Hücre Testi Mitoz Sonu Kromatin dekondenzasyon Eğitim için

Özet

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Özet

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Giriş

Xenopus laevis yumurta ekstraktı, hücre içermeyen tahlil basitliği karmaşık hücresel olayları incelemek için güçlü ve geniş ölçüde uygulanan bir araçtır. Lohka ve Masui ¹ ile ilk bilgi oldukları için yaygın olarak bu kromatin yoğunlaşması ^2, spiralin bir araya gelmesi ^3, çekirdek zarı arıza ⁴ değil, aynı zamanda Nükleositoplazmik taşıma ^{5 ya da} DNA replikasyonu ⁶ gibi mitotik süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Nükleer zarf Reformasyon ve nükleer gözenek kompleksi tekrar monte olarak interphasic çekirdeğinin reform için gerekli mitoz sonunda gerçekleşen olaylar, erken mitotik olaylara nazaran anladığınızı daha az ama benzer Xenopus yumurta özü ⁷ kullanılarak incelenebilir. Biz son zamanlarda mitoz ⁸ yılı sonunda kromatin yoğunluk azaltılmasından okumak için Xenopus yumurta özü dayalı bir tahlil kurduk, bir altı-incelenmiştir süreç i bekliyor olduğunuAyrıntılı karakterizasyonu ts.

Metazoan'da olarak, kromatin yüksek genetik materyalin sadakatle ayrılmasını gerçekleştirmek için, mitotik girişinde yoğunlaştırılır. Kromatin interfaz sırasında gen ifadesi ve DNA replikasyonu için erişilebilir olduğundan emin olmak için, mitoz sonunda de-sıkıştırılmış olması gerekir. Omurgalılarda, kromatin kadar mitotik sıkıştırma genellikle çok daha düşük olan mayalar aksine, S., örneğin, sadece iki kat interfaz ⁹ göre mitoz sırasında daha fazla sıkıştırılmış elli misli cerevisiae ^10. Omurgalı kromatin Dekondenzasyon çoğunlukla yumurta döllenmeden sonra sperm DNA yeniden düzenlenmesi bağlamında ele alınmıştır. Moleküler bir mekanizma, hangi nükleoplasmin, bol oosit proteini, yumurta saklanan histon H2A ve H2B sperm özgü protaminler değiştirir. Bu süreç aynı zamanda Xenopus yumurta özü ^{11, 12} kullanılarak aydınlatılmıştır. Bununla birlikte, sentezlemenükleoplasmin bu sperm özgü protaminler içermeyen oosit ¹³ ve mitotik kromatine sınırlıdır. Dolayısıyla mitoz sonunda yoğunluk azaltılmasından kromatin ⁸ bağımsız nükleoplasmin olduğunu.

In vitro Dekondenzasyon reaksiyonu için biz senkronize HeLa hücrelerinden izole aktif X. laevis yumurta ve kromatin kümelerden oluşan özü kullanır. Bir kalsiyum iyonofor ile yumurta tedavisi döllenme sırasında sperm girişi tarafından oluşturulan oosit içine kalsiyum salınımını taklit eder. Kalsiyum dalgası ilk interfaz ¹⁴ ilerler, mayoz ikinci metafaz tutuklandı hücre döngüsü yeniden başlamasını ve yumurta, tetikler. Bu nedenle, form aktive yumurta hazırlanan yumurta ekstreleri mitotik çıkış / interfaz durumunu temsil ve kromatin yoğunlaşması, nükleer zarf gibi mitotik çıkış için belirli olayları uyarmak için yetkili ve karmaşık reform gözenek. Mitotik ch izolasyonu içinkümeler romatin biz kromozom kümeleri HeLa hücrelerinde mitoz senkronize ve degrade santrifüj ile poliamin içeren tamponlar izole gelen lizis tarafından yayımlanan Gasser & Laemmli ^15, yayınladığı protokol biraz değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmış.

Protokol

HeLa hücrelerinden Mitotik Kromatin Küme İzolasyon

1. Hazırlıklar

1. Hücre Kültürü Çözümleri
   1. DMEM,% 10 fetal buzağı serumu, 100 birim / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 2 mM glutamin eklenerek tam bir Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamında (DMEM) hazırlayın. 2.7 mM KCI, 137 mM NaCI, 10 mM _Na-2 2H ₂ O HPO ₄ ve 10 N NaOH ile 7.4 'e 2 mM KH ₂ deiyonize su içinde PO _4, ve pH'yi ihtiva eden fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
      Not: PBS oda sıcaklığında zamanla 10x stok çözelti olarak muhafaza edilebilir. Kullanmadan önce 1x deiyonize su ile seyreltilir. Bu hücre kültürü içinde kullanılacak tekrar 1x solüsyonu filtre.
   2. DMEM ortamında timidin çözeltisi (uygun bir hücre kültürü) içindeki bir 40 mM stok hazırlayın. DMEM ortamı içinde 90 ml 0.97 g timidin çözülür. 100 ml son ses seviyesini ayarlayın. -20 ° C'de saklayın stok çözeltisiC. (! DİKKAT kimyasal kaputun altında çalışmak, eldiven ve ağız koruma giymek) eritin DMSO içinde bir 5 mg / ml stok çözeltisine nokodazol.
2. Mitotik Kümeleri İzolasyon Çözümleri
   Not: 1.2 tanımlanan tüm çözümler bütün deney boyunca hazırlama / çözme işleminden sonra buz üzerinde tutulması gerekir.
   1. 121 ° C'de 105 dakika süreyle otoklavlanmaktadır deiyonize su. 200 mM (69,6 mg / ml) bir son konsantrasyona kadar otoklavlanmış, deiyonize su içinde spermin tetrahidroklorür çözülür. -20 ° C'de saklayın stok solüsyonu. 200 mM (50,8 mg / ml) bir son konsantrasyona kadar otoklavlanmış, deiyonize su içinde spermidin Trihidroklorür çözülür. -20 ° C'de saklayın stok solüsyonu.
   2. Sıcak, deiyonize su (eldiven ve ağız koruma giymek! DİKKAT kimyasal kaputun altında çalışmak)% 5 (w / v) digitonin hazırlayın. -20 ° C'de filtre ve mağaza alikotları. Fenilmetilsülfonil florid (PMSF) (DİKKAT çözülür! Unde işer, kimyasal kapağı,% 100 etanol içinde 200 mM (35 mg / ml) bir son konsantrasyon elde etmek eldiven ve ağız koruma) kullanın. -20 ° C'de saklayın stok solüsyonu.
   3. 1 M (154 mg / ml) bir son konsantrasyona kadar deiyonize su ile ditiotreitol (DTT) içinde çözündürülür (DİKKAT eldiven, aşınma, kimyasal başlık altında çalışma). -20 ° C'de filtre ve mağaza stok çözeltisi.
   4. (-) - 4- (2-Aminoethly benzensulfonylfluoride) 10 mg / ml AEBSF çözülerek (! Eldiven giyin, DİKKAT kimyasal kaputun altında çalışmak) 100 kat proteaz inhibitörü karışımı hazırlayın, 0.2 mg / ml löpeptin, 0.1 mg / ml pepstatin iyonu giderilmiş su içinde 0.2 mg / ml aprotinin. -20 ° C'de saklayın stok solüsyonu.
   5. Tampon bir 10x stok çözelti hazırlayın bir 150 mM Tris-Cl (pH 7.4), 800 mM KCI, 20 mM EDTA,-KOH (pH 7.4), 2 mM Spermin tetrahidroklorür ve 5 mM spermidin Trihidroklorür ihtiva etmektedir. Mağaza tampon A eklenmelidir spermin tetrahidroklorid ve spermidin trihidroklorit olmayan 4 ° C,taze hemen önce kullanın.
      NOT: EDTA, sadece yüksek konsantre EDTA-KOH stok solüsyonu (önerilen 0.5 M) hazırlamak onu çözmek için sadece 8 üzerinde pH 5 N KOH eklemek için, bu nedenle, 8 daha yüksek pH'larda erir. Daha sonra pH 7.4 aşağı titre.
   6. 100 mM Tris-HCl (pH 7.4), 400 mM KCI, 400 mM EDTA,-KOH (pH 7.4) ve 5 mM spermidin trihidroklorid ihtiva zamanda tampon 20x stok çözelti hazırlayın. Tampon olarak tampon A ile aynı koşullar altında depolanabilir
      Not: Sadece izolasyondan önce taze I ila IV (aşağıdaki adımlarda bakınız) içeren çözeltiler, gliserol gradyanı olmayan diyaliz polivinilpirolidon (PVP) ile kaplanmış silika parçacıkları (15 ila 30 nm çapında) ihtiva eden koloidal silis parçacıkları çözümler hazırlayın Prosedür (PMSF, sulu çözeltiler içinde kararsız ve digitonin buz üzerinde uzun süreli depolama üzerine çökeltilmesi eğilimi PMSF ve digitonin kullanımdan önce, doğrudan eklenmesi gerekmiştir).
   7. 0.5x tampon A ekleyerek çözümün I 100 ml hazırlayın,1 mM DTT, 1: otoklavlanmış, deiyonize su içine proteaz inhibitörü karışımı ve 0.1 mM PMSF, 100. 1x tamponu A eklenerek (hücre parçalanması) çözeltisi II 50 ml hazırlayın, 1 mM DTT, 1: proteaz inhibitörü karışımı, 100, 0.1 mM PMSF, otoklava, deiyonize su içine% 0.1 digitonin ve% 10 gliserol.
   8. Otoklavlanmış, deiyonize su içinde, proteaz inhibitörü karışımı, 100, 0.1 mM PMSF ve% 0.05 digitonin: 200 çözeltisi III içeren 0.25X tampon A ml, 1 mM DTT, 1 hazırlayın. 1x tamponu içeren çözelti, IV 40 ml hazırlayın 1 mM DTT, 1, de: proteaz inhibitörü karışımı, 100, 0.1 mM PMSF ve otoklavlanmış deiyonize su içinde% 0.1 digitonin.
   9. Çözelti I'e% 25 gliserol ve% 0.1 digitonin ekleyerek gliserol gradyan çözeltisi 120 ml hazırlayın
   10. Olmayan diyaliz polivinilpirolidon (PVP),% 15 gliserol, 2 mM s ile kaplanmış bir süspansiyonu içeren silika parçacıklarının (15 ila 30 nm çapında) 60% v / v (hacim başına hacim) ihtiva eden koloidal silis parçacıkları çözeltisi 150 ml hazırlayınpermidine trihidroklorür ve çözelti IV 0,8 mM Spermin tetrahidroklorür.
   11. Proteaz inhibitörü karışımı 100,% 0.3 BSA ve% 30 gliserol: 250 mM sakaroz, 15 mM Hepes (pH 7.4), 0.5 mM spermidin trihidroklorid, 0.2 mM spermin tetrahidroklorür, 1 ihtiva eden, küme depolama tamponu hazırlayın. Küme depolama tamponu -20 ° C'de muhafaza edilebilir.
   12. % 50 gliserol, (eldiven giymek, kimyasal kaputun altında çalışmak! DİKKAT)% 10 formaldehit içeren kabak düzeltme çözeltisi hazırlayın Mark'ın Modifiye Zil tampon iki katına (KKK 4.5 bkz.) Ve 0.2 ug / ml DAPI (DİKKAT! Eldiven giyin). Işık korumalı reaksiyon tüpleri 4 ° C'de saklayın. Deney bu kabak düzeltme tarifi kullanmak için bu çok önemli değil, alternatif tarifler de çalışacaktır.

Hücre 2. Senkronizasyon

1. 1. Gün: Beş 75 cm ² (250 mi) tohum HeLa hücreleri medya şişeleri ve% 5 C 37 ° C 'de inkübe_O 2.
   NOT: Bu kromatin küme izolasyon gününde yaklaşık 18 ^x 10 6 hücre içinde verecektir.
2. 2. günde, hücreler en az% 50 konfluent olduğunda (yaklaşık yüzeyin yarı hücreleri ile kaplıdır ve büyümek için hücreler için hala yer vardır), nihai 2 mM (timidin blok) konsantrasyonu ve kültür hücreleri için timidin ekleme _% 5 CO2 içinde 37 ° C'de 24 saat.
   NOT: Bu G1 / S fazı sınırda hücreleri tutuklayacak.
3. Gün 3: aspire orta timidin içeren ve steril PBS ekleyin. Steril PBS ile narin durulama hücreleri yıkayın. PBS aspire ve yavaşça _CO2 G1 / S-fazı bloktan serbest bırakmak için,% 5, 37 ° C'de 3 saat 4 için taze, sıcak tam bir DMEM ortamı ve kültür hücreleri, 15-20 mi ekleyin.
4. Gün 3 (devam) üzerinde: G1 / S-fazı bloktan hücreleri serbest bıraktıktan sonra, 100 ng / ml'lik nihai bir konsantrasyona kadar nokodazol ekleyin. 98 stok çözeltisi (5 mg / ml) 2 ul ekleyerek nokodazolun seyreltinTaze DMEM ortamı ul ve hücre kültürünün her bir ml için nokodazol seyreltilmiş 1 ul ekle. _% 5 CO2 içinde 37 ° C 'de yaklaşık 12 saat boyunca kültür hücreleri. Bu mitoz hücrelerin engeller.

3. Mitotik Kümeleri İzolasyon

1. 4. günde: mitotik kümeleri izole edin. Hücrelerin büyük çoğunluğu mitotik ise parlak bir alan mikroskobu kullanarak, kontrol edin. Hücrelerin% 50'den az mitotik beklemek ise daha fazla hücre mitoz ulaşana kadar. Balonuna (ya da hafifçe pipet ile püskürtülerek) tarafında şiddetle dokunarak mitotik hücrelerin toplayın, bu kalan mitotik hücreleri ayırmak olacaktır. 50 ml konik santrifüj tüpleri hücre süspansiyonu aktarın.
   Not: Mitotik hücreleri, düz ve sıkı bir şekilde şişeye takılı olmayan diğer hücre aşamada hücreler, farklı olarak, yuvarlak hale gelir ve kolayca (hemen tripsinizasyon sonra hücrelerin gibi), bir şişe tabanından çıkarılabilir.
2. (10 dakika için 1500 xg'de tüpler iplik 4 mitoz hücreler hasat76 ° C veya RT) ve daha sonra süpernatantın çıkarılmasıyla. Bir 50 ml lik konik santrifüj tüpü içine hücre 8 ml PBS içinde pelet, havuz yeniden süspanse edin, tamamen PBS ile tüp girip 1500 x g'de 10 dakika boyunca tekrar döndürün. Toplamda bu yıkama prosedürü üç kez tekrarlayın.
3. Şu andan itibaren soğuk çözümleri ile buz üzerinde tüm adımları uygulayın. Şiddetle soğuk çözeltiye II 37 ml pelletini. Mitotik kümeleri sitoplazmik malzemenin çıkana kadar sıkı bir havan tokmağı ile douncing ile buz üzerinde bir 25 ml'lik bir pipet ile lize hücreler kullanılarak soğuk 40 ml'lik bir cam cam homojenizatör süspansiyon aktarın. Strok sayısı digitonin hisse senetleri bağlıdır ve 3 ila 20 kat arasında değişebilir.
   NOT: Homojenizasyon oldukça dinç olabilir, ama neredeyse tüm mitotik hücreler parçalanır ve kümeleri (3.4 bakınız) sitoplazmik malzemenin serbest olduğu görülmektedir tamamlandığında düşünülmelidir.
4. Tripan mavisi ile 2 ve MICR tarafından kontrol ediniz: vuruşları bir çift hücre süspansiyonu 1 5-10 ul karıştırın sonraBir Neubauer bölmesinde oscopy. Hücreler parçalanır kromatin mavi ve hücre zarlarının serbest (: Olası sitoplazmik kalıntıları mavi lekeli kromatine etrafında birikir olacak ve ayırt kolay olacak NOT) lekeli.
   NOT: Mitotik hücreler interphasic hücreler önce parçalanmayabilir ama yine de interphasic çekirdekleri ve karıştırılmış kromatinli kirlenmesini önlemek amacıyla homojenizasyon abartmak için dikkatli olacaktır.
5. Hemen 28.8 x 107.0 mm, bu önerilir beş polikarbonat santrifüj tüpleri (in (gliserol gradyan çözeltisi, her 19.5 mi ile kaplanmış alt% 60 kolloidal silis parçacıkları çözeltisi 5 ml), soğuk aşama gradyanları üzerinde bütün hücre lizatı tabaka 10 ml'lik pipet kullanarak) onları soğumasını önce buz üzerinde tüpler yerleştirin. Uzun bir süre için çözelti II hücreleri devam etme, böylece (yıkama adımları sırasında, örneğin), daha önce tüpleri ve gradyanı hazırlanması tavsiye edilmektedir.
6. 30 mil için geçişlerini santrifüjn sabit açılı rotor, 4 ° C'de 1000 x g'de.
   NOT: Çekirdekler, çözünen hücreler ve kümeler gliserol arayüzü ve kolloidal silika partikülleri katmanları bir araya kurtarıldı.
7. Bir pipet kullanarak interfaz üstünde sıvı çıkarın ve soğuk homojenleştirici gerisini aktarın. Sıkı havan ile 3-15 vuruş (yine digitonin stok bağlı) tarafından yeniden homojenize karışımı agrega ortadan kaldırmak ve kümelerden hücre iskeleti tüyleri temizleyin. Inmelerin her çift sonra homojenizasyon verimliliğini kontrol edin. DAPI ile desteklenmiş kabak düzeltmenin 1 ul örnek 1 ul karıştırın ve floresan mikroskop altında incelenmesi.
   NOT: vuruş sayısı önemlidir küme varlığı parçalanmış kromatin ve çekirdekler enkaz homojenizasyon çok güçlü olduğuna işaret ederken vuruş sayısı yetersiz olduğu, araçları toplar.
8. (28.8 x dört yeni polikarbonat santrifüj tüpleri arasında çözüm dağıtın107,0 mm) (yakl. 10 mL tüp başına çözelti) ve tümüyle 60% koloidal silis parçacıkları çözelti ile doldurmak (yakl. 30 mL tüp başına kolloidal silis parçacıkları çözeltisi).
   NOT: degrade çok fazla sitoplazmik enkaz varsa kümeler kolaylıkla tuzağa edilebilir çünkü koloidal silis parçacıkları degrade aşırı yüklemekten kaçının.
9. Sabit açılı rotor, 4 ° C'de 45.440 x g'de 30 dakika süre ile 3000 x g'de 5 dakika boyunca spin.
   NOT: Daha önce olduğu gibi, interphasic çekirdekler (homojenizasyon sitoplazmik enkaz çekirdekleri serbest bırakan çok ağır bitmiş değil ise) ancak kümeler genellikle gevşek top gibi, tüpün dibinden yaklaşık 1,5 cm birikecek degrade girmesini tutulacaktır.
10. Bir pipet kullanarak kümeler üzerinde sıvı çıkarın, tekrar süspansiyon iyi bir tüp içine kalan havuz ve iki polikarbonat santrifüj tüpleri (28.8 x 107.0 mm) yeniden dağıtma. Her bir tüp içinde çözelti III 4 ve iyice karıştırın: Küme süspansiyon 1 seyreltin. Mark incie Alanı pelet olabilir ve sabit açılı rotor, 4 ° C 'de 15 dakika süre ile 1000 xg dönecektir edildi.
11. Çözüm III pelet yeniden süspanse biri 50 ml konik santrifüj tüpüne havuzu ve Çözüm III ile doldurun. Yaklaşık 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin. Yüksek hızda santrifüj etmeyin - kümelerin geri dönüşümsüz toplanmasına neden olabilir.
12. 1.5 veya 2 ml reaksiyon tüpleri Çözüm III ile tekrar yıkayın (pelet tekrar süspansiyon ve tamamen tüpleri doldurmak) 300 x g ve santrifüj. Bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatantı. Dikkatle 250 ul küme depolama tamponu içinde süspanse pelet (birkaç topaklar birlikte tüm 250 ul kullanmak ve onları havuz varsa). Tripan mavisi ile 2 ve Neubauer odasında saymak: numunenin 1 5-10 ul sulandırmak. Uygulanabilir seyreltik fazla ise / ml 500 kümeleri yaklaşık konsantrasyon elde edilmiştir.
13. Yapmak için 100 mikron hücre süzgecinden süspansiyonu itin küme toplanmasını kaldırmak için eminUygun olmayan yeniden süspansiyon kaynaklanan s. Kümeler -80 ° C ay depolanabilir. Birden soğutulmasından uygun alikotları yapmak ve sıvı azot içinde donma oturtun önlemek için.

Interphasic Xenopus için Tampon 4. Hazırlıklar Yumurta Özü laevis

NOT: Xenopus kurbağa muhafaza ve (1998 yılında onaylanan AB) Deneysel ve diğer amaçlar için kullanılan omurgalı hayvanların korunması konusunda Avrupa konseyi Sözleşme'nin tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun tedavi ve Alman hukuku ile ilgili olan laevis Araştırma omurgalı hayvanların kullanımı.

1. DTT ve 1.2.3 ve 1.2.4 göre olan bir 100-kat proteaz inhibitörü karışımı hazırlayın. -20 ° C'de son (tavsiye edilen 10 veya 20 ul), 10 mg / ml DMSO içinde, kısım konsantrasyonu ve saklamak için sitokalasin B çözülür.
2. (Etanol, kısım içinde 20 mg / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar 500 ul sikloheksimid çözülür-20 ° C'de önerilir) ve mağaza. -20 ° C'de etanol, tablet ve mağaza 2 mg / ml'lik bir son konsantrasyona kadar, kalsiyum iyonofor A23187 eritin.
   NOT: PI, DTT, cytochalasin B, sikloheksimid ve A23187 Tekrar tekrar dondurulup çözülmüş olabilir.
3. _MM CaCl2, 2 mM EDTA ve 100 mM Hepes, 5 N KOH ile 8.0'a pH ayarlamak 40 2 M NaCl, 40 mM KCI, 20 mM _MgCI2 içeren 20x Mark Modifiye Ringers tamponu (KKK) hazırlayın.
   NOT: 20x MMR oda sıcaklığında uzun süre boyunca muhafaza edilebilir. 1x enjekte kurbağa başına MMR ve yıkama aşamaları için ek 5-10 litre interphasic yumurta ekstresi 1 L bir hazırlama için, yumurta miktarlanna bağlı olarak gereklidir. 5 N KOH ile 8.0'a 1x MMR pH yeniden ayarlanır. 1x MMR O kurbağa tutmaya hazırlanan / N oda sıcaklığında olmalıdır 1 x. Kullanılıncaya kadar özü hazırlamak için hazırlanan 1x MMR ancak 1x MMR gerçekten soğuk olduğu deney için önemli değildir, soğuk tutulmalıdır.
4. Suc 1 L hazırlayın250 mM sakaroz, 50 mM KCI, 2.5 mM _MgCI2 ve 10 mM Hepes pH 7.5 ihtiva eden bir tampon yükseldi. Sakaroz tamponu, steril su kullanılarak bir gün önce hazırlanmalı ve 4 ° C 'de tutulması gerekmektedir.
5. 0.25X MMR içinde% 2 L-sistein çözülmesiyle, deney sabahı taze dejellying çözeltisi hazırlayın. 5 N KOH ile pH 7.8'e ayarlayın. Kullanılıncaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.

5. Protocolfor Interphasic Xenopu s laevis Yumurta Özü

1. 3-10 gün deney (5 ml şırınga, 27 G ¾ 'iğneler) önce her kurbağa dorsal lenf kese içine 120 IE gebe kısrak serum gonadotropin (PMSG) enjekte edilir.
   NOT: Bu enjeksiyon ovulasyon neden olacaktır. Tek kurbağa bırakır yumurta miktarı çok değişir. İyi döşeme kurbağa ham ekstraktı mi 3,5 kadar karşılık gelen de-jellynated sonra en fazla 7 ml bir hacim işgal eden yumurta üretebilir. Ancak, bazı kurbağaların la lay ya da olmaz diye düşünebilirsinizy kötü yumurta.
2. Deney (5 ml şırıngalar, 27G ¾ 'iğneler) önce kurbağa başına 500 IE insan koryonik gonadotropin (hCG) akşam enjekte edilir. Bu yumurtaların serbest bırakılmasını neden olacaktır. 1,2 l 1x MMR (pH 8) ihtiva eden tek tek tanklar 18 ° C'de 13-17 saat boyunca kurbağa tutun.
3. 600-1,000 ml cam bardak içine dökerek yumurta toplamak.
   NOT: boyutu benzer ve açıkça karanlık ve hafif renkli yarısı pigmentli ayrı ayrı serilir yumurta, sadece iyi toplu alın. Dizeleri ya da göz kabarık ve beyaz oluşturan yumurta almayın. Bunlar plastik Pasteur pipeti kullanarak tüm işlem boyunca dizildi gerekmektedir. Kötü karşı iyi yumurta ayrıntılı bilgi için Gillespie ve ark bakın. ⁶
4. Yumurta yerleşti var süpernatan ayrıldı ve daha sonra taze tampon ile beher dolumu ile, yoğun 1x MMR ile yaklaşık 4 kat, yumurta yıkayın.
   NOT:bunlar dejellynated ve yıkama tamponu ile doğrudan yumurta uygulanabilir önce yumurtaları stabildir.
5. % 2 sistein çözeltisi içinde inkübe edilerek yumurta Dejellynate. Tampon boşaltılarak ve dikkatle taze tampon ile beher doldurarak bir kez 2-4 dakika sonra tampon değiştirin. Tam Considerdejellying yumurta hacmi önemli ölçüde azalır ve yumurta daha yoğun hale ne zaman.
   NOT: dejellying yaklaşık 5-7 dk ihtiyacı vardır ve ne zaman görünür ama 10 dakika sonra en geç durdurulmalıdır.
6. Boşaltılarak ve tampon süpernatant dolumu ile 1x MMR ile yıkayın yumurta yaklaşık 4 kat.
   NOT: Yumurta dolayısıyla yıkama adımlar daha dikkatli yapılması gereken, dejellynated sonra daha kırılgan ve. MMR yerine yumurta üzerine yerine doğrudan beher duvarına durulanmalıdır.
7. Kalsiyum iyonofor (etanol içinde 2 mg / ml) içinde 8 ul ekleyerek mi 1x MMR 100 yumurta etkinleştirir. Hayvan kap daralma olacak zaman aktivasyon durdurunGörünür ya da 10 dakika sonra geliyor.
   Not: Hayvan kap daralma yumurtanın Siyah yarım sıkıştırılmasıyla tespit edilebilir.
8. Boşaltılarak ve tampon süpernatant dolumu ile 1x MMR ile dikkatlice 4 kez yıkayın.
9. Oda sıcaklığında 1 x MMR 20 dakika boyunca kuluçkaya.
10. Kuluçka süresi boyunca santrifüj tüpleri hazırlayın: Sıra 50 ul sükroz tamponu, 50 ul 100 kat proteaz inhibitörü karışımı, 5 ul 1 M DTT, 12,5 ul sikloheksimid ve 2.5 ul Cytochalasin B (özellikle siklin B, çeviri önlemek için) (to 5 ml santrifüj tüpleri (13 x 51 mm) aktin polimerizasyonu) önler. Alternatif olarak, yumurta fazla 30 ml, 14 ml tüpler (14 x 95 mm) 2.4 kat bu durumda artış hacimlerde, kullanılabilir.
11. (Cam beher tortusundan ayırma ve dolum tamponu), soğuk sakaroz tamponu ile iki kez yumurta yıkayın ve geniş açıklığı (dar ucuna kesilmiş) ile plastik Pasteur pipeti kullanarak santrifüj tüpleri içine aktarabilirsiniz.
12. Paket130 x g'de 1 dakika boyunca iplik yumurta. (Sırasıyla, 50 ml konik santrifüj tüpleri içinde 14 ml tüpler koymak) bu amaç için 15 ml konik santrifüj tüpleri içinde tüpler koyun. Ekstrenin seyreltme önlemek için mümkün olduğu kadar çok amacı tampon kaldırmaktır. Santrifüj işleminden sonra, bir plastik Pasteur pipeti kullanarak tampon fazlalığını ortadan kaldırmak ve sonunda üstüne daha fazla yumurta doldurun.
13. 6 x 5 ml Spin 4 ° C'de 21.000 x g'de 20 dakika boyunca rotor salıncak.
14. Alt üst sarı sarısı ve koyu kırık yumurta enkaz arasında, 16 G 1 ½ '' iğne ile 5 ml şırınga kullanarak düşük hız özü çıkarın. Bu amaç için, sadece alt kırık yumurta enkaz katman üzerinde santrifüj tüpünün duvarı boyunca bir şırınga iğnesi itin. Iğne ile iterek zaman dirence karşı tüpü tutun.
    NOT: dolu 5 mi santrifüj borusu özü mi 1.8-2.5 arasında verir.
15. Ekstresi 1 ml başına 10 ul 100 kat proteaz inhibitörü karışımı, 1 ul1 M DTT, 2,5 ul sikloheksimid (20 mg / ml) ve 0.5 ul Cytochalasin B (10 mg / ml). Buz üzerinde özü tutun.
    Not: ekstresi, ya deney için direkt olarak kullanılabilir veya aliquoted olabilir, dondurulmuş ve birkaç ay boyunca sıvı azot içinde saklanır ek. Özü Dondurucu faaliyete azalacaktır. Bağışıklık sistemindeki gibi hassas deneyler için oldukça derhal taze özü kullanılması tavsiye edilir.

Kromatin dekondenzasyon İn Vitro Sulandırma için Tamponlar 6. hazırlanması

1. 25 mM ATP, 25 mM GTP, 127.5 mg / ml kreatin fosfat ve 2.5 mg / 250 mM sakaroz, 1.2 mM Hepes, 5,9 mM KCI ve 0.3 mM _MgCI2 ihtiva eden bir tampon ml kreatin kinaz ihtiva eden bir enerji karışımı stok çözelti hazırlayın. -80 ° C kısım ve mağaza. Dondurursam yok çözdürme sonrası taze kullanın.
2. Iyonu giderilmiş su içinde 0.2 g / ml glikojen çözülür. -20 ° C'de saklayın. Nihai bir konsantrasyona kadar 6-dimetil aminopurin (DMAP) çözündürünDMSO içinde 0.25 M. -20 ° C'de kısım ve mağaza. Dondurursam yok çözdürme sonrası taze kullanın.
3. % 30, 4 ° C'de, PBS, süzün ve mağaza (w / v) sakaroz hazırlayın. 80 mM BORU pH 6.8, 1 _mM MgCl2, 150 mM sukroz ve% 4 paraformaldehid (PFA) (DİKKAT!, Kimyasal başlık altında çalışmak eldiven ve ağız koruma giymek) içeren% 4 VikiFix çözüm hazırlayın.
   NOT: PFA nedenle çözünmesi zordur aşağıdaki gibi bunu yapmak için tavsiye edilir: 1 lt için 24.2 g BORULARI ve ayrı kap içinde 40 g PFA çözülür Viki-Fix, sıcak (neredeyse kaynar) deiyonize su hem de. Her ikisi de 10 N NaOH eklenmesiyle çözülür ama çok fazla eklemek için dikkatli olacaktır. 51,4 g sükroz ve PFA çözeltisine 1 ml 1 M _MgCI2 ekleyin. Diğer karışıma BORULARI çözüm ekleyin. 1 l nihai hacme kadar doldurun ve NaOH eklenerek nötr pH ayarlamak.
4. 10 mg su içinde / ml 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (DİKKAT! Eldivenler kullanın) içinde çözülür. In saklayın-20 ° C de karanlık.

Kromatin dekondenzasyon İn Vitro Sulandırma 7. Protokol

1. Sabit açı 386.000 xg'de 12 dakika boyunca 20 x 0.2 ml düşük hızda interphasic özü Spin veya 10 x 2.0 ml rotor içinde 355 000 xg'de.
2. Yavaşça bir vakum pompası ya da pipet kullanarak üst lipid tabakasını kaldırmak ve süpernatant almak alt tabaka membran kirlenmesini önlemek (bundan sonra yüksek hızlı özü denir) ve pelet atın.
   NOT: Bu iki kez özü dönmeye veya santrifüjleme öncesi sukroz tamponu ile hacmi 20 ile% özü seyreltilmesi önerilir mümkün membran kirlenmesini azaltmak için kullanılır. Ancak, seyreltme ve ek santrifüj adımlar özü aktivitesini azaltabilir.
3. Pipet, 1.5 ml reaksiyon tüpüne yüksek hızlı ekstresi 18 ul, glikojen ul, (miktarı biraz kromatin stok konsantrasyona göre değiştirilebilen bir) 0.5 ul 0.5 mitotik küme 0,7 ulEnerji karması ve 0.3 ul DMAP. Kromatin decondensing kromatin kesme önlemek için ilave olarak en kısa reaksiyon karışımı geniş ağızlı ipuçlarını kullanın.
   Not: Reaksiyon membranlar (bakınız Şekil 3) varlığında ya da yokluğunda gerçekleştirilebilir. Membran mevcudiyetinde kromatin decondense için Eisenhardt ve arkadaşları tarafından tarif edilen protokole göre hazırlandı yüzen membran 2 ul ekleyin. ¹⁶
4. 20 ° C'de (Dekondenzasyon işleminin daha önceki zaman noktalarında çalışma ya da daha az) en fazla 2 saat boyunca reaksiyon karışımını inkübe edin.
5. Buz üzerinde 20-30 dakika boyunca% 0.5 glutaraldehit ve 0.1 mg / ml DAPI ve inkübasyon ihtiva eden 0.5 mi Viki-Fix soğuk buz eklenerek örneği sabitleyin.
   NOT: Numuneler daha Immünofloresan için işlenecektir Eğer bu genellikle antikor boyama engel olarak, tespit glutaraldehit olmadan yapılmalıdır. Sadece DAPI boyama analiz edilecektir Ancak eğer fazlalığı eklenmesiaraldehyde güzel bir kromatin yapısını koruyacaktır.
6. Kromatine lamelleri afinitesini geliştirmek için poli-L-lizin çözeltisi ile 5 dakika boyunca yuvarlak lamelleri (çap 12 mm) inkübe edin. Sonradan filtre kağıdı üzerinde lamelleri kurulayın.
7. Santrifüj tüpünün alt üst kaplanmış site ile lamelleri koyarak düz tabanlı santrifüj tüpü (6 mi, 16/55 mm) bir araya getirin. % 30 sakaroz yastık 800 ul ekleyin ve üstüne sabit numune tabaka.
8. 4 ° C'de 2500 x g'de 15 dakika boyunca spin.
   NOT: düz taban santrifüj tüpleri 15 ml konik santrifüj tüpleri benimseyen rotor uygun.
9. Daha sonra 16 G 1 ½ 'şırınga iğnesi ile dikkatlice santrifüj tüpünün dibine alay tüplerden lamelleri kaldırmak, süpernatant süzün. İğne yaklaşık 3 yapışıyor ve böylece bu amaçla bant iğnenin kapağı ve iğne birlikte diplerinde kendisi ve kapağın ön ucunu kestimm dışarı. Lamel bir sitede iğne ile kaldırıldığı zaman, lamel kaldırmak için cımbız kullanın.
10. , Deiyonize su içinde daldırılması yolu ile hızlı bir şekilde lamel yıkayın bir filtre kağıdı olan kenarına temas ederek yavaşça kurur ve montaj ortamı bir damla mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Kuru, oje ile mühür ve karanlıkta saklayın.
    Not: glutaraldehit olmadan sabit Örnekler 24 oyuklu bir plaka içerisinde, PBS içinde depolanır ve immünofloresan boyama için daha kullanılabilir. Birkaç gün saklandığı taktirde,% 0.05 sodyum azid (DİKKAT! Eldiven giymek) ekleyin bakteriler ile kirlenmesini önlemek için PBS.
11. DAPI sinyali floresan mikroskobu ile örnekleri analiz (örneğin, bir 405 nm lazer ile konfokal mikroskop kullanılarak).

İn Vitro Sulandırılmış Kromatin dekondenzasyon Örneklerinin İmmünofloresan Boyama için Tampon 8. Hazırlık

1. 1.1.1 göre PBS hazırlayın. Bir yüzgeç NH ₄ Cl çözülürPBS içinde 50 mM al konsantrasyonu. 4 ° C 'de bu çözüm tutun. PBS içinde 5 ug / ml DAPI (yeni hazırlama) içinde çözülür. PBS,% 0.1 Triton X-100 ekleyin. 4 ° C'de tutun. PBS +% 0.1 Triton X-100 içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) seyreltilmesi ile kullanımdan önce taze tampon engelleme hazırlayın.

İn Vitro Sulandırılmış Kromatin dekondenzasyon Örneklerinin İmmünofloresan Boyama 9. Protokol

Not:., Aksi belirtilmediği sürece lamelleri her biri şu inkubasyon, oyuk başına en az 250 ul çözeltisi ile 24-çukurlu plaka içinde yapılır in vitro yoğunluğu azaltılmış kromatin örnekleri ekleme veya çıkarma çözüm bu nedenle dikkatli sabit hücrelere göre daha hassastır. Bu açısal kesim plastik Pasteur pipetler kullanılması tavsiye edilir. Yıkama adımları ve sekonder antikor inkübasyon için 100 rpm geçmeyen hızlı hareket, sallanan ya platformu dönen oda sıcaklığında plaka yerleştirin.

1. Lamel inkübe ederek örnekleri gidermek5 dakika boyunca PBS içinde 1 ml _NH4CI ile s. 1 ml, en az 30 dakika boyunca bloklama tamponu ile inkübe edilerek blok örnekleri.
2. Birincil antikor ile inkübasyon için bir rutubet gözünün birleştirin: ıslak doku üstüne baş aşağı kapatılabilir bir kutunun alt ve 24 oyuklu plaka kapağı üzerinde ıslak bir doku koyun. Kapağına parafilm yerleştirin ve parafilm ile ilgili örnek başına antikor çözeltisi 70 ul ekle. Antikor çözümü için, antiserum veya afinite saflaştırılmış antikorlar 1 sulandırmak: 100 tampon engelleme.
3. Ters antikor çözeltisi üzerine lamelleri ve 1 ila 2 saat boyunca inkübe. Lütfen Örnek tarafı yukarı bakacak ile 24 oyuklu plaka lamelleri PBS içinde 1 ml% 0.1 Triton X-100 ile 10 dakika boyunca numuneleri üç kez yıkayın.
4. Üretici tarafından tavsiye edilen bir konsantrasyona kadar tampon içerisinde seyreltilmiş 250 bloke ul ikincil floresan etiketli antikor, oda sıcaklığında 1 saat süre ile inkübe lamelleri. Işıktan koruyunuz. Thr yıkayınPBS içinde 1 ml% 0.1 Triton X-100 ile 10 dakika boyunca ee süreleri.
5. 5 ug 1 ml / ml DAPI PBS içinde 10 dakika süreyle inkübe edin. PBS içinde 1 ml% 0.1 Triton X-100 ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
6. , Deiyonize su içinde daldırılması yolu ile hızlı bir şekilde lamel yıkayın bir filtre kağıdı olan kenarına temas ederek yavaşça kurur ve montaj ortamı olarak bir damla üstünde bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Kuru, oje ile mühür ve kullanılıncaya kadar karanlıkta 4 ° C'de tutun. Floresan mikroskop ile örnekleri analiz.

Sonuçlar

Dekondenzasyon reaksiyon zamanı bağımlılığı

Şekil 1 Dekondenzasyon deneyinin tipik bir zaman sürecini gösterir. Reaksiyonun başlangıcında görünen kromozomların küme decondenses ve tek, yuvarlak ve pürüzsüz çekirdek içine birleştirir. Yumurta özü sukroz ile ikame edildiğinde kromozom kümesi Dekondenzasyon aktivitesi yumurta ekstre içinde mevcut olduğunu göstermektedir ki, yoğunlaştırılmış kalır tampon.

Kromatin...

Tartışmalar

Xenopus Yumurta ekstreleri sadakatle in vitro hücresel süreçleri yeniden üretmek için çok yararlı bir araç olduğunu laevis ve bu sistem başarıyla hücre döngüsü ve hücre bölünmesi olayları ^{2, 3,5,6,17} karakterizasyonu kullanılmıştır. Nedeniyle Oogenezinde sırasında yumurta münzevi nükleer parçaların büyük mağazalar, yumurta ekstreleri hücresel bileşenleri mükemmel bir kaynağıdır. Memeli doku hücre hatları veya genetik manipülasyon R...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1