Hasta Dokularda metil-bağlayıcı DNA yakalama Dizi

Özet

Burada bir protokol Metil-Bağlama DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq veya MBD-seq) teknolojisi ve sonraki biyoinformatik analiz boru hattı kullanılarak büyük ölçekli klinik hasta tarama çalışmalarında genom DNA metilasyonu araştırmak için sunuyoruz.

Özet

Metilasyon, farklı doku tiplerinin istikrarlı gelişimi ve farklılaşması için gereken genlerin kesin düzenlenmesinden sorumlu olan DNA, için gerekli epigenetik değişiklikler biridir. Bu sürecin düzensizliği sık sık kanser gibi çeşitli hastalıkların özelliğidir. Burada, son sıralama tekniklerden birini anahat, Metil-Bağlama geniş hasta grupları için çeşitli normal ve hastalık dokularda metilasyonu ölçmek için kullanılan DNA Yakalama sıralama (MBDCap seq). Biz en uygun kantifikasyon ulaşmak için biyoinformatik boru hattı ile birlikte bu afinite zenginleştirme yaklaşımı ayrıntılı bir protokol açıklar. Bu teknik, 1000 methylome projesi (Kanser Methylome sistemi) bir parçası olarak çeşitli kanser türlerinde hastanın yüz sıralamak için kullanılmaktadır.

Giriş

DNA metilasyonu yoluyla gen epigenetik düzenlemesi gövde ^{1 'de,} farklı doku tiplerinin stabil farklılaşması, hücre akıbetini belirlemek için gerekli olan temel mekanizmalardan birisidir. Bu işlemin bozulması kanseri ² de dahil olmak üzere, çeşitli hastalıklara sebep olduğu bilinmektedir.

Bu işlem, esas olarak DNA ³ CpG dinükleotidleri sitozin tortu üzerindeki metil gruplarının eklenmesini içerir. Şu anda birçok çalışmada ^2-8 belirtildiği gibi her biri kendi avantajları olan, bu mekanizmayı araştırmak için kullanılan birkaç farklı teknikler vardır. İşte biz DNA'nın metillenmiş bölgeleri tanımlamak için bir afinite zenginleştirme tekniği kullanmak (MBDCap seq) Metil-Bağlama DNA Yakalama dizi olarak adlandırılan bu tekniklerin birini tartışacağız. Bu teknik, metile CpG ihtiva eden genomik DNA parçaları için ettirecek MBD2 proteininin metil-bağlanma yeteneği üzerine inşa edilmiştir. Bu, ticari bir metillenmiş DNA zenginleştirme kiti kullanmaktadırBu metile bölgelerin izole edilmesi için. Laboratuvarımız bu tekniği kullanarak hasta numunelerinin yüzlerce ekranlı ve burada büyük hasta kohortlarında araştırmak için kullanılabilecek kapsamlı bir optimize protokol sağlamak.

Herhangi bir yeni nesil dizileme teknolojisi ile belirgin olarak, MBDCap seq de doğru örneklerin arasında metilasyon seviyelerini ölçmek amacıyla belirli bir biyoinformatik yaklaşım gerektirir. Sıralama verilerine ^{9, 10} normalleşmesi ve analiz sürecini optimize etmek amacıyla birçok yeni çalışmalar olmuştur. LONUT - - hasta örneklerinin çok sayıda genelinde tarafsız karşılaştırmalar etkinleştirmek için her numunenin doğrusal normalleşme ve ardından bu protokolde, benzersiz bir okuma kurtarma yaklaşımı uygulayan aşağıdaki yöntemlerden birini göstermektedir.

Protokol

Bütün dokular Kurumsal Değerlendirme Kurulu komitesinin onayını takip eden ve elde edilen tüm katılımcılar moleküler analizler ve takip çalışmaları hem rıza zaman. protokoller San Antonio Texas Sağlık Bilimleri Merkezi Üniversitesi'nde İnsan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Metil-DNA bağlama Yakalama (MBDCap)

1. Örnek toplama ve DNA izolasyonu
   1. Hasta parafin doku örneklerinden toplu tümör veya normal doku örnekleri toplamak.
   2. üreticinin protokolüne uygun olarak parafine gömülü doku örneklerinden genomik DNA izole etmek için ticari bir DNA mini kiti kullanarak.
   3. üreticinin protokolüne göre burada açıklanan prosedüre sahip metillenmiş DNA zenginleştirme kiti kullanın.
2. İlk boncuk yıkama
   Not: boncuk genom DNA metilasyonu tespit MBD-Biyotin protein ile çift için kullanılır. Boncuklar genelde askıya alınırstok çözelti içinde. Bu sıvıları yıkayın için aşağıdaki adımları kullanın.
   1. Homojen bir süspansiyon elde etmek için yavaşça yukarı pipetleme streptavidin boncuk (Malzeme Tablo bakınız) stoğunu tekrar süspansiyon ve. vorteks boncuk karışmaz.
   2. Giriş DNA'nın bir ug için, 1 x Cilt / Yıkama Tamponu 90 uL olan bir tüpe tanelerin add10 uL. 1 dakika boyunca çevirin. vorteks karıştırmayınız.
   3. 1 dakika boyunca manyetik rafa (ler) yerleştirin.
   4. Bir pipet ile sıvı çıkarın ve sıvıyı atın.
   5. boncuk 1x Bind / Yıkama Tamponu 250 uL ekleyin ve 1 dakika boyunca döndürün.
   6. iki kere 1.2.5 - Tekrar 1.2.3 adımları.
3. Boncuklar MBD-Biotin proteini Kavrama
   1. giriş DNA 1.2 ug için, her bir tüpe MBD-Biyotin proteininin 7 uL (3.5 ug) ilave edilir.
   2. 100 ul'lik nihai bir hacimde protein 1x bağlama / Yıkama Tamponu 93 uL ekleyin.
   3. Boncuklar-protein karışımı1 saat boyunca oda sıcaklığında bir döner karıştırıcıda karışımı ile gerçekleştirilmektedir.
4. Parçalanmış DNA (giriş)
   1. TE tamponu 96 uL ve 24 uL 5x Bind / yıkama tamponu toplam genomik DNA 1.2 ug ekleyerek sonikasyon DNA 120 uL çözelti yapmak için. 25 kez - 30 s güç AÇIK ve sonication sırasında 30 saniyelik güç KAPALI, 20 kullanın.
   2. üreticinin protokolüne uygun olarak 350 bp - 150 aralığında olması fragmanlarının boyutunu kontrol etmek için ticari bir yüksek hassasiyetli bir DNA kiti ile, bir Bioanalyzer sistemi kullanılarak sonikasyona tabi tutulmuş, DNA solüsyonuna 1 ul çalıştırın.
5. MBD-boncuk yıkayın
   1. 1 dakika için bir manyetik raf MBD-boncuk içeren tüp yerleştirin.
   2. Çıkarın ve boncuk dokunmadan bir pipet ile sıvı atın.
   3. 1x Bind / Yıkama Tamponu 250 mcL boncuk süspanse.
   4. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında bir döner karıştırıcıda boncuk karıştırın.
   5. iki kere 1.5.4 - Tekrar 1.5.1 adımları.
6. Parçalanmış DNA yakalama reaksiyonu (1 ug giriş DNA)
   1. MBD-boncuk içeren tüp DNA / Tampon karışımı aktarın.
   2. Oda sıcaklığında 1 saat için bir döner karıştırıcıda DNA MBD-boncuk karıştırın. Seçenek olarak ise, 4 ^O ° C'de O / N karıştırın
7. Boncuk olmayan yakalanan DNA Çıkarma
   1. 1 dakika borunun iç duvarı üzerinde boncuklar her konsantre için DNA ve MBD-boncuk karıştırdıktan sonra, manyetik rafa yerleştirilir.
   2. Bir pipet yardımıyla süpernatant sıvı çıkarın ve nonmethylated DNA gibi temiz bir DNaz ücretsiz mikrosantrifüj tüp kaydedin. Buz üzerinde bu örnek saklayın.
   3. boncuk yıkamak için boncuk 1x Bind / Yıkama Tamponu 200 uL ekleyin.
   4. 3 dakika için bir döner karıştırıcıda boncuk karıştırın.
   5. 1 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirilir.
   6. Bir pipet ile sıvı çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüp kaydedin.
   7. kapağı içinToplamda 2 daha yıkama fraksiyonları için 1.7.6 - Giriş DNA ≤1 mikrogram tepkilerini Ture, tekrar 1.7.3 yineleyin.
8. Tek fraksiyon yıkama
   1. yüksek tuzlu tampon düşük tuz tamponu karıştırın (1: 1) elüsyon tamponu (1.000 mM NaCI) alır.
   2. elüsyon tamponu (1000 mM NaCI) 200 uL boncuk tekrar.
   3. 3 dakika için bir döner karıştırıcıda boncuk inkübe edin.
   4. 1 dakika boyunca manyetik rafa yerleştirilir.
   5. Manyetik rafa yerinde tüp ile, pipet ile boncuk dokunmadan bir pipet ile sıvı kaldırmak ve temiz bir DNaz-özgür 1.5 mL mikrosantrifüj tüpe kaydedin. Buz üzerinde bu örnek saklayın.
   6. Tekrarlayın 1.8.1 adımları - aynı tüpte ikinci örnek toplama, bir zamanlar 1.8.4 (toplam hacim 400 uL olacaktır). Buz üzerinde toplanmış numune saklayın.
9. Etanol yağış (DNA temizleme)
   1. Her noncaptured, yıkama ve elüsyon fraksiyonu fr içinÖnceki adım OM, 1 pL glikojen ilave (20 ug / kit içerisinde bulunan uL), 3M sodyum asetatın 1/10 örnek hacmi, pH 5.2 (örneğin, 400 başına 40 uL numune uL) ve% 100 2 numune hacimleri etanol (örneğin, 400 800 ul örnek uL). toplam hacmi 1.241 uL olduğunu.
   2. İyice karıştırın ve en azından 2 saat boyunca ^o C -80 ° C'de inkübe edin.
   3. 4 ^O ° C'de 11,363 x g'de 15 dakika boyunca santrifüj tüpü
   4. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant atın.
   5. Soğuk% 70 etanol 500 ul ekle.
   6. 4 ^O ° C'de 11,363 x g'de 5 dakika boyunca tüp santrifüj
   7. Dikkatle pelet bozmadan süpernatant atın.
   8. 1.9.7 kez ve kalan kalıntı süpernatant kaldırmak - Tekrar 1.9.6 adımları.
   9. ~ 5 dakika boyunca pelet hava-kurutun. tamamen pelet kurutmayın.
   10. DNaz-serbest su ya da diğer 37.5 uL DNA pelettampon uygun hacmi.
   11. Buz üzerinde DNA yerleştirin veya -20 ^o C'de ya da altında daha sonra kullanmak kadar DNA saklayın.
   12. DNA toplam tutarı 20 ng üzerinde olup olmadığını kontrol edin (örneğin, florometrik kantitatif sistemi kullanmak, Malzeme Tablo).

2. Sıralama

1. dizileme için MBDCap prosedür elde DNA fragmanları kullanın. Her bir numune, sekanslanacak için, 20 toplam miktarı - 40 ng DNA kütüphanesi hazırlamak için gereklidir.
2. DNA seq kütüphane hazırlığı tam otomatik kütüphane inşaat sistemi kullanmak için (Malzeme Tablo bakınız) ve üretici tarafından sağlanan standart protokol izleyin. Kütüphane hazırlanması için 400 bp - boyutu 200 Select DNA fragmanları. otomasyon kütüphane hazırlama sistemi kütüphane hazırlık prosedürü standartlaştırılması ve bağlı manuel hazırlanması örneklerin arasında varyasyonu minimize sağlar.
3. Kullanım adaptör asalrs ve 100x konsantrasyonu sulandırmak. Bu nedenle, her örnek için 10 uL kullanımı.
4. Adım 2.2 takiben, reaksiyonu almak ve bir florometrik kantitatif sistemi (Malzeme Tablosu) kullanılarak DNA-seq kütüphane ölçmek.
   1. PCR işlemi ayarlayın. PCR Master Mix seçimi genomunun GC zenginleştirilmiş bölgenin PCR etkinliğini arttırmaktır. Bir PCR tüpünde, 15 uL DNA seq kütüphane eklemek, 25 ul PCR master mix (Malzeme Tablosu), 2 uL PCR primer karışımı (Malzeme Tablo bakınız), ve 8 uL H ₂ O
5. Başlangıç maddeleri farklılaşan bisiklet süreleri ve sıcaklıkları değiştirerek PCR Master Mix üreticiden PCR tavsiyesini izleyin: 98 ^o C 45 sn, 15 sn için 98 ^° C'nin, 30 sn için 65 ^° C, 30 72 ^o C'de X döngüleri s, 1 dakika süre ile daha sonra 72 ^o C. 4 ^o C'de tutun
   1. perf(- 10 döngü 8) kütüphane DNA 10 nM - 2 ile bitirmek için yeterli döngüleri kapatýnýz.
6. 1 ile PCR reaksiyonunu temizleyin: Üreticinin protokolüne göre PCR saflaştırma boncuk 1 oranında (Malzeme Tablosu bakınız).
7. 30 uL yıkama tamponu - 20 yıkayın.
8. Bir akış hücresinin bir şeride 4 numune birlikte her bir örnek ve havuz barkod. Sıralama için standart 50 bp tek okuma protokolü (Malzeme Tablosu bakınız) kullanın.

3. Biyoinformatik Analizi

Not: sıralama elde edilen ayrıntılı süreç ham fastq dosyaları kalite kontrolünü yapmak ve genomuna kısa DNA dizileri (okur) haritalama.

1. Kullanım Papyon kısa okumak hizalama, her örnek fastq dosya üzerinde genom haritalama aracı referans genomuna okur eşleştirmek için. Birçok okuma haritalama araçları bu adımı gerçekleştirmek için kullanılabilir ve bireysel tercihinize göre kullanılabilir.
   1. whol 2 uyumsuzlukları kadar izinReferans genomuna eşleme sırasında e okur. Okuma için en iyi 20 saflaşma kadar bildirin. Örneğin, fiyonkunu v 2 --best k 20 --chunkmbs 200 kullanımı.
2. Çarpma eşlenen zenginleştirilmiş bölgelerin tespiti geliştirmek için okuma kurtarmak için LONUT ⁹ kullanın. Her okuma, en fazla bir uyum azından yukarıda adı verilen tepelerin herhangi yeterince yakınken kurtarıldı olacaktır. Örneğin, kullanın: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . LONUT aşağıdaki adımları gerçekleştirir.
   1. Böl hizalamalar benzersiz okur eşlenen ve çarpma okur haritası çizilmiştir. Benzersiz eşlenen Çağrı pik tepe arayan KEMER ¹¹ kullanılarak okur. örnek komutu 250 ve -p 99 -w seçeneği KEMER içindir.
   2. benzersiz eşlenen Kombine LONUT elde okur geri ile okur ve birleştirilen YATAK biçiminde, daha fazla analiz kullanılacak okur. combin sayısını hesaplayıned gelecek normalleşmesi için okur.
3. Bin okur. Özü Perl script kullanarak ilgi bölgede okur: perl methyPipeline.pl -up dn . sampleInfoFile listelenen her yatak dosyası için perl komut aşağıda görevleri gerçekleştirir.
   Not: Perl komut dosyası için ek kodlama dosyasına bakın.
   1. Bin 24 kromozom için, sabit bin boyutu, örneğin, 100 bp okur.
   2. refGeneFile belirtilen her bir gen için, opsiyon-up ve dn ile belirtilen uzanan uzunluğa kadar, transkripsiyon başlama site çevresinde bidonları (TSS) ayıklayın. Örneğin, yukarı ve aşağı TSS 4 kb bölgedeki veri ayıklamak. Bin boyutu 100 bp, bu veriler 81 bidonları var çıkarılan ve merkez bin TSS karşılık gelir.
   3. Soldan sağa doğru yukan depo her zaman için antisens zinciri üzerindeki geni için PLA ekstre bölge çevirmekPerl script ile soldaki ced.
   4. 2 kb akıntıya karşı Sol, yukarı 4 kb;: Diğer üç alt bölgeye TSS ± ​​4 kb bölgesini bölmek Orta, yukarı ve aşağı 2 kb; Sağ, 4 kb 2 kb aşağı.
   5. 3.3.3 hesaplanan okur eşlenen kombine toplam sayısına göre her bin okur her bir numune için, sayım bölün. Örnek özgü ortadan kaldıracak normalleşme farklılıkları okumak ve farklı örnekleri arasında okur karşılaştırmanızı sağlar.
4. sol bölgeden elde okur normalize istatistiki testi gerçekleştirmek için (komut dosyasında belirtildiği gibi) yan bölge olarak tanımlanan bölgelerde normal ve olgu grubu arasında farklı metilasyon tespit etmek, bash komut dosyasını çalıştırın.
   Not: Bash komut dosyası için ek kodlama dosyasına bakın. diferansiyel metillenmiş bölgelerde dayanarak, yedi kombinasyonları vardır:
   Tüm bölge: AKM ± 4 kb bölge genelinde diferansiyel metilasyon
   middleLeft: Her iki orta ve sol bölgede ayırıcı metilasyon
   MiddleRight: Her iki orta ve sağ bölgede diferansiyel metilasyon
   Kanat: Sağ ve sol bölgede diferansiyel metilasyon
   Sol: Sol bölgedeki diferansiyel metilasyon sadece
   Sağ: Sağ bölgede diferansiyel metilasyon sadece
   Orta: orta bölgesinde diferansiyel metilasyon sadece
5. bir kasırga arsa diferansiyel metilasyonu görselleştirmek için aynı bash komut dosyasını kullanın. Ayrı bir panelde hiper ve hipo metile genleri arsa, sırasıyla, 3.4 anlatıldığı gibi bölge kombinasyonunun sırasına göre sıralayın.

Sonuçlar

Bu, diğerleri arasında meme ^12, endometriyal ^13, prostat ¹⁴ ve karaciğer kanseri dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden hasta çok sayıda DNA metilasyonu değişiklikleri çalışma MBDCap seq kullandık. Burada biz son zamanlarda ¹² yayınlanmış meme kanseri çalışmasında bazı bilgileri göstermektedir. Bu durumda, farklı şekilde farklı bir genomik bölgedeki normale göre tümör metile CpG adaları tespit etmek tüm genom sekanslama yaklaşım kullanılır. Araştırma, t...

Tartışmalar

MBDCap seq tekniği hastalar ¹⁵ çok sayıda kohortları araştırılırken maliyetli bir alternatif olarak kabul bir afinite zenginleştirme yaklaşımı ³ vardır. Burada sunulan boru hattı veri analizi ve yorumlanması örnek temininden kapsamlı bir yaklaşım anlatılmaktadır. En önemli adımlardan biri DNA metilasyonu meydana geldiği bu gibi genomunda GC zenginleştirilmiş bölgelerinin PCR verimliliğini artırmak için bir PCR prosedürü kuruyor. Ayrıca, dizi analizi sonrasında, her bir örnek benzersiz...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina