A Free Cell Ensaio para estudar Chromatin descondensação no fim da mitose

Resumo

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Resumo

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Introdução

Xenopus laevis extrato de ovo é uma ferramenta poderosa e amplamente aplicada para estudar eventos celulares complicados na simplicidade de um ensaio livre de células. Desde a sua primeira descrição por Lohka & Masui ¹ eles têm sido amplamente utilizados para estudar a mitose, como condensação da cromatina ^2, conjunto do eixo ^3, desagregação envelope nuclear ^{4, mas} também o transporte nucleocitoplasmático ⁵ ou ⁶ DNA replicação. Os eventos que ocorrem no final da mitose, necessários para a reforma do núcleo interphasic tais como reforma envelope nuclear e poro nuclear remontagem complexo são muito menos entendido, em comparação aos eventos mitóticas iniciais, mas pode ser estudada de forma semelhante usando Xenopus extrato do ovo ^7. Temos recentemente estabelecido um ensaio baseado no extracto de ovo de Xenopus para estudar descondensação da cromatina no final da mitose ^8, um processo investigado sob que aguarda-its caracterização detalhada.

Em metazoários, é altamente cromatina condensada a entrada mitótico, a fim de executar fielmente a segregação do material genético. Para assegurar que a cromatina é acessível para a expressão de genes e replicação do ADN durante a interfase, ele precisa ser de-compactado no final da mitose. Nos vertebrados, a cromatina é até cinquenta vezes mais compactada durante a mitose em comparação com interfase ^9, em contraste com leveduras, onde a compactação mitótica é normalmente muito inferior, por exemplo, apenas duas vezes em S. cerevisiae ^10. Vertebrados descondensação da cromatina foi estudado principalmente no contexto da reorganização de ADN de esperma após a fertilização do ovo. Um mecanismo molecular, em que nucleoplasmin, uma proteína de oócito abundante, troca-protaminas específico para histonas H2A esperma e H2B armazenados no ovo. Este processo também foi elucidado utilizando extracto de ovo de Xenopus ^{11, 12.} No entanto, a expressãode nucleoplasmin está limitado a ¹³ oócitos e cromatina mitótica não contém estas protaminas específicos de esperma. Portanto descondensação da cromatina no final da mitose é nucleoplasmin ⁸ independente.

Para a reacção in vitro descondensação empregamos extracto gerado a partir de ovos activados X. laevis e aglomerados de cromatina isoladas a partir de células HeLa sincronizados. O tratamento de ovos com um ionóforo de cálcio imita a libertação de cálcio para o oócito gerado por entrada de esperma durante a fertilização. A onda de cálcio desencadeia a retomada do ciclo celular e do ovo, preso na segunda metáfase da meiose, progride para a primeira interfase ^14. Portanto, extratos de ovos preparados forma ativada ovos representar o estado de saída / interfase mitótico e são competentes para induzir a eventos específicos para a saída mitótico como descondensação cromatina, envelope nuclear e pore reforma complexa. Para o isolamento de ch mitóticoromatin clusters de nós usou uma versão ligeiramente modificada do protocolo publicado pela Gasser e Laemmli ^15, onde os conjuntos de cromossomos são liberados por lise de células HeLa sincronizados na mitose e isoladas em poliaminas contendo buffers por centrifugação de gradiente.

Protocolo

Mitótico Chromatin Isolamento Cluster a partir de células HeLa

1. Preparativos

1. Soluções de cultura de células
   1. Prepare meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) por adição de 10% de soro fetal de vitelo, 100 unidades / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina e glutamina 2 mM para o DMEM. Preparar tampão fosfato salino (PBS) contendo 2,7 mM de KCl, 137 mM de NaCl, 10 mM de Na ₂ HPO ₄ 2H _{2 O e} 2 mM de KH _{2 PO 4,} em água desionizada e ajustar o pH para 7,4 com NaOH 10N.
      NOTA: PBS pode ser mantido como solução de reserva 10x ao longo do tempo à temperatura ambiente. Diluir com água desionizada antes da sua utilização para 1x. Filtra-se a solução novamente 1x se ele vai ser usado em cultura de células.
   2. Preparar um estoque 40 mM de solução de timidina (cultura de células adequado) em meio DMEM. Dissolve-se 0,97 g de timidina em 90 ml de meio DMEM. Ajustar o volume final para 100 mL. Solução estoque da loja a -20 °C. Dissolver (CUIDADO! Trabalhar sob o capô químicos, use luvas e proteção da boca) nocodazole a uma solução stock 5 mg / ml em DMSO.
2. Mitóticas Clusters Isolation Solutions
   NOTA: Todas as soluções descritas no ponto 1.2 têm de ser mantidos em gelo após a preparação / descongelamento durante todo o experimento.
   1. Água desionizada autoclave durante 105 min a 121 ° C. Dissolve-se tetracloridrato de espermina em autoclave, de água desionizada para uma concentração final de 200 mM (69,6 mg / mL). Armazenar a Solução de estoque a -20 ° C. Dissolve-se tricloridrato de espermidina em autoclave, de água desionizada para uma concentração final de 200 mM (50,8 mg / mL). Armazenar a Solução de estoque a -20 ° C.
   2. Prepare a 5% (w / v) digitonina (CUIDADO! Trabalhar sob o capô químicos, use luvas e proteção da boca) em, água deionizada quente. Filtrar e armazenar alíquotas a -20 ° C. Dissolve-se fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF) (CUIDADO! Trabalhar under capa química, usar luvas e protecção da boca) para uma concentração final de 200 mM (35 mg / ml) em etanol a 100%. Armazenar a Solução de estoque a -20 ° C.
   3. Dissolve-se ditiotreitol (DTT), com água desionizada para uma concentração final de 1 M (154 mg / ml) (CUIDADO! Trabalhar sob o capô química, usar luvas). Filtrar a solução e armazenar estoque a -20 ° C.
   4. Prepara-se uma mistura de 100 vezes inibidor de protease (CUIDADO trabalhar sob o capô química, usar luvas!) Por dissolução de 10 mg / mL de AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 mg / ml de leupeptina, 0,1 mg / mL de pepstatina e 0,2 mg / ml de aprotinina em água desionizada. Armazenar a Solução de estoque a -20 ° C.
   5. Prepara-se uma solução estoque de 10x tampão A contendo 150 mM de Tris-Cl (pH 7,4), KCl 800 mM, EDTA 20 mM-KOH (pH 7,4), 2 mM, tetracloridrato de espermina e espermidina 5 mM de tri-hidrocloreto. Um tampão de armazenamento a 4 ° C sem tetracloridrato de espermina e espermidina, tricloridrato, o qual deve ser acrescentadorecém pouco antes de usar.
      NOTA: EDTA única dissolve a valores de pH superiores a 8, por conseguinte, para preparar uma solução concentrada de alta estoque de EDTA-se KOH (0,5 M recomendado), adicionar KOH 5 N a pH acima de 8 para o dissolver. Em seguida titula-se até pH 7,4.
   6. Prepara-se uma solução de estoque de tampão 20x como contendo 100 mM de Tris-HCl (pH 7,4), KCl 400 mM, EDTA 400 mM-KOH (pH 7,4) e 5 mM de espermidina tricloridrato. Tampão que pode ser armazenada nas mesmas condições que tampão A.
      NOTA: Preparar as soluções de trabalho I a IV (ver nas etapas a seguir), o gradiente de glicerol e as soluções de partículas de sílica coloidal contendo partículas de sílica (15 a 30 nm de diâmetro) revestidas com polivinilpirrolidona não dialisável (PVP) de fresco imediatamente antes do isolamento procedimento (PMSF e digitonina deve ser adicionado imediatamente antes da utilização como PMSF é lábil em solução aquosa e a digitonina tende a precipitar durante o armazenamento a longo prazo em gelo).
   7. Prepare a 100 ml de solução I por adição de tampão de 0,5x A,1 mM de DTT, 1: 100 da mistura de inibidor de protease e PMSF 0,1 mM em autoclave, água desionizada. Preparar 50 ml de solução II (para a lise celular), através da adição de tampão 1x A, 1 mM de DTT, 1: 100 da mistura de inibidor de protease, PMSF 0,1 mM, 0,1% de digitonina e 10% de glicerol em autoclave, água desionizada.
   8. Preparar 200 ml de uma solução contendo tampão 0,25x III A, DTT 1 mM, 1: 100 da mistura de inibidor de protease, PMSF 0,1 mM e 0,05% de digitonina em autoclave, água desionizada. Preparar 40 ml de uma solução de IV contendo tampão 1x Como, 1 mM de DTT, 1: 100 da mistura de inibidor de protease, PMSF 0,1 mM e 0,1% de digitonina em autoclave, água desionizada.
   9. Prepare a 120 ml de solução de gradiente de glicerol por adição de 25% de glicerol e 0,1% de digitonina a solução I.
   10. Prepare a 150 ml de solução coloidal de partículas de sílica que contêm de 60% v / v (volume por volume) de uma suspensão contendo partículas de sílica (diâmetro 15 a 30 nm) revestidos com polivinilpirrolidona não dialisável (PVP), 15% de glicerol, 2 mM de spermidine tricloridrato e 0,8 mM, tetracloridrato de espermina na solução IV.
   11. Preparar tampão de armazenamento de cluster contendo sacarose 250 mM, HEPES 15 mM (pH 7,4), 0,5 mM de espermidina, tricloridrato, tetracloridrato de espermina 0,2 mM, 1: 100 da mistura de inibidor de protease, 0,3% de BSA e 30% de glicerol. O tampão de armazenamento de cluster pode ser mantida a -20 ° C.
   12. Prepare solução de correção de squash contendo formol a 10% (CUIDADO! Trabalhar sob o capô químicos, use luvas), glicerol a 50%, dobro tampão de Ringer de modificação de Marcos (MMR ver 4.5.) E 0,2 ng / ml DAPI (CUIDADO! Usar luvas). Armazenar a 4 ° C em tubos de reacção de luz protegido. Não é crucial para a experiência de usar esta polpa correcção da receita, receitas alternativas também irá funcionar.

2. A sincronização de Células

1. No Dia 1: Semente de células HeLa em cinco 75 cm ² (250 ml) frascos com meios de comunicação e que incubar a 37 ° C em 5% C_O 2.
   NOTA: O resultado será, em cerca de 18 X 10 ⁶ células, no dia do isolamento do cluster da cromatina.
2. No Dia 2: Quando as células são pelo menos 50% confluentes (aproximadamente metade da superfície é coberta por células e há ainda espaço para as células a crescer), adicionar timidina para uma concentração final de 2 mM (bloco timidina) e as células de cultura durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO _2.
   NOTA: Isto irá prender as células no G1 / S fase fronteira.
3. No Dia 3: medium Aspirar contendo timidina e adicione PBS estéril. Lave as células por lavagem delicada com PBS estéril. Aspirar suavemente PBS e adicionar 15-20 ml de fresco, células completas quentes e médias de cultura DMEM durante 3 a 4 horas a 37 ° C em 5% de CO ₂ a libertá-los a partir do bloco G1 / fase S.
4. No dia 3 (continuação): Depois de libertar as células a partir do bloco G1 / fase S, nocodazol adicionar a uma concentração final de 100 ng / ml. Diluir nocodazol por adição de 2 ul de solução de reserva (5 mg / ml) a 98ul de meio de DMEM fresco, e adicionar 1 ml de nocodazole diluída por cada ml de cultura de células. Células de cultura durante aproximadamente 12 horas a 37 ° C em 5% de CO _2. Isto irá bloquear as células em mitose.

3. mitóticas Clusters Isolamento

1. No dia 4: Isolar clusters de mitose. Usando um microscópio de campo brilhante, verificar se a maioria das células são mitótico. Se menos de 50% das células são mitótico espera até que mais células atingem a mitose. Recolher as células mitóticas tocando vigorosamente na parede lateral do balão (ou por pulverização suavemente com a pipeta), este irá separar restantes células mitóticas. Transferir a suspensão de células para tubos de 50 ml de centrífuga cónicos.
   NOTA: As células mitóticas tornar redonda e pode ser facilmente retirado do balão de fundo (tal como células após tripsinização), ao contrário das células em outros estádios do ciclo celular, que são planas e firmemente fixados ao balão.
2. Colheita de células mitóticas por fiação os tubos a 1500 x g durante 10 min (476; C ou TA) e depois remoção do sobrenadante. Ressuspender o sedimento de células em 8 ml de PBS, em associação um tubo de centrífuga de 50 mL cónico, encher o tubo completamente com PBS e girar novamente durante 10 min a 1.500 x g. Repita este procedimento de lavagem três vezes no total.
3. A partir de agora executar todos os passos no gelo com soluções frias. Vigorosamente ressuspender o sedimento em 37 ml de solução fria II. Transferir a suspensão a uma solução fria de 40 ml homogeneizador de vidro-vidro usando uma pipeta de 25 ml e lisam as células em gelo por douncing com um pilão apertado até aglomerados de mitose são livres de material citoplasmático. O número de pancadas é altamente dependente do estoque digitonina e pode variar de 3 a 20 vezes.
   NOTA: A homogeneização pode ser bastante vigorosa, mas deve ser considerada completa quando quase todas as células mitóticas são lisados ​​e os clusters são vistos para ser livre de material citoplasmático (ver 3.4).
4. Depois de um par de golpes misturar 5-10 ul da suspensão de células de 1: 2 com Trypan azul e verificar por microscopy em uma câmara de Neubauer. Cromatina Quando as células são lisadas está manchada azul e livre das membranas celulares (NOTA: possíveis restos citoplasmáticos será acumular em torno da cromatina manchado azul e será fácil distinguir).
   NOTA: As células mitóticas vai lisar células antes interphasic mas, no entanto ter cuidado para não exagerar homogeneização, a fim de evitar a contaminação com núcleos interphasic e cromatina mutilado.
5. Camada imediatamente todo o lisado celular sobre gradientes escalonados frio (com 5 mL de 60% solução coloidal de partículas de sílica, na parte inferior, cobertas com 19,5 ml de solução de gradiente de glicerol cada) em cinco tubos de centrifugação de policarbonato (28,8 x 107,0 mm, é recomendável colocar os tubos em gelo antes de se arrefecer para baixo), utilizando uma pipeta de 10 mL. Não manter as células em solução II durante um longo período de tempo, portanto, recomenda-se preparar os tubos e o gradiente de antemão (por exemplo, durante os passos de lavagem).
6. Centrifugar os gradientes para 30 min a 1000 xg, a 4 ° C num rotor de ângulo fixo.
   NOTA: Os núcleos, células não lisadas e os aglomerados são recuperados em conjunto na interface do glicerol e as partículas coloidais de sílica camadas.
7. Remover o líquido acima da interfase, usando uma pipeta e transferir o restante para o homogeneizador frio. Mistura re-homogeneizar por 3-15 pancadas (novamente, dependendo do estoque digitonina) com o pilão apertado para eliminar agregados e para remover as fibras do citoesqueleto dos clusters. Depois de cada par de golpes verificar a eficiência de homogeneização. Misture 1 ml da amostra com 1 ml de polpa de correção suplementadas com DAPI e examinar ao microscópio fluorescente.
   NOTA: O número de acidentes vasculares cerebrais é crucial, a presença de agregados de cluster meio, que o número de cursos for insuficiente, enquanto cromatina mutilado núcleos e detritos indicam que a homogeneização era muito forte.
8. Distribuir a solução entre quatro novos tubos de centrifugação de policarbonato (28,8 x107,0 milímetros) (10 ml de solução de aprox. Por tubo) e preenchê-los completamente com 60% de solução de partículas de sílica coloidal (aprox. 30 ml de solução coloidal partículas de sílica por tubo).
   NOTA: Evite sobrecarregar o gradiente de partículas de sílica coloidal desde clusters podem ser facilmente preso se houver muita detritos citoplasmática no gradiente.
9. Rotação durante 5 minutos a 3000 xg, seguido de 30 min a 45.440 xg, a 4 ° C num rotor de ângulo fixo.
   NOTA: Como antes, os núcleos interphasic vai ser impedido de entrar no gradiente (se a homogeneização não foi feito muito fortemente que liberta núcleos a partir dos detritos citoplasmático), mas os aglomerados vão acumular cerca de 1,5 cm a partir do fundo do tubo, frequentemente como uma bola solta.
10. Retirar o líquido acima dos clusters usando uma pipeta, piscina o resto em um tubo, ressuspender bem e redistribuir a dois tubos de centrifugação de policarbonato (28,8 x 107,0 mm). Dilui-se a suspensão de aglomerado 1: 4 com uma solução de III, em cada tubo e misturar bem. Mark the local foram o sedimento será girar e 1.000 xg durante 15 min a 4 ° C num rotor de ângulo fixo.
11. Volte a suspender as pelotas no Solution III, piscina em um tubo de centrífuga de 50 ml cônico e encher-se com a solução III. Centrifugar a 300 xg única para cerca de 10 min. Não centrifugar a maior velocidade - pode provocar a agregação irreversível de clusters.
12. Lavar novamente com solução III em 1,5 mL ou 2 tubos de reacção (ressuspender as pastilhas e encher os tubos completamente para cima) e centrifugar a 300 x g. Remover o sobrenadante cuidadosamente com uma pipeta. Ressuspender pellet cuidadosamente em 250 ul de tampão de armazenamento de cluster (se você tiver várias pelotas usar 250 ul para todos juntos e reunir-los). Dilui-se 5-10 uL da amostra de 1: 2 com azul de tripano e contagem na câmara de Neubauer. Se aplicável mais diluído para se obter uma concentração aproximada de 500 agrupamentos / ul.
13. Empurre a suspensão através de um filtro de células 100 um para certificar-se de remover a agregação de clusters resultantes de ressuspensão inadequada. Os aglomerados podem ser armazenados durante meses em -80 ° C. Para evitar recongelamento múltipla fazer alíquotas apropriadas e encaixe congelamento em nitrogênio líquido.

4. Preparações de tampão para Interphasic Xenopus laevis extrato do ovo

NOTA: Xenopus laevis rãs são mantidos e tratados em conformidade com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Convenção do Conselho da Europa sobre a protecção dos animais vertebrados utilizados para fins experimentais e outros fins (UE ratificaram em 1998) e da lei alemã pertencente a a utilização de animais em pesquisa vertebrados.

1. Prepare a TDT e 100 vezes mix inibidor de protease de acordo com 1.2.3 e 1.2.4. Dissolve-se citocalasina B a uma concentração final de 10 mg / ml em DMSO, alíquota (10 ou 20 ul recomendado) e armazenar a -20 ° C.
2. Dissolve-se cicloheximida até uma concentração final de 20 mg / ml em etanol, alíquota (500 ulRecomendada) e armazenar a -20 ° C. Dissolve-se o ionóforo de cálcio A23187 até uma concentração final de 2 mg / ml em etanol, alíquota e armazenar a -20 ° C.
   NOTA: PI, DTT, citocalasina B, cicloheximida e A23187 podem ser congeladas e descongeladas repetidamente.
3. Prepare 20x tampão de Mark modificação de Ringer (MMR) contendo 2 M de NaCl, 40 mM de KCl, 20 _mM de MgCl2, 40 _mM de CaCl2, 2 mM de EDTA e 100 mM de Hepes, ajustar o pH a 8,0 com KOH 5N.
   NOTA: O 20x MMR pode ser mantido ao longo do tempo à temperatura ambiente. Dependendo das quantidades de ovos, para uma preparação de extracto de ovo interphasic 1 L de 1x MMR por rã injectado e um adicional de 5-10 litros para os passos de lavagem são necessárias. Re-ajustar o pH da 1x MMR a 8,0 com KOH 5 N. 1x MMR preparado para manter as rãs em O / N x 1 deve ser em temperatura ambiente. MMR 1x preparado para a preparação de extracto deve ser mantida fria até ser utilizada, no entanto, não é crucial para a experiência de que a MMR é realmente 1x frio.
4. Prepare 1 L de suctampão contendo 250 mM de sacarose, 50 mM de KCl, 2,5 mM MgCl ₂ e 10 mM de Hepes pH 7,5 aumentaram. Tampão de sacarose deve ser preparado no dia antes de usar água estéril e deve ser mantida a 4 ° C.
5. Preparar a solução dejellying recentemente, na manhã do experimento dissolvendo 2% L-cisteína em 0,25x MMR. Ajustar o pH a 7,8 com KOH 5N. Manter a 4 ° C até ser utilizado.

Extrato laevis Egg 5. Protocolfor Interphasic Xenopu s

1. Injectar 120 IE gonadotrofina de égua prenhe (PMSG) no saco linfático dorsal de cada sapo 3-10 dias antes do experimento (5 ml seringas, 27 G ¾ '' agulhas).
   NOTA: Esta injecção irá induzir a ovulação. A quantidade de ovos, um sapo estabelece varia muito. Uma rã bem, que pode produzir ovos que ocupam um volume de 7 ml até depois de ser des-jellynated o que corresponde a um máximo de 3,5 ml de extracto em bruto. No entanto, consideramos que alguns sapos podem não estabelecer ou vontade laovos ruins y.
2. Injectar 500 IE gonadotrofina coriônica humana (hCG) per rã na noite antes do experimento (5 ml seringas, 27G ¾ '' agulhas). Isto irá induzir a libertação dos ovos. Manter as rãs para 13-17 hr a 18 ° C em tanques individuais contendo 1,2 L MMR 1x (pH 8).
3. Recolher os ovos vertendo-os em taças 600-1,000 ml de vidro.
   NOTA: Tome apenas os bons lotes de ovos que são depositados individualmente, semelhante em tamanho e claramente pigmentadas com um escuro e meia de cor clara. Não tome ovos que formam cordas ou que olhar inchado e branco. Estes devem ser resolvidos ao longo de todo o procedimento usando um plástico Pasteur pipeta. Para uma descrição detalhada do bem contra o mal ovos ver Gillespie et ^al 6.
4. Lavar os ovos de forma intensiva, cerca de 4 vezes, com 1x MMR por decantação do sobrenadante quando os ovos se estabeleceram e reabastecer o copo com tampão fresco depois.
   NOTA: Oovos são estáveis, antes de serem dejellynated e o tampão de lavagem pode ser aplicado directamente sobre os ovos.
5. Dejellynate os ovos por incubação em solução de cisteína a 2%. Mudar tampão uma vez após 2-4 min por decantação e o tampão de enchimento do copo cuidadosamente com tampão fresco. Considerdejellying completa quando o volume dos ovos diminui drasticamente e os ovos tornar-se mais densamente embalados.
   NOTA: O dejellying precisa de cerca de 5-7 minutos e deve ser interrompido quando visível, mas mais tardar após 10 min.
6. Lavar ovos aproximadamente 4 vezes com 1x MMR por decantação do sobrenadante e tampão de reenchimento.
   NOTA: Os ovos são mais frágeis depois de ser dejellynated e, portanto, os passos de lavagem têm de ser feito com mais cuidado. A MMR deve ser, em vez enxaguado na parede do recipiente, em vez de directamente sobre os ovos.
7. Activa ovos em 100 ml de 1x MMR adicionando 8 ul de o ionóforo de cálcio (2 mg / ml em etanol). Pare de ativação quando a contração cap animais servem visível ou após 10 min.
   NOTA: A contracção tampão animal pode ser identificado pela compactação da metade preta do ovo.
8. Lave cuidadosamente quatro vezes com 1x MMR por decantação e recarga do sobrenadante tampão.
9. Incubar os ovos durante 20 min em 1x MMR na RT.
10. Preparar os tubos de centrifugação durante o tempo de incubação: Local 50 ul de tampão de sacarose, 50 ul de 100 vezes mistura inibidor de protease, 5 ul de DTT 1 M, 12,5 mL de cicloheximida (para evitar a tradução, especialmente da ciclina B) e 2,5 ul de citocalasina B (para evitar a polimerização da actina) em 5 mL de tubos de centrifugação (13 x 51 mm). Como alternativa, há mais de 30 ml de ovos, 14 ml tubos (14 x 95 mm) pode ser utilizado, neste caso, aumentar volumes em 2,4 vezes.
11. Lavar os ovos duas vezes com tampão frio de sacarose (decantar e tampão de recarga no copo de vidro) e transferi-los para dentro de tubos de centrifugação, utilizando uma pipeta de Pasteur de plástico com a abertura grande (corte a extremidade estreita).
12. Pacoteovos por centrifugação durante 1 min a 130 x g. Colocar os tubos em 15 ml de tubos de centrífuga cónicos para esta finalidade (coloque os tubos de 14 ml em 50 ml de tubos de centrífuga cónicos, respectivamente). O objectivo é eliminar, tanto tampão quanto possível para evitar a diluição do extracto. Após a centrifugação, remover o excesso de tampão usando uma pipeta de plástico Pasteur e, eventualmente, preencher mais ovos no topo.
13. Rotação em 6 x 5 ml de balanço do rotor durante 20 min a 21.000 xg, a 4 ° C.
14. Remover baixo extrato de velocidade utilizando uma seringa de 5 ml com um 16 G 1 ½ '' agulha, entre gema amarela no topo e escuro detritos ovo quebrado na parte inferior. Para este efeito, empurrar a agulha da seringa, através da parede do tubo de centrifugação imediatamente acima da camada de detritos ovo quebrado no fundo. Segure o tubo contra uma resistência ao empurrar com a agulha.
    NOTA: A 5 ml tubo de centrifugação preenchido dá entre 1,8-2,5 ml do extrato.
15. Por 1 ml de extracto de adicionar 10 ul de 100 vezes de mistura inibidor de protease, 1 ulde DTT 1 M, 2,5 ul de ciclo-heximida (20 mg / ml) e 0,5 ul de citocalasina B (10 mg / mL). Mantenha o extrato no gelo.
    NOTA: O extracto pode ser utilizado quer directamente para o experimento ou aliquotadas, congeladas rapidamente e armazenadas em azoto líquido durante vários meses. Congelar o extrato vai diminuir a sua actividade. Para delicadas experiências como imunodepleção é altamente recomendado o uso de extrato fresco imediatamente.

6. Preparação de buffers para In Vitro Reconstituição da cromatina descondensação

1. Preparar a solução da mistura de energia contendo ATP a 25 mM, GTP 25 mM, 127,5 mg / mL de fosfato de creatina e 2,5 mg / ml de creatina-quinase, em tampão contendo sacarose 250 mM, HEPES 1,2 mM, KCl 5,9 mM e 0,3 mM de MgCl _2. Alíquotas e armazenar a -80 ° C. Use recentemente após o descongelamento, não voltar a congelar.
2. Dissolve-se 0,2 g / ml de glicogénio em água desionizada. Armazenar a -20 ° C. Dissolve-se 6-aminopurina dimetil (DMAP) a uma concentração finalde 0,25 M em DMSO. Alíquotas e armazenar a -20 ° C. Use recentemente após o descongelamento, não voltar a congelar.
3. Prepare a 30% (w / v) de sucrose em PBS, filtrar e armazenar a 4 ° C. Preparar a solução VikiFix 4% contendo 80 mM PIPES pH 6,8, 1 mM _de MgCl2, 150 mM de sacarose e 4% de paraformaldeído (PFA) (CUIDADO! Trabalhar sob o capô químicos, use luvas e proteção da boca).
   NOTA: O PFA é difícil de dissolver, portanto, recomenda-se a fazê-lo da seguinte forma: Para 1 l Viki-Fix dissolver 24,2 g tubos e 40 g PFA em copos separados, tanto no quente (quase fervendo) água deionizada. Ambos irão se dissolver através da adição de NaOH 10 N, mas tome cuidado para não acrescentar muito. Adicionar 51,4 ​​g de sacarose e 1 ml de 1 M _de MgCl2 para a solução de PFA. Adicionar a solução de tubos para a outra mistura. Encha até 1 l volume final e ajustar o pH a neutralidade por adição de NaOH.
4. Dissolve-se 10 mg / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) em água (CUIDADO! Usar luvas). Armazene emno escuro a -20 ° C.

7. Protocolo para In Vitro Reconstituição da cromatina descondensação

1. Gire extrato interphasic baixa velocidade durante 12 min a 386.000 xg em um ângulo fixo 20 x 0,2 ml ou pelo 355 000 xg num rotor 10 x 2.0 ml.
2. Remova suavemente a camada lipídica em cima utilizando uma bomba de vácuo ou pipeta e tomar o sobrenadante (depois chamado extrato de alta velocidade) evitando a contaminação da membrana a partir da camada inferior e descartar o pellet.
   NOTA: Para reduzir a possível contaminação da membrana é aconselhável para girar o extracto duas vezes ou para diluir o extracto com 20% de volume com o tampão de sacarose antes da centrifugação. No entanto, diluição e passos de centrifugação adicionais podem reduzir a atividade de extração.
3. Pipeta 18 mL de extrato de alta velocidade em um tubo de 1,5 ml reação, adicionar 0,7 mL de cluster mitótico (montante pode ser ligeiramente variar de acordo com a concentração da cromatina), 0,5 mL de glicogênio, 0,5 ulcabaz energético e 0,3 ul DMAP. Utilizar pontas com ampla abertura para misturar a reacção logo que a cromatina é adicionado para evitar o corte da cromatina decondensing.
   NOTA: A reacção pode ser realizada na presença ou ausência de membranas (ver Figura 3). Para decondense cromatina na presença de membranas, adicionar 2 ul de membranas flutuavam preparados de acordo com o protocolo descrito por EISENHARDT et al. ¹⁶
4. Incubar a mistura de reacção durante até 2 horas (ou menos para estudar os pontos de tempo iniciais do processo descondensação) a 20 ° C.
5. Fixar a amostra por adição de gelo frio de 0,5 ml Viki-Fix contendo 0,5% de glutaraldeído e 0,1 mg / ml de DAPI e incubação durante 20-30 min em gelo.
   NOTA: Se as amostras serão tratados posteriormente para imunofluorescência, a fixação deve ser feito sem glutaraldeído como isso muitas vezes interfere com a coloração de anticorpos. No entanto, se somente a coloração DAPI irá ser analisado, a adição de excessoaraldehyde irá preservar uma estrutura da cromatina mais agradável.
6. Incubar lamelas circulares (diâmetro de 12 mm) durante 5 min com uma solução de lisina de poli-L-para aumentar a afinidade de as lamelas de cromatina. Secam-se as lamelas em papel de filtro depois.
7. Montar tubos de centrifugação de fundo plano (6 mL, 16/55 mm), colocando as lamelas revestidas com o local para a parte superior na parte inferior do tubo de centrifugação. Adicionar 800 ul da almofada de sacarose a 30% e a camada de amostra fixa no topo.
8. Rotação durante 15 min a 2500 xg, a 4 ° C.
   NOTA: Os tubos de centrifugação de fundo plano para caber rotores que adotam 15 ml tubos cônicos de centrífuga.
9. Decantar o sobrenadante, em seguida, remover as lamelas das câmaras de ar por cutucando cuidadosamente a parte inferior do tubo de centrifugação com um 16 G 1 ½ '' agulha de seringa. Para este efeito, a fita de cobertura da agulha e a própria em conjunto nas suas partes inferiores da agulha e o corte do lado frontal da tampa de modo a que a agulha fura cerca de 3mm para fora. Quando a lamela é levantado pela agulha em um local, utilizar uma pinça para remover a lamela.
10. Lave as lamelas rapidamente por imersão em água deionizada, seque-o com cuidado, tocando seu lado para um papel de filtro e coloque-a sobre a lâmina de microscópio em uma gota de meio de montagem. Selá-lo com unhas polonês, seco e manter na obscuridade.
    NOTA: As amostras fixas sem glutaraldeído pode ser armazenado em PBS numa placa de 24 poços e usado posteriormente para coloração por imunofluorescência. Se armazenada durante vários dias, adicionar 0,05% de azida de sódio (CUIDADO!) Usar luvas para a PBS para evitar a contaminação com bactérias.
11. Analisar as amostras através de microscopia de fluorescência do sinal de DAPI (usando, por exemplo, um microscópio confocal com um laser de 405 nm).

8. Preparação de tampão para Coloração de imunofluorescência In Vitro reconstituídos Amostras Chromatin descondensação

1. Prepare PBS de acordo com 1.1.1. Dissolver NH _{4 Cl} a um finconcentração al de 50 mm de PBS. Manter esta solução, a 4 ° C. Dissolve-se 5 ug / ml em PBS DAPI (preparar de fresco). Adicionar 0,1% de Triton X-100 a PBS. Mantenha a 4 ° C. Preparar tampão de bloqueio de fresco antes da utilização por diluição de 3% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS + 0,1% de Triton X-100.

9. Protocolo para Coloração de imunofluorescência In Vitro reconstituídos Amostras Chromatin descondensação

NOTA:. Todos os seguintes incubações de as lamelas são feitos em uma placa de 24 poços com pelo menos 250 solução ul por bem, se não indicado de outra forma in vitro descondensação amostras de cromatina são mais sensíveis do que as células fixas, portanto, tenha cuidado ao adicionar ou remover soluções. Recomenda-se usar pipetas de Pasteur de plástico corte angular. Para obter as etapas de lavagem e incubação do anticorpo secundário colocar a placa à temperatura ambiente no balanço ou plataforma de rotação, movendo-se não mais rápido do que 100 rpm.

1. Saciar amostras incubando lamelas com 1 ml _de NH 4 Cl em PBS durante 5 min. Amostras do bloco através da sua incubação com 1 ml de tampão de bloqueio durante, pelo menos, 30 min.
2. Montar uma câmara de humidade durante a incubação com o anticorpo primário: Coloque um tecido húmido no fundo de uma caixa que pode ser fechado e a tampa da placa de 24 poços de cabeça para baixo na parte superior do tecido molhado. Coloque a tampa em parafilme e adicionar 70 ul de solução de anticorpo por amostra no parafilme. Para a solução de anticorpo, de anti-soro diluído ou de afinidade purificados anticorpos 1: 100 em tampão de bloqueio.
3. Coloque as lamelas de cabeça para baixo no topo da solução de anticorpo e incubar durante 1 a 2 horas. Coloque as lamelas de volta para a placa de 24 poços, com o lado da amostra virado para cima e lavar as amostras três vezes durante 10 min com 1 ml de 0,1% de Triton X-100 em PBS.
4. Incubar lamelas durante 1 h à TA em 250 de anticorpo secundário fluorescente marcada com uL diluído em tampão de bloqueio a uma concentração recomendada pelo fabricante. Proteger da luz. Lave three vezes durante 10 min com 1 ml de 0,1% de Triton X-100 em PBS.
5. Incubar as amostras durante 10 min com 1 mL de 5 ug / ml em PBS DAPI. Lavar três vezes durante 5 minutos com 1 ml de 0,1% de Triton X-100 em PBS.
6. Lave as lamelas rapidamente por imersão em água deionizada, seque-o com cuidado, tocando seu lado para um papel de filtro e coloque-a sobre a lâmina de microscópio em cima de uma gota de meio de montagem. Selá-lo com unhas polonês, seco e manter a 4 ° C no escuro até ser utilizado. Analisar as amostras através de microscopia de fluorescência.

Resultados

Dependência do tempo da reação descondensação

A Figura 1 mostra um típico campo de tempo do ensaio descondensação. O conjunto de cromossomas visíveis no início da reacção decondenses e funde-se com uma única volta e núcleo liso. Quando o extracto de ovo é substituído por tampão de sacarose a agrupar continua a ser condensado cromossoma, que sugerem que a actividade descondensação está presente no extracto de ovo.

Descondensaç...

Discussão

Xenopus laevis extractos de ovos são uma ferramenta muito útil para reproduzir fielmente processos celulares in vitro, e este sistema foi utilizado com sucesso na caracterização do ciclo celular e divisão celular eventos ^{2, 3,5,6,17.} Devido a grandes lojas de componentes nucleares sequestrados no ovo durante a ovogênese, extratos de ovos são uma excelente fonte de componentes celulares. Em comparação com outras abordagens, como RNAi em linhas celulares de tecido de mamíf...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1