1,8,9. Çözümler, taze hazırlanmış ve her gün kullanıldı.

1. 50 ml'lik bir tüp içinde Ekim ortamı 35 ml 200 mM pH 7.4 fosfat tampon maddesi (PB) 2 ml ilave edilir ve kuvvetli bir şekilde çalkalanır. Solüsyon pH 7.4 pH kağıdı ile onaylayın. Aksi takdirde çözüm atın.
2. 61 mg G6P 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ekle, 61 mg NADP 200 mM PB 0,94 ml içinde çözüldü ve 41 mg _MgCl2 0.96 ml 100 mM PB içerisinde çözündürüldü. PH olduğunu Reconfirm ~ 7,4 with pH kağıdı. Değil ~ 7.4 Eğer çözüm atın.
3. 200 mM PB (pH 7.4) 0.25 ml içinde çözüldü MMPMS 5 mg ekleyin. Şiddetle açık koyu kırmızı homojenatın üretmek için ortaya çıkan reaksiyon karışımı sallayın. Çözelti bulanık olduğu takdirde, karışım atılmalıdır. Reaksiyon karışımını içeren tüp ışığa maruz kalmasını en aza indirmek için folyo ile sarılır. Son bileşeni, NBT, hazırlanırken oda sıcaklığında, reaksiyon karışımı saklayın.
4. Bir O-ring kapaklı bir 2 ml tüp içinde NBT 164 mg 0,4 ml susuz dimetil formamid (DMF) ile 0,4 ml susuz etanol eklenerek ayrı ayrı 5 mM NBT solüsyonu hazırlayın. Gevşek kapağını kapatın (ağzı sıkıca kapatılmış değil) ve NBT çözelti içinde olduğu kadar bir yağ banyosu içinde güçlü bir raddeye çözüm getirecek. ⁸
5. Çözündürülmüş NBT oda sıcaklığına soğumaya bırakıldı ve daha sonra tepkime karışımına Ekim çözüm tüm ekleme ve berrak bir çözelti elde etmek için kuvvetli bir şekilde çalkalanır izin verir. Koyu kırmızı veya amacı ü başlangıç ​​portakal rengi-kırmızı çözelti renk değişimi dikkate alınmalıdırzamanla le rengi. Bu normal.
6. Kullanımdan önce 1 saat süreyle 37 ° C sıcak bir odaya son G6PD boyama karışımı yerleştirin.

2. Hayvan Tedavisi ve Doku Toplama

1. DNA hasar verici madde ile, örneğin 6 haftalık C57BL / 6 erkek farelere verilmesi tedavi, ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS hacminde 10 mg / kg azoksimetan (AOM). Ip enjeksiyonu ile 200 ul PBS kontrol fareleri tedavi edin.
2. 90 gün sonra, CO IACUC protokolü ile onaylanan servikal dislokasyon ₂ boğulmaya fareler euthanize.
3. Cerrahi sadece sternum tabanına anüs yukarıdan karın boşluğuna açılır. Vücut boşluğundan dışarı ince bağırsağı taşımak ama tüketim yok. Sadece rektum çekum altında alt bağırsak tüketim. ¹⁰
4. Dikkatli bir şekilde mikro-disseksiyon makas kullanılarak kolon bir tarafı boyunca dilim ve temiz ve steril PBS ile yıkanarak açılan kolondan dışkı çıkarmak. Tüketim İsviçre ruloBir doku kalıbı içinde luminal dışa bakan tarafı ve yerine d kolon. ¹⁰
5. Tamamen bir Dewar sıvı N ₂ ihtiva eden Ekim, orta ve yer kalıpta kolon batırmayın. Plastik taban sadece Ekim ortamı donup kadar sıvı N ₂ ile temas halinde olacak şekilde kalıp tutun.
6. Dondurulmuş bölümleri kesme kadar -80 ° C'de dondurulmuş doku bloğu saklayın. G6PD enzimin inaktivasyonu ile sonuçlanacaktır bir fiksatif, kullanmayın.

Dondurulmuş Bölüm 3. Hazırlık

1. -25 ° C de, bir kriyostat kullanarak 7 um kadar bir kalınlıkta donmuş doku bölümleri kesilir. 4 ardışık 7 mikron bölümleri kesmek için ve aynı slayt (Şekil 1) ikisini yerleştirin. Kolon (Şekil 1) bir düzeyde temsil etmek 2 slaytları ya da dört ardışık 7 mikron bölümleri hazırlayın.
2. Pr son bölümünden> 50 mikron minimum mesafe ile bir sonraki seviyeye için tekrarlayınevious seviyesi. Bu mesafe, her seviye için değerlendirilen kriptler birbirlerine yinelenen vermedi sağlanmalıdır.
3. Sıkça kesme sırasında biriken Ekim artıklarını çıkarın% 100 etanol ile kriyostat bıçağını silin. Kesit sürdürülür önce kuru bıçak birikmiş statik elektriği boşaltmak için, antistatik kurutucu tabaka ile silinir. C ^o -80 donmuş bölümleri ile mağaza slaytlar

Dondurulmuş Bölüm Doku 4. Boyama

1. Yüksek nem ile 37 ° C sıcak odada enzim histokimyası reaksiyonu gerçekleştirin.
   NOT: Bir kuluçka fırında veya sıcak bir slayt enzimatik reaksiyonu çalışılıyor yoksul ve tutarsız G6PD boyama açtı.
2. Silikon gres (Şekil 1) kullanılarak birbirine bağlanmış iki 1.5 cm x 0.15 cm çelik pullar (iç çap x yükseklik) kullanarak doku boyama kuyu oluşturun. Merkezi ile kuyu tabanı sığdırmak için parafilm kesin kesip ve iyi yerslayt doku bölümünde üzerinde d.
   NOT: yıkayıcı altındaki parafilm slayt ve doku bölümünde viskoz G6PD boyama karışımını tutar yıkama arasında bir mühür oluşturur. Çalışmada her doku bölümü G6PD reaksiyon boyama karışımının aynı hacimde alması 0.5 ml hacminde - Bu yapı, bir 0.4 ile iyi verir.
3. 10 dakika boyunca sıcak bir odada 37 ^{o C'de} dondurulmuş doku slaytlar inkübe edin. 37 ° C'de, 45-50 dakika boyunca, her doku kesiti oyuk (slayt başına 2 bölüm) için G6PD boyama reaksiyon karışımı ilave edildi. Sıcak odadan slaytları çıkarın ve dikkatle slaytlar kapalı paslanmaz çelik kuyuları kaldırın.
4. Uzun kenarında Set slaytlar reaksiyon ortamı boşaltmak için izin vermek. 30-60 dakika boyunca 100 mM PB (pH 7.4) içinde Slaytları, doku lekeleme bozmadan dokudan G6PD boyama tepkime karışımını ayırmak üzere. PB tuzları çıkarmak için 5-10 dakika için damıtılmış su içinde slaytlar batırın
5. Add dokuyu Sealdoku üzerine bir damlalık gelen floro-jel ing ve kurutun için ~ 30 dakika bekliyorum. Mutasyona uğramış crypts belirlenmesini bulandırabilir kabarcıkları kaçının.
   Not: kabarcıklar oluşturan, prosedür damıtılmış su içinde ıslatılarak floro-jel çıkarıldıktan sonra tekrar edilebilir. Onlar tuzak hava kabarcıkları eğilimi gibi kapak fişleri kullanmayın.

G6PD Mutant Crypts ve Mutasyon Frekansı 5. belirlenmesi

1. Işık mikroskobu altında G6PD mutant crypts için slaytlar analiz edin.
   NOT: Tam mutant crypt tanımlamak için kullanılan kriterleri: (i) tüm crypt mavi renk yoksun; (ii) crypt dış yapısı (iii) mutant crypt (iv) iki gözlemci bir mutant aynı crypt tanımlamak zorunda bitişik 7 mikron kesitlerinde gözlenen ve oldu, bozulmamış oldu. Bitişik 7 mikron bölümlerde gözlenen mutantlar tek mutant olarak sayılır.
2. Görüntü her G6PD mutant 40x büyütme crypt ve 5.0 megapiksel kamera ile kullanarak görüntüleri kataloggörüntüleme yazılımı.
3. 10x büyütme (Şekil 1C) yüzölçümü en küçük ve görüntünün o ile seviyeden, her fare için bir temsilci bölüm seçerek fare muayene kriptalarının toplam sayısını ölçmek.
   NOT: A level nedeniyle yakınlığı genellikle birden fazla bölümünde crypts mutasyona gösterirler arka arkaya dört 7 mikron bölümleri (Şekil 1D), temsil eder. Seviyeleri kolonun farklı alanlardan crypts görselleştirmek için um 50> ayrılır.
4. Her resim dosyasını açın ve görsel (Şekil 1C kutuları olarak gösterilen) dosyalarını analiz ederek bir seviyede crypts sayısını. Görüntüler dosyalar tek bir dosya olarak düşük 300> 20 olarak crypts gözlenen kriptalarının sayısı değişecektir.
5. Her bir kolon için G6PD mutant crypts için taranmıştır seviye sayısı, her bir fare için seçilen seviyeye (Şekil 1C) gelen kript sayısı çarpın. Örneğin, toplam sayımMutant kriptlerin için tarama 8 seviyeleri ile çarpılarak seçilen seviye başına 1250 kriptler 10.000 crypts toplam sayısını eşittir. İstatistiksel analiz için her kolon için 10.000 crypts az değerlendirin.
6. Her tedavi için MF hesaplamak için filtrelenmiş kript toplam sayısı tüm hayvanların gözlenen mutantların sayısı birleştirin. Tedavi edilmeyen farelerdeki arka kök hücre MF seviyesi <0.1x10 ^-4 önce C57BL / 6 farelerinde bildirilen yakındır (Tablo 1). ^11'dir

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Hayvanlarda kolon kök hücre mutasyonlarını ölçmek için yeteneği kanser indüksiyon mutasyonlar ilişkilendirmek için özel bir yol sağlar. Normal olarak, bu karsinogenezde önemli bir adım onkojenlerde mutasyonlar aktive edilmesi ve / veya tümör süpresör genler mutasyon inaktive içerir varsayılmıştır. Biz 200 ul PBS ya da PBS 200 ul 10 mg / kg AOM ile C57BL / 6 fareler enjekte edildi. AOM bilinen kolon kanserojendir. Kolonlar kök hücre mutasyonları için analiz edildi 90 gün sonra ^5-7....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Genellikle bir bileşimin genotoksik etki DNA değiştirme kabiliyeti tarafından belirlenir. Bu, normal olarak doku izole DNA adduct küresel seviyesinin ölçülmesiyle yapılır. AOM için bu kolonda ^Ø 6 -methylguanine aduktlar miktarının içerecektir. Böyle kök hücre niş gibi özel hücre tipleri, içinde hasar bu yaklaşım bilgileri kullanarak, kaybolur. Adüktlerinin sadece küçük bir alt grubu sonunda sabit mutasyonlara dönüştürülür Ek olarak, bir DNA adükt mutasyon ile aynı değildir...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
reagents
nitroblue tetrazolium
NADP
glucose-6-phosphate
1-methoxy-5-methylphenazinium methyl sulfate
dimethyl formamide
phosphate buffer (pH 7.4
Optimal Cutting Temperature Compound (OCT)
Equipment
light microscope equipped with 5 megapixel camera
cryostat
warm room