Сотовый бесплатно Анализ по изучению хроматина деконденсацию в конце митоза

Резюме

The molecular mechanisms of the decondensation of highly compacted mitotic chromatin are ill-defined. We present a cell-free assay based on mitotic chromatin clusters isolated from HeLa cells and Xenopus laevis egg extract that faithfully reconstitutes the decondensation process in vitro.

Аннотация

During the vertebrate cell cycle chromatin undergoes extensive structural and functional changes. Upon mitotic entry, it massively condenses into rod shaped chromosomes which are moved individually by the mitotic spindle apparatus. Mitotic chromatin condensation yields chromosomes compacted fifty-fold denser as in interphase. During exit from mitosis, chromosomes have to re-establish their functional interphase state, which is enclosed by a nuclear envelope and is competent for replication and transcription. The decondensation process is morphologically well described, but in molecular terms poorly understood: We lack knowledge about the underlying molecular events and to a large extent the factors involved as well as their regulation. We describe here a cell-free system that faithfully recapitulates chromatin decondensation in vitro, based on mitotic chromatin clusters purified from synchronized HeLa cells and X. laevis egg extract. Our cell-free system provides an important tool for further molecular characterization of chromatin decondensation and its co-ordination with processes simultaneously occurring during mitotic exit such as nuclear envelope and pore complex re-assembly.

Введение

Xenopus Laevis яйцо экстракт является мощным и широко прикладной инструмент для изучения сложных клеточных событий в простоте бесклеточной анализа. Так их первого описания по Lohka & Мазуи ¹ они были широко используется для изучения митоза процессы, такие как конденсации хроматина ^2, сборки веретена ^3, пробоя ядерной оболочки ^4, но и цитоплазматический транспорт ⁵ или ⁶ репликации ДНК. События, происходящие в конце митоза, необходимые для реформирования межфазной ядра, такие как реформирования ядерной оболочки и ядерных пор сложной сборки значительно менее понятны по сравнению с началом митоза событий, но аналогично могут быть изучены с помощью Xenopus яичный экстракт ^7. Недавно мы установили анализа, основанного на Xenopus яичного экстракта для изучения хроматина деконденсацию в конце митоза ^8, процесс под исследовали, что ожидает ят.с. подробную характеристику.

В многоклеточных, хроматин конденсируется при высокой митотической вступления в целях выполнения точно, в сегрегации генетического материала. Чтобы гарантировать, что хроматин доступна экспрессии генов и репликации ДНК во время интерфазы, он должен быть де-уплотненный на конце митоза. У позвоночных, хроматин до пятидесяти раз больше уплотняется во время митоза по сравнению с интерфазе ^9, в отличие от дрожжей, где митотический уплотнения, как правило, значительно ниже, например, только в два раза в S. Cerevisiae ^10. Позвоночных хроматина деконденсация была в основном изучена в контексте реорганизации ДНК спермы после оплодотворения яйцеклетки. Молекулярный механизм, в котором нуклеоплазмина, обильное белок яйцеклетки, сперма обмен конкретных протамины в гистонов H2B H2A и хранящиеся в яйце. Этот процесс был также выяснены при помощи Xenopus экстракт яичного ^{11, 12.} Однако выражениеиз нуклеоплазмина ограничен ооцитов ^{13 и} митотического хроматина не содержит этих спермы конкретных протамины. Поэтому хроматина деконденсацию в конце митоза нуклеоплазмина независимая ^8.

Для реакции в пробирке деконденсацию мы используем экстракт сгенерированный из активированных X. Laevis яиц и хроматина кластеров, выделенных из клеток HeLa синхронизированных. Лечение яиц с ионофора кальция имитирует высвобождение кальция в яйцеклетки, порожденной вступления сперматозоидов в процессе оплодотворения. Волна кальция вызывает возобновление клеточного цикла и яйцо, арестованного во второй метафазе мейоза, прогрессирует до первого интерфазы ^14. Таким образом, яйцо экстракты, приготовленные формы активируется яйца представляют митотическую состояние выхода / интерфазной и компетентны, чтобы вызвать события, специфические для выхода из митоза как хроматина деконденсации, ядерной оболочки и корпеть комплексного реформирования. Для выделения митотического чromatin кластеров мы использовали слегка модифицированную версию протокола, опубликованного Гассер и Laemmli ^15, где кластеры хромосом выпущен лизис клеток HeLa с синхронизированными в митозе и изолированных в полиаминными содержащий буферов градиентные центрифугирования.

протокол

Митотическое хроматина кластера Изоляция от клеток HeLa

1. Подготовка

1. Культура клеток Решения
   1. Подготовьте среду полном Игла в модификации Игла (DMEM), добавив 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 единиц / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 2 мМ глутамина в DMEM. Приготовьте фосфатный буфер солевой раствор (PBS), содержащего 2,7 мМ KCl, 137 мм NaCl, 10 мМ _Na 2 HPO _{4 ·} 2H 2 O и 2 мМ KH ₂ PO ₄ в деионизированной воде, и доведения рН до 7,4 с помощью 10 N NaOH.
      Примечание: PBS, может быть, как 10-кратным маточного раствора с течением времени при комнатной температуре. Развести его деионизированной водой до 1x перед использованием. Фильтр 1x раствор еще раз, если он будет использоваться в клеточной культуре.
   2. Подготовьте 40 мм запас тимидина раствора (для культивирования клеток подходит) в DMEM среде. Растворите 0,97 г тимидина в 90 мл DMEM среде. Регулировка конечного объема 100 мл. Магазин раствор при -20 °С. Растворите (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту) нокодазол в 5 мг / мл маточного раствора в ДМСО.
2. Митотические Кластеры изоляции Решения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все решения, описанные в 1.2 должны быть сохранены на льду после приготовления / размораживания в течение всего эксперимента.
   1. Автоклав деионизированной воды на 105 мин при 121 ° С. Растворите спермин тетрагидрохлорид в автоклаве, деионизированной водой до конечной концентрации 200 мМ (69,6 мг / мл). Магазин раствор при -20 ° С. Растворите спермидинсинтазу тригидрохлорид в автоклаве, деионизированной водой до конечной концентрации 200 мМ (50,8 мг / мл). Магазин раствор при -20 ° С.
   2. Подготовка 5% (вес / объем) дигитониновым (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту) в горячей деионизированной водой. Фильтр и хранят аликвоты при -20 ° С. Растворите Фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ) (ВНИМАНИЕ! Работать недеформированнойг химической капот, надеть перчатки и защиту рту) до конечной концентрации 200 мМ (35 мг / мл) в 100% этанола. Магазин раствор при -20 ° С.
   3. Растворите дитиотреитола (DTT) с деионизированной водой до конечной концентрации 1 М (154 мг / мл) (осторожно! Работать под капотом химической, в перчатках). Фильтр и магазин раствор при -20 ° C.
   4. Приготовьте 100-кратное ингибитор протеазы смеси (ОСТОРОЖНО работать под капотом химической, в перчатках!) Путем растворения 10 мг / мл AEBSF (4- (2-Aminoethly -) - benzensulfonylfluoride), 0,2 мг / мл лейпептина, 0,1 мг / мл пепстатина и 0,2 мг / мл апротинина в деионизированной воде. Магазин раствор при -20 ° С.
   5. Подготовка 10x маточного раствора буфера А, содержащего 150 мМ Трис-Cl (рН 7,4), 800 мМ KCl, 20 мМ ЭДТА-КОН (рН 7,4), 2 мМ спермин тетрагидрохлорид и 5 мм спермидинсинтазу тригидрохлорид. Магазин буфер А при 4 ° С без спермина тетрагидрохлорид и спермидина тригидрохлорид, которые должны быть добавленынедавно как раз перед использованием.
      Примечание: ЭДТА растворяется только при рН выше 8, таким образом, чтобы подготовить высокой концентрации ЭДТА-КОН маточного раствора (0,5 М рекомендуется), добавляют 5 N КОН до рН выше 8 раз, чтобы растворить его. После титрования до рН 7,4.
   6. Подготовка 20x маточного раствора буфера В, содержащего 100 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 400 мМ KCl, 400 мМ ЭДТА-KOH (рН 7,4) и 5 ​​мм спермидинсинтазу тригидрохлорид. Буфер Как можно хранить в тех же условиях, буфером А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте рабочие растворы я IV (см в следующих шагов), глицерина градиент и коллоидных частиц кремнезема растворы, содержащие частицы диоксида кремния (от 15 до 30 диаметра нм), покрытых с не-диализатного поливинилпирролидона (ПВП) недавно как раз перед изоляции Процедура (ФМСФ и дигитонин должны быть добавлены непосредственно перед использованием, как это ФМСФ лабильным в водных растворах и дигитонин имеет тенденцию к осаждению на длительном хранении на льду).
   7. Приготовьте 100 мл раствора I добавлением буфера А 0.5x,1 мМ ДТТ, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы и 0,1 мМ PMSF в автоклаве, деионизированной водой. Подготовка 50 мл раствора II (для лизиса клеток) путем добавления 1x буфера А, 1 мМ ДТТ, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ ФМСФ, 0,1% дигитонин и 10% глицерина в автоклаве, деионизированной водой.
   8. Приготовьте 200 мл раствора, содержащего III 0.25X буфером А, 1 мМ DTT, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ PMSF и 0,05% дигитонина в автоклаве, деионизированной водой. Подготовка 40 мл раствора IV, содержащие 1x буфер В, 1 мМ DTT, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,1 мМ PMSF и 0,1% дигитонин в автоклаве, деионизированной водой.
   9. Приготовьте 120 мл глицерина градиент раствора добавлением 25% глицерина и 0,1% дигитонина к раствору I.
   10. Приготовьте 150 мл коллоидного раствора кремнезема, содержащие частицы 60% об / об (объем на объем) суспензии, содержащей частицы диоксида кремния (диаметр от 15 до 30 нм), покрытых без диализатного поливинилпирролидон (ПВП), 15% глицерина, 2 мМ овpermidine тригидрохлорид и 0,8 мМ спермин тетрагидрохлорид в растворе IV.
   11. Подготовка кластера буфер для хранения, содержащего 250 мМ сахарозы, 15 мМ HEPES (рН 7,4), 0,5 мМ спермидинсинтазу тригидрохлорид, 0,2 мМ спермин тетрагидрохлорид, 1: 100 в смеси ингибитора протеазы, 0,3% BSA и 30% глицерина. Буфер хранения данных кластера можно хранить при -20 ° С.
   12. Подготовьте для игры в сквош исправить раствор, содержащий 10% формальдегида (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки), 50% глицерина, двукратному модифицированным буфером Марка Рингера (КМС см 4.5.) И 0,2 мкг / мл DAPI (ВНИМАНИЕ! Надевать перчатки). Хранить при 4 ° С в защищенном от света реакционных труб. Это не важно для эксперимента, чтобы использовать эту сквош исправить рецепт, альтернативные рецепты также будет работать.

2. Синхронизация клеток

1. На День 1: Семенной HeLa клетки в пяти 75 см ^{2 (250} мл) колб со средствами массовой информации и инкубировать при 37 ° С в 5% C_О 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это даст примерно 18 в 10 х ⁶ клеток в день изоляции хроматина кластера.
2. На 2-й день: Когда клетки, по крайней мере 50% сливной (примерно половина поверхности покрыта клетками и есть еще возможности для клеток расти), добавить тимидина до конечной концентрации 2 мМ (тимидина блок) и культуры клеток для 24 ч при 37 ° С в _5% СО 2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это будет арестовать клетки в G1 / S границе фаз.
3. На 3-й день: Аспирируйте среде, содержащей тимидин и добавить стерильную PBS. Вымойте клеток с нежной промывки стерильной PBS. Аспирируйте PBS и осторожно добавить 15-20 мл свежей, теплой полных DMEM среднего и культуры клеток в течение от 3 ​​до 4 ч при 37 ° С в 5% СО _2, чтобы освободить их от G1 / S-фазы блока.
4. На день 3 (продолжение): После выпуска клеток из G1 / S-фазы блока, добавить нокодазолом до конечной концентрации 100 нг / мл. Развести нокодазолом добавлением 2 мкл исходного раствора (5 мг / мл) до 98мкл свежей DMEM в среде, и добавить 1 мкл разбавленного нокодазолом на каждые мл клеточной культуре. Культуры клеток в течение приблизительно 12 часов при 37 ° С в 5% СО _2. Это будет блокировать клетки в митоз.

3. Митотические Кластеры Изоляция

1. На 4-й день: Изолировать митотических кластеров. Использование светлого поля микроскопию, проверьте, если большинство клеток митотической. Если менее 50% клеток являются митотический ждать, пока больше клеток не достигают митоза. Сбор митотических клеток, нажав энергично на стороне колбы (или осторожно распыления с пипеткой), это будет отделить остальные митотических клеток. Передача клеточной суспензии до 50 мл конических центрифужных пробирках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Митотические клетки становятся круглыми и могут быть легко отделены от колбы снизу (так же, как клетки после обработки трипсином), в отличие от клеток других стадиях клеточного цикла, которые являются плоскими и прочно прикреплены к колбе.
2. Заготавливают митотических клеток, крутя трубы на 1500 мкг в течение 10 мин (476; С или РТ) и удалением супернатанта после этого. Ресуспендируют осадок клеток в 8 мл PBS, бассейн в один 50 мл коническую центрифужную пробирку, пробирку заполнить полностью с PBS и спина снова в течение 10 мин при 1500 х г в. Повторите эту процедуру промывки три раза в общей сложности.
3. Отныне выполнить все шаги на льду с холодными решений. Энергично ресуспендируют осадок в 37 мл холодного раствора II. Перевести суспензии в 40 мл охлажденной стеклянной стеклянном гомогенизаторе с помощью 25 мл пипетки и лизировать клетки на льду douncing с плотно пестиком до митоза кластеры не свободны от цитоплазмы материала. Количество ударов в значительной степени зависит от дигитониновым складе и может варьироваться от 3 до 20 раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Гомогенизация может быть довольно энергичная, но должна считаться полной, если почти все митоза клетки лизируют и кластеры видел, чтобы быть свободным от цитоплазмы материала (см 3.4).
4. Через пару ходов смешать 5-10 мкл клеточной суспензии 1: 2 с трипановым синим и проверить, MICRoscopy в камере Neubauer. Когда клетки лизируют хроматина окрашивают синий и бесплатно клеточных мембран (ПРИМЕЧАНИЕ: возможные остатки цитоплазмы будет накапливаться вокруг синего витражного хроматина и будет легко отличить).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Митотические клетки лизировать, прежде чем интерфазовыми клеток, тем не менее быть, но не переусердствуйте гомогенизации, чтобы избежать загрязнения с интерфазовыми ядер и изуродованного хроматина.
5. Сразу слой весь клеточный лизат над холодными шаг градиентов (5 мл 60% коллоидных частиц кремнезема раствора на дне, с наложенным 19,5 мл глицерина градиент решения каждой) в пяти из поликарбоната труб центрифугирования (28,8 х 107,0 мм, рекомендуется поместить пробирки на лед, прежде чем охладить) с использованием 10 мл пипетки. Не держите клеток в растворе II в течение длительного времени, поэтому рекомендуется подготовить трубки и градиента заранее (например, во время этапов промывки).
6. Центрифуга градиентов для 30 мильп 1000 мкг в при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
   Примечание: Ядра, unlysed клетки и кластеры извлекают вместе на стыке глицерина и коллоидных частиц кремнезема слоев.
7. Удалить жидкость над интерфазы с помощью пипетки и передачи остальное холодной гомогенизатора. Re-Гомогенизируют смесь по 3-15 ударов (опять же в зависимости от дигитониновым складе) с жесткой пестиком, чтобы устранить агрегаты и снять цитоскелета волокна из кластеров. После каждой пары штрихов проверить эффективность гомогенизации. Смешайте 1 мкл образца с 1 мкл сквош исправить с добавлением DAPI и изучить под флуоресцентным микроскопом.
   Примечание: число ударов важно, наличие кластера агрегатов средства, что число ударов недостаточна, а подогнаны хроматина и ядра мусора, показывают, что гомогенизация была слишком сильна.
8. Распределите решение среди четырех новых поликарбонат центрифугирования труб (28,8 х107,0 мм) (ок. 10 мл раствора на трубке) и заполнить их полностью с 60% -ным раствором частиц коллоидного диоксида кремния (прибл. 30 мл коллоидных частиц кремнезема решение на пробирку).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перегрузки коллоидных частиц кремнезема градиент так кластеры могут быть легко ловушке, если есть слишком много мусора в цитоплазматической градиента.
9. Спин в течение 5 мин при 3000 х г, после чего 30 минут при 45,440 мкг при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
   Примечание: Как и прежде, межфазных ядра будут сохранены от входа градиент (если гомогенизации не было сделано слишком сильно, который выпускает ядра из цитоплазматической мусора), но кластеры будут накапливаться около 1,5 см от дна пробирки, часто, как свободный шар.
10. Снимите выше кластеров с использованием пипетки жидкость, бассейн остальное в одну трубу, ресуспендируют также и распространять двух поликарбонатных труб центрифугирования (28,8 х 107,0 мм). Развести кластера подвески 1: 4 раствором III в каждую пробирку и хорошо перемешать. Марк-йе сайте были осадок будет вращаться и 1000 х г в течение 15 мин при 4 ° С в роторе с фиксированным углом.
11. Ресуспендируют гранул в растворе III, бассейн в один 50 мл коническую центрифужную пробирку и залейте Solution III. Центрифуга только на 300 мкг в течение примерно 10 мин. Не центрифуге при высокой скорости - это может привести к необратимым агрегации кластеров.
12. Вымойте снова Solution III в 1,5 или 2 мл реакционных труб (ресуспендируйте гранул и заполнить трубы полностью вверх) и центрифуги при 300 х г. Удалить супернатант осторожно пипеткой. Ресуспендируют осадок тщательно в 250 мкл буфера для хранения кластера (если у вас есть несколько гранулы использовать 250 мкл для всех вместе и объединить их). Развести 5-10 мкл образца 1: 2 с трипанового синего и рассчитывать в камере Neubauer. Если применимо разбавленный более, чтобы получить концентрацию примерно 500 кластеров / мкл.
13. Нажмите суспензии через сито 100 мкм клеток, чтобы убедиться, чтобы удалить агрегации кластеровс в результате неправильного ресуспендированием. Кластеры могут быть сохранены в течение нескольких месяцев в -80 ° С. Чтобы избежать многократного повторное замерзание сделать соответствующие аликвоты и оснастки заморозить в жидком азоте.

4. Подготовка буфера для межфазных Xenopus Laevis яйцо экстракт

ПРИМЕЧАНИЕ: Xenopus Laevis лягушки поддерживается и обрабатывается в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Конвенцией Совета Европы о защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (ЕС ратифицировали в 1998 году) и германский закон, относящихся к использование позвоночных животных в научных исследованиях.

1. Подготовьте DTT и 100-кратное ингибитор протеазы смесь в соответствии с 1.2.3 и 1.2.4. Растворите цитохалазином до конечной концентрации 10 мг / мл в ДМСО, аликвоты (10 мкл или 20 рекомендуется) и хранят при -20 ° С.
2. Растворите циклогексимид до конечной концентрации 20 мг / мл в этаноле, аликвоты (500 мклрекомендуемый) и хранят при -20 ° С. Растворить кальциевый ионофор А23187 в конечной концентрации 2 мг / мл в этаноле аликвоты и хранят при -20 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: PI, DTT, цитохалазин, циклогексимид и А23187 может быть повторно замораживать и оттаивать.
3. Подготовка 20x модифицированным буфером Марка Рингера (MMR), содержащий 2 М NaCl, 40 мМ KCl, 20 мМ MgCl _2, 40 мМ CaCl _2, 2 мМ ЭДТА и 100 мМ Hepes, доведения рН до 8,0 с 5 N КОН.
   Примечание: 20x MMR может быть в течение длительного времени при комнатной температуре. В зависимости от количества яиц, в течение одного подготовки интерфазовыми экстракт яйцо 1 л 1x MMR в закачиваемой лягушки и дополнительных 5-10 литров для этапов промывки необходимо. Отрегулируйте рН 1x MMR до 8,0 с 5 N КОН. 1x MMR готовы держать лягушек в O / N х 1 должны быть при комнатной температуре. 1x MMR готовы для приготовления экстракта должна быть холодной, пока он не используется, однако это не критично для эксперимента, что 1x MMR очень холодно.
4. Подготовка 1 л Sucвыросли буфера, содержащего 250 мМ сахарозы, 50 мМ KCl, 2,5 мМ _MgCl 2 и 10 мМ Hepes, рН 7,5. Сахароза буфера должен быть подготовлен день перед использованием стерильной воде и должны храниться при температуре 4 ° С.
5. Подготовка dejellying решение недавно утром эксперимента путем растворения 2% L-цистеин в 0.25x MMR. Отрегулируйте рН до 7,8 с 5 N КОН. Хранить при температуре 4 ° С до тех пор, пока используется.

5. Protocolfor интерфазовыми Xenopu сек Laevis Яйцо экстракт

1. Вводите 120 IE беременной кобылы сыворотке гонадотропина (PMSG) в спинной лимфатический мешок каждого лягушки 3-10 дней до начала эксперимента (5 мл шприцы, 27 G ¾ '' иглы).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция будет вызывать овуляцию. Количество яиц одной лягушки лежит зависит многое. Хорошо укладки лягушка может производить яйца, занимающих объем до 7 мл после де-jellynated что соответствует до 3,5 мл сырого экстракта. Тем не менее, считают, что некоторые лягушки не может лежать или будет лау плохих яйца.
2. Вводите 500 IE хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) за лягушки вечером перед экспериментом (5 мл шприцев, 27G ¾ '' иглы). Это будет стимулировать выпуск яиц. Держите лягушек для 13-17 ч при 18 ° С в отдельных резервуарах, содержащих 1,2 л 1x MMR (рН 8).
3. Сбор яиц путем заливки их в 600-1000 мл стеклянные стаканы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Возьмите только хорошие партии яиц, которые индивидуально установленными, аналогичных по размеру и четко пигментированных темно и светло-цветной половине. Не принимайте яйца, которые образуют строки или что смотреть одутловатым и белый. Они должны быть отсортированы по всей процедуры с использованием пластиковой пипетки Пастера. Для более подробного описания хороших против плохого яиц видеть Гиллеспи и др. ⁶
4. Вымойте яйца интенсивно, примерно в 4 раза, с 1x MMR декантацией супернатант, когда яйца успокоился и заправки стакан свежей буфера впоследствии.
   Обратите вниманиеЯйца являются стабильными, прежде чем они dejellynated и промывочный буфер могут быть непосредственно применены на яйца.
5. Dejellynate яйца путем инкубации в 2% -ном растворе цистеина. Изменить буфер сразу же после 2-4 мин отстаивают буфер и тщательно заполняя стакан свежей буфера. Considerdejellying завершена, когда объем яиц резко падает, и яйца становятся более плотно упакованы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: dejellying нуждается примерно 5-7 мин и должна быть остановлена, когда видно, но не позднее чем через 10 мин.
6. Вымойте яйца примерно в 4 раза с 1x MMR декантацией и заправки буфера супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Яйца являются более хрупкими после того, dejellynated и, следовательно, шаги стиральные необходимо сделать более тщательно. КМС следует промыть, а на стенке стакана, а не непосредственно на яйца.
7. Активация яйца в 100 мл 1x MMR добавлением 8 мкл ионофора кальция (2 мг / мл в этаноле). Стоп активации, когда сокращение животное крышка будетприходит видимым или через 10 мин.
   Примечание: Сокращение животное колпачок может быть идентифицирована путем уплотнения черного половине яйца.
8. Вымойте тщательно 4 раза 1x MMR декантацией и заправки буфера супернатант.
9. Выдержите яйца в течение 20 мин в 1x MMR при комнатной температуре.
10. Подготовка центрифужные пробирки в течение времени инкубации: Место 50 мкл сахарозы буферные, 50 мкл 100-кратного смесь ингибиторов протеаз, 5 мкл 1 М ДТТ, 12,5 мкл циклогексимид (чтобы предотвратить перевод, особенно циклин B) и 2,5 мкл цитохалазином (с предотвращения полимеризации актина) в 5 мл центрифужные пробирки (13 х 51 мм). Кроме того, для более чем 30 мл яйца, 14 мл пробирки (14 х 95 мм) могут быть использованы, в этом случае объемы увеличения в 2,4 раза.
11. Вымойте яйца дважды холодной сахарозы буфера (сцеживать и пополнения буфера в стеклянный стакан) и передать их в центрифужные пробирки с помощью пластиковой пипетки Пастера с широким отверстием (отрезать узкий конец).
12. Пакетяйца на спиннинг в течение 1 мин при 130 х г. Поместите трубы в 15 мл конических центрифужных пробирках для этой цели (поместить в 14 мл пробирки в 50 мл конических центрифужных пробирках, соответственно). Цель состоит в том, чтобы удалить как можно больше буфер, насколько это возможно, чтобы предотвратить разбавление экстракта. После центрифугирования, удалить избыток буфера с помощью пластиковой пипетки Пастера и в конечном итоге заполнить больше яиц на вершине.
13. Спина в 6 х 5 мл качели ротора в течение 20 мин при 21000 мкг при 4 ° С.
14. Удалить низкую скорость, используя экстракт 5 мл шприц с 16 G 1 ½ '' иглы, между желтым желтком сверху и темно-Разбитое яйцо мусора на дне. Для этого, нажмите на иглу шприца через стенку центрифужную пробирку чуть выше слоя сломанной яйцо мусора в нижней части. Держите трубку против сопротивления при нажатии с иглой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Заполненный 5 мл центрифугирования трубку дает между 1,8-2,5 мл экстракта.
15. За 1 мл экстракта добавить 10 мкл 100-кратного ингибитор протеазы смеси, 1 мкл1 М DTT, 2,5 мкл циклогексимид (20 мг / мл) и 0,5 мкл цитохалазином (10 мг / мл). Держите экстракт на льду.
    Примечание: Экстракт может быть либо непосредственно использовать для эксперимента или аликвоты, быстро замораживают и хранят в жидком азоте в течение нескольких месяцев. Замораживание экстракт снизится свою деятельность. Для тонких экспериментов, как immunodepletion настоятельно рекомендуется немедленно использовать свежий экстракт.

6. Подготовка буферов для In Vitro восстановление хроматина деконденсацию

1. Подготовьте энергетическом балансе исходного раствора, содержащего 25 мМ АТФ, 25 мМ GTP, 127,5 мг / мл креатина фосфата и 2,5 мг / мл креатинкиназы в буфере, содержащем 250 мМ сахарозы, 1,2 мМ Hepes, 5,9 мМ KCl и 0,3 мМ _MgCl 2. Алиготе и хранить при температуре -80 ° C. Используйте недавно после оттаивания, не замораживать.
2. Растворить 0,2 г / мл гликогена в деионизированной воде. Хранить при -20 ° C. Растворить 6-диметил аминопурином (DMAP) до конечной концентрации0,25 М в ДМСО. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. Используйте недавно после оттаивания, не замораживать.
3. Готовят 30% (вес / объем) сахарозы в PBS, фильтруют и хранят при температуре 4 ° С. Подготовьте 4% раствор, содержащий 80 VikiFix мм Трубы рН 6,8, 1 мМ MgCl _2, 150 мМ сахарозы и 4% параформальдегида (PFA) (ВНИМАНИЕ! Работать под капотом химической, носить перчатки и защиту рту).
   ПРИМЕЧАНИЕ: PFA трудно растворим, поэтому рекомендуется делать это так: На 1 л Вики-Fix распустить 24,2 г труб и 40 г PFA в отдельных стаканах, как в горячей (почти кипяток) деионизированной воды. Оба будут растворяться путем добавления 10 N NaOH, но будьте осторожны, чтобы не добавлять слишком много. Добавить 51,4 ​​г сахарозы и 1 мл 1 М _MgCl 2 в растворе PFA. Добавить трубы решение другой смеси. Заполните до 1 л конечного объема и доведения рН до нейтрального путем добавления NaOH.
4. Растворите 10 мг / мл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) в воде (Внимание! В перчатках). Хранить втемноте при -20 ° С.

7. Протокол In Vitro восстановление хроматина деконденсацию

1. Спин низкой скорости интерфазовыми экстракт в течение 12 мин при 386000 х г в фиксированным углом 20 х 0,2 мл или 355 мкг 000 в роторе 10 х 2,0 мл.
2. Осторожно удалить липидный слой поверх с помощью вакуумного насоса или пипетки и принимать супернатант (далее называемый высокой скорости экстракт) предотвращения загрязнения мембраны из нижнего слоя и отбросить гранул.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для уменьшения возможного загрязнения мембраны желательно, чтобы спина экстракт дважды или разбавить экстракта 20% от объема буфера с сахарозой до центрифугирования. Тем не менее, разбавление и дополнительные стадии центрифугирования может уменьшить активность экстракта.
3. Внесите 18 мкл экстракта высокой скорости в 1,5 мл реакционную трубку, добавить 0,7 мкл митотического кластера (количество может быть слегка изменяться в зависимости от хроматина фондовом концентрации), 0,5 мкл гликогена, 0,5 мклсмесь энергии и 0,3 мкл ДМАП. Использование подсказки с широким отверстием для смешивания реакцию, как только хроматина добавляется для предотвращения сдвиг в decondensing хроматина.
   Примечание: Эту реакцию можно проводить в присутствии или в отсутствие мембраны (смотри рисунок 3). Чтобы decondense хроматина в присутствии мембран, добавить 2 мкл размещенных мембран, полученных в соответствии с протоколом, описанным Eisenhardt др. ¹⁶
4. Инкубируют реакционную смесь в течение 2 ч, чтобы (или меньше, чтобы изучить ранние сроки процесса деконденсацию) при 20 ° С.
5. Закрепить образец добавлением охлажденного льдом 0,5 мл Viki-Фикс, содержащий 0,5% глутарового альдегида и 0,1 мг / мл DAPI и инкубации в течение 20-30 мин на льду.
   Примечание: Если образцы будут дополнительно обработаны для иммунофлуоресценции, фиксация должно быть сделано без глутаральдегида как это часто мешает окрашивания антител. Однако, если только окрашивание DAPI будут проанализированы, добавление перенасыщенияaraldehyde будет сохранить приятнее структуру хроматина.
6. Инкубируйте покровные круглые (диаметр 12 мм) в течение 5 мин с поли-L-лизин раствора для увеличения аффинности покровные с хроматином. Высушите покровные на фильтровальной бумаге после этого.
7. Сборка с плоским дном трубки центрифугированием (6 мл, 16/55 мм), поставив покровные с сайтом покрытием на верхней по нижней части центрифужную пробирку. Добавить 800 мкл 30% сахарозы подушке и слой установленного образца на вершине.
8. Спин в течение 15 мин при 2500 х г при 4 ° С.
   ПРИМЕЧАНИЕ: плоским дном центрифугирования пробирки впору роторов, которые принимают по 15 мл конические центрифужные пробирки.
9. Слейте супернатант, затем снимите покровные из труб, тыкая тщательно дно центрифужную пробирку с 16 г 1 ½ '' иглы шприца. Для этого ленту крышка иглы и сама вместе своими днищами иглы и сократить передний конец крышки так, чтобы игла палочки примерно 3мм из. Когда покровное поднял иглой на одном сайте, использовать пинцет, чтобы удалить покровное.
10. Вымойте покровное быстро опуская его в деионизированной воде, высушить его нежно касаясь его сторону фильтровальной бумаги и поместите его на предметное стекло на капли монтажных средств массовой информации. Печать его с лаком для ногтей, сухость и держать в темноте.
    Примечание: Образцы фиксированные без глутарового альдегида могут быть сохранены в PBS в 24-луночный планшет и используется в дальнейшем для иммунофлуоресцентного. При хранении в течение нескольких дней, добавить 0,05% азида натрия (осторожно!) В перчатках к PBS, чтобы избежать загрязнения с бактериями.
11. Анализ образцов от флуоресцентной микроскопии сигнала DAPI (с использованием, например, конфокальной микроскопии с 405 нм лазером).

8. Подготовка буфера для окрашивания ИММУНОФЛУОРЕСЦЕНТНОГО в пробирке восстановленного хроматина деконденсацию образцов

1. Подготовка PBS в соответствии с 1.1.1. Растворите _NH 4 Cl в плавникааль концентрации 50 мМ в PBS. Держите это решение при 4 ° С. Растворите 5 мкг / мл DAPI в PBS (подготовить свежий). Добавить 0,1% Тритон Х-100 до PBS. Хранить при 4 ° С. Подготовка блокирующего буфера свеже перед использованием путем разбавления 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS + 0,1% Тритон Х-100.

9. Протокол иммунофлюоресцентного окрашивания в пробирке восстановленного хроматина деконденсацию образцов

ПРИМЕЧАНИЕ:. Все следующие инкубации на покровные сделаны в 24-луночного планшета, по крайней мере, 250 мкл раствора на лунку, если не указано иное В пробирке деконденсированным образцы хроматина более чувствительны, чем фиксированные клетки, поэтому будьте осторожны при добавлении или удалении решения. Рекомендуется использовать пластиковые пипетки Пастера сократить угловой. Для стиральных шаги и инкубации вторичного антитела место пластину при комнатной температуре на раскачивание или поворотную платформу, двигаясь не быстрее, чем 100 оборотов в минуту.

1. Quench образцы путем инкубации покровноес с 1 мл _NH 4 Cl в PBS в течение 5 мин. Образцы Блок по инкубации их с 1мл блокирующем буфере в течение по крайней мере 30 мин.
2. Собирают влажную камеру для инкубации с первичным антителом: Поместите мокрой ткани на дне закрываемое коробки и крышки пластины 24-луночного вниз на верхней части мокрой ткани. Поместите парафильмом в крышку и добавить 70 мкл раствора антител в образце по парафином. Для раствора антител, разбавленной антисыворотки или очищенных по принципу сродства антител 1: 100 в блокирующем буфере.
3. Поместите покровные вниз на верхней части раствора антител и инкубируют их в течение от 1 до 2 ч. Поместите покровные обратно в 24-луночный планшет с боковой образца вверх и мыть образцы трижды в течение 10 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
4. Инкубируйте покровные в течение 1 ч при комнатной температуре в 250 мкл вторичного флуоресцентного меченного антитела, разведенного в блокирующем буфере до концентрации, рекомендованной производителем. Защищать от света. Вымойте Четраза EE в течение 10 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
5. Инкубируйте образцы в течение 10 мин с 1 мл 5 мкг / мл DAPI в ФБР. Промыть три раза в течение 5 мин с 1 мл 0,1% Triton X-100 в PBS.
6. Вымойте покровное быстро опуская его в деионизированной воде, высушить его нежно касаясь его сторону фильтровальной бумаги и поместите его на предметное стекло в верхней части капли монтажных средств массовой информации. Печать его с лаком для ногтей, сухость и держать при температуре 4 ° С в темноте, пока не используется. Анализ образцов с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты

Временная зависимость реакции деконденсацию

На рисунке 1 показана типичная временной ход деконденсацию анализа. Кластер хромосом видимых в начале реакции decondenses и сливается в единую, круглые и гладкой ядра. Когда экстракт яйца заменяется сахарозой буфер класт...

Обсуждение

Xenopus Laevis яйцо экстракты являются очень полезным инструментом для точного воспроизведения клеточные процессы в пробирке, и эта система была успешно использована в характеристике клеточного цикла и деления клеток событий ^{2, 3,5,6,17.} В связи с большими запасами ядерных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
spermine tetrahydrochloride	Fluka analytical	85610-25G
spermidine trihydrochloride	Sigma	S2501-5G
high-purity digitonin	Millipore	300410-1GM	toxic
PMSF	Applichem	A0999,0100	toxic
thymidine	Calbiochem	6060
nocodazole	Calbiochem	487928	toxic
37% formaldehyde solution	Roth	7398-1	toxic
trypan blue solution (0.4%)	Sigma	T8154	toxic
1,4-dithiothreitol (DTT)	Roth	6908.2
AEBSF hydrochloride	Applichem	A1421,0001
pepstatin	Roth	2936.1/2/3
leupeptin	Roth	CN334
aprotinin	Roth	A162.3
Percoll (colloidal silica particles solution)	GE Healthcare	17-0891-01
glutamine	Gibco	25030-024
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
75 cm² tissue culture flasks	Greiner Bio-one	658175
heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Gibco	10500-064
Homogenizer (40 ml tissue grinder)	Wheaton	357546
Neubauer chamber	Assistent	441/1
Oak Ridge Centrifuge Tubes, polycarbonate (50 ml)	Nalgene	3118-0050
100 µm cell strainer, nylon	BD Falcon	352360
cytochalasin B	Applichem	A7657,0010	toxic
cycloheximide	Roth	8682.3	toxic
L-cystein	Merck	1,028,381,000
hCG available as Ovogest	MSD	1431593
PMSG available as Intergonan	MSD	1431015
A23187 (mixed calcium-magnesium-salt)	Enzo	ALX-450-002-M010	toxic
syringe needles (1.20 x 40 mm, 18 G x 1 1/2")	Braun	4665120
ATP	Serva	10920.03
GTP, 2 Na x 3 H20	Roth	K056.1/2/3/4
creatine phosphat disodium salt	Calbiochem	2380
creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
DMAP	Sigma	D2629-1G
DAPI	Roche	10236276001
PFA	Sigma	P-6148	toxic
centrifugation tubes for TLA 100 (7 x 10 mm, 5/16 x 13/16 in.)	Beckman Coulter	343775
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 1,000 µl)	Biozym	729065
50% glutaraldehyde solution, grade I	Sigma alderich	G7651-10 ml	toxic
0.1% (w/v) poly-L-lysine solution	Sigma	P8920-100 ml
flat-bottom tubes (6 ml, 16.0/55 mm)	Greiner Bio-one	145211
Vectashield mounting medium	Vector laboratories	H1000
tubes for TLA120 (11 x 34 mm, 7/16 x 1 3/8 in.)	Beckman Coulter	343778
"Cell-Saver" (tips with wide opening, 200 µl)	Biozym	729055
12 mm coverslips	Thermo Scientific	0784 #1