Метил-связывающий захват Секвенирование ДНК для ТКАНЕЙ Patient

Резюме

Здесь мы приводим протокол для исследования генома широкого метилирование ДНК в крупномасштабных клинических исследованиях пациентов скрининга с использованием Метил-Binding ДНК захвата секвенирование (MBDCap-Seq или MBD-Seq) технологии и анализ трубопровода последующих биоинформатики.

Аннотация

Метилирование является одним из основных эпигенетических модификаций ДНК, который отвечает за точное регулирование генов, необходимых для устойчивого развития и дифференциации различных типов тканей. Нарушение регуляции этого процесса часто является признаком различных заболеваний, таких как рак. Здесь мы опишем один из последних методов секвенирования, Метил-Binding ДНК захвата секвенирование (MBDCap-Seq), используемый для количественного определения метилирования в различных нормальных и болезненных тканей для больших когорт пациентов. Мы описываем подробный протокол этого сродства подхода по обогащению наряду с биоинформатики трубопровода для достижения оптимального количественного определения. Этот метод был использован для секвенирования сотни пациентов через различные виды рака, как часть methylome проекта 1000 (Рак системы Methylome).

Введение

Эпигенетическая регуляция генов через метилирование ДНК является одним из основных механизмов , необходимых для определения судьбы клеток путем стабильной дифференциации различных типов тканей в организме ^1. Дисрегуляция этого процесса, как известно, вызывают различные заболевания , включая рак ^2.

Этот процесс в основном включает добавление метильных групп на остатке цитозина в динуклеотидах CpG ДНК ^3. Есть несколько различных методов , используемых в настоящее время для изучения этого механизма, каждый из которых имеет свои преимущества , как описано во многих исследованиях ^2-8. Здесь мы обсудим один из этих методов, называемых Метил-связывающих ДНК Захват секвенирование (MBDCap-сл), где мы используем технологию обогащения сродством для идентификации метилированные области ДНК. Этот метод основывается на метил-связывающую способность белка MBD2 обогащать для геномных фрагментов ДНК, содержащих метилированные сайты CpG. Мы используем коммерческий денатурат набор по обогащению ДНКдля выделения этих метилированных регионов. Наша лаборатория скринингу сотни образцов пациентов, используя эту технику и здесь мы предлагаем комплексный оптимизированный протокол, который может быть использован для изучения больших когорт пациентов.

Как видно с любой технологией секвенирования следующего поколения, MBDCap-сл также требует подхода конкретных биоинформатики для того, чтобы точно определить их уровни метилирования по образцам. Там было много недавних исследований в целях оптимизации процесса нормализации и анализа данных секвенирования ^{9, 10.} В этом протоколе, мы демонстрируем один из этих методов, реализующих уникальный подход для восстановления чтения - LONUT - с последующей линейной нормализации каждого образца, с тем чтобы объективные сравнения между большим количеством образцов пациентов.

протокол

Все ткани получены после одобрения комитета Institutional Review Board, и когда все участники согласились с обеих молекулярных анализов и последующих исследований. Протоколы утверждаются Комитетом по изучению человека в Университете Техаса Научного центра здоровья в Сан-Антонио с.

1. Метил-связывание ДНК захвата (MBDCap)

1. Сбор образцов и выделения ДНК
   1. Сбор объемной опухоли или образцы нормальных тканей от парафином образцов тканей пациента.
   2. Используйте коммерческий набор ДНК мини для выделения геномной ДНК из парафином образцов ткани в соответствии с протоколом производителя.
   3. Используйте метилированный набор по обогащению ДНК с процедурой, описанной здесь, в соответствии с протоколом производителя.
2. Первоначальная мойка шарик
   Примечание: тесьма используются для пары с MBD-биотина белком, который обнаруживает метилирование ДНК на геном. Шарики, как правило, приостановленов маточном растворе. Используйте эти шаги, чтобы смыть эту жидкость.
   1. Ресуспендируют запас стрептавидином гранул (см Материалы таблицу), осторожно пипеткой вверх и вниз до получения однородной суспензии. Не следует смешивать бусы встряхиванием.
   2. За один мкг входной ДНК, add10 мкл шариков в пробирку с 90 мкл 1x Bind / промывочного буфера. Поворот в течение 1 мин. Не следует смешивать встряхиванием.
   3. Поместите пробирку (ы) на магнитной стойке в течение 1 мин.
   4. Удалите жидкость с помощью пипетки и удалите жидкость.
   5. Добавить 250 мкл 1x Bind / промывочного буфера к шарикам и вращаться в течение 1 мин.
   6. Повторите шаги 1.2.3 - 1.2.5 дважды.
3. Муфта белка MBD-биотина к шарикам
   1. Для 1,2 мкг ввода ДНК, добавить 7 мкл (3,5 мкг) белка MBD-биотина в каждую пробирку.
   2. Добавить 93 мкл 1x Bind / промывочного буфера с белком, чтобы сделать окончательный объем 100 мкл.
   3. Смешайте шарики-белоксмесь на вращающемся смесителе при комнатной температуре в течение 1 ч.
4. Фрагментированной ДНК (вход)
   1. Разрушать ультразвуком ДНК путем добавления 1,2 мкг тотальной геномной ДНК в 96 мкл ТЕ-буфера и 24 мкл 5х Bind / промывочного буфера, чтобы сделать раствор 120 мкл. Используйте 30 сек питание и 30 сек питание во время озвучивания, 20 - 25 раз.
   2. Выполнить 1 мкл обработанной ультразвуком раствора ДНК с использованием системы Bioanalyzer с комплектом ДНК коммерческой высокой чувствительности, чтобы проверить размер фрагментов, чтобы быть в диапазоне от 150 - 350 пар оснований в соответствии с протоколом производителя.
5. Вымойте MBD-шарики
   1. Поместите пробирку, содержащую MBD-бусины на магнитной стойке в течение 1 мин.
   2. Удаляют жидкость с пипеткой, не касаясь бусинок.
   3. Ресуспендируют бусины с 250 мкл 1x Bind / промывочного буфера.
   4. Смешайте бусинки на вращающемся смесителе при комнатной температуре в течение 5 мин.
   5. Повторите шаги 1.5.1 - 1.5.4 дважды.
6. Реакцию Fragmented захвата ДНК (1 мкг ДНК ввод)
   1. Перенести смесь ДНК / буфера в пробирку, содержащую MBD-бусинки.
   2. Смешайте MBD-бусинки с ДНК на вращающемся смесителе в течение 1 часа при комнатной температуре. В качестве альтернативы, смешать O / N при 4 ^о С.
7. Удаление без захваченное ДНК из шариков
   1. После смешивания ДНК и MBD-бусинки, поместите трубку на магнитной стойке в течение 1 мин, чтобы сконцентрировать все бусин на внутренней стенке трубки.
   2. Удалить надосадочную жидкость с помощью пипетки и сохранить его в чистом ДНКазой свободной микроцентрифужных трубки в качестве nonmethylated ДНК. Храните этот образец на льду.
   3. Добавить 200 мкл 1x Bind / промывочного буфера к шарикам, чтобы вымыть бисером.
   4. Смешайте бусинки на вращающемся смесителе в течение 3 мин.
   5. Поместите пробирку на магнитной стойке в течение 1 мин.
   6. Удалите жидкость с помощью пипетки и сохранить его в микроцентрифужных трубки.
   7. Для колпачкомTURE реакции ≤1 мкг входной ДНК, повторите шаги 1.7.3 - 1.7.6 для более 2 мытья фракций в общей сложности.
8. Одно фракции элюции
   1. Смешать с низким содержанием соли буфер с высоким содержанием соли буферного раствора (1: 1), чтобы получить буфера для элюции (1000 мМ NaCl).
   2. Ресуспендируют бисером в 200 мкл буфера для элюции (1000 мМ NaCl).
   3. Выдержите бусинки на вращающемся смесителе в течение 3 мин.
   4. Поместите пробирку на магнитной стойке в течение 1 мин.
   5. С помощью трубки в месте на магнитной стойке, удалить жидкость с помощью пипетки, не касаясь бусинок с кончиком пипетки, и сохранить его в чистом ДНКазой свободной 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Храните этот образец на льду.
   6. Повторите шаги 1.8.1 - 1.8.4 один раз, собирая вторую пробу в той же трубе (общий объем будет составлять 400 мкл). Хранить объединенного образца на льду.
9. Этанол осадков (ДНК зачистка)
   1. Каждому noncaptured, промывка и элюирование фракции фром предыдущие шаги, добавить 1 мкл гликогена (20 мкг / мкл, входит в комплект), объем 1/10 образец 3М ацетата натрия, рН 5,2 (например, 40 мкл на 400 мкл образца) и 2 тома выборки из 100% этанол (например, 800 мкл на 400 мкл образца). Общий объем составляет 1,241 мкл.
   2. Хорошо перемешать и инкубировать при температуре -80 ^о С в течение не менее 2 ч.
   3. Центрифуга трубки в течение 15 мин при 11,363 мкг при 4 ^о С.
   4. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул.
   5. Добавить 500 мкл холодного 70% -ного этанола.
   6. Центрифуга трубки в течение 5 мин при 11,363 мкг при 4 ^о С.
   7. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранул.
   8. Повторите шаги 1.9.6 - 1.9.7 один раз и удалите оставшуюся остаточный супернатант.
   9. Высушите осадок в течение ~ 5 мин. Не полностью высушить осадок.
   10. Ресуспендируют осадок ДНК в 37,5 мкл ДНКазы без воды или другихсоответствующий объем буфера.
   11. Поместите ДНК на льду или хранить ДНК при температуре -20 ^° С или ниже до дальнейшего использования.
   12. Проверьте , что общее количество ДНК составляет более 20 нг, (например, использовать флуорометрического систему количественного определения см Материалы таблицу).

2. Секвенирование

1. Используйте фрагменты ДНК, выделенной из процедуры MBDCap для секвенирования. Для каждого образца, чтобы быть секвенирован, а общее количество 20 - 40 нг ДНК необходима для подготовки библиотеки.
2. Для ДНК-сл подготовка библиотеки используют полностью автоматизированную систему строительства библиотеки (см Материалы таблицу) и следовать по стандартному протоколу , поставляемый изготовителем. Выберите фрагменты ДНК размером 200 - 400 пар оснований для подготовки библиотеки. Система подготовки автоматизации библиотек позволяет стандартизировать процедуру подготовки библиотеки и сводя к минимуму колебания между образцов из-за ручного приготовления.
3. Используйте адаптер премьерRS и разбавить до концентрации 100х. Из этого, используют 10 мкл для каждого образца.
4. После этапа 2.2, достают реакцию, и количественно ДНК-сл библиотеку с помощью флуорометрического системы (см количественный материалы таблицу).
   1. Процедура установки ПЦР-амплификации. Выбор Master Mix ПЦР является повышение эффективности ПЦР-GC обогащенные области генома. В ПЦР - пробирку, добавляют 15 мкл ДНК-Seq библиотеки, 25 мкл ПЦР - смеси мастер - микс (см Материалы таблицу), 2 мкл ПЦР - смеси праймера (см Материалы таблицу), и 8 мкл H ₂ O.
5. Следуйте ПЦР рекомендации от производителя мастер - смеси ПЦР, изменяя велосипедного времени и температуры для отличающихся исходных материалов: 98 ^° С в течение 45 с, X циклов 98 ^° С в течение 15 с, 65 ^° С в течение 30 с, 72 ^° С в течение 30 с, а затем 72 ^° С в течение 1 мин. Держите при температуре 4 ^о С.
   1. PerfОРМ достаточно циклов, чтобы в конечном итоге с 2 - 10 нМ библиотеки ДНК (8 - 10 циклов).
6. Очистка реакции ПЦР с соотношением 1: ПЦР - очистки шариков в соответствии с протоколом производителя 1 (См Материалы таблицу).
7. Элюировать 20 - 30 мкл буфера для элюции.
8. Штрих-код каждого образца и бассейн 4 образца в одну полосу клетки потока. Используйте стандартный 50 н.п. один протокол чтения для секвенирования (см Материалы таблицу).

3. Биоинформатика анализ

Примечание: дополнительно обрабатывать сырые fastq файлы, полученные из секвенирования для выполнения контроля качества и отображения коротких последовательностей ДНК (читает) в геном.

1. Использование Боути короткого чтения Согласователь, генома инструмент отображения каждого файла образца fastq для отображения чтений на референсный геном. Многие инструменты для отображения чтения доступны для выполнения этого действия, и могут быть использованы на основе индивидуальных предпочтений.
   1. Разрешить до 2 несовпадений в Wholе читает во время отображения на референсный геном. Доклад до 20 лучших трасс для каждой операции чтения. Например, используйте бабочку -v 2 --best -k 20 --chunkmbs 200 .
2. Используйте LONUT ⁹ для восстановления многократно сопоставляется читает , чтобы улучшить обнаружение обогащенных областей. Для каждой операции чтения, не более одного выравнивания будут восстановлены, когда он находится достаточно близко к любой из вышеперечисленных называемых пиков. Например, используйте: Perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . LONUT будет выполнять следующие шаги.
   1. Split выравнивания в однозначно сопоставляются читает и многократно сопоставляется читает. Вызов на пик однозначно сопоставляются считывает с помощью пикового вызывающему BELT ^11. Опция -w 250 и -p 99 в примере команды предназначены для поясу.
   2. Комбинат однозначно сопоставляются считывает с восстановленными чтений с использованием LONUT, и объединенный читает, в формате BED, будут использованы в дальнейшем анализе. Подсчитать количество Комбенред читает для будущей нормализации.
3. Bin чтений. Экстракт читает в области интереса с помощью Perl скрипт: Perl methyPipeline.pl -до <вверх по течению расширения длина> -dn <вниз по течению расширения длина>. Для каждого файла кровати перечисленных в sampleInfoFile, то выполняет скрипт на Perl ниже задачи.
   Примечание: Смотрите дополнительный файл кодирования для Perl скрипта.
   1. Bin чтений в фиксированный размер бен, например, на 100 базисных пунктов, для 24 хромосом.
   2. Для каждого гена, указанного в refGeneFile, извлечь бункеров вокруг сайта инициации транскрипции (TSS), до протягивания длины, указанной опцией -up и -dn. Например, извлечь данные в регионе, который до и после 4 кб TSS. На бен размер 100 п.н., этот извлеченный данные есть 81 бункеров, а центр бин соответствует TSS.
   3. Для этого гена на антисмысловой цепи, переворачивать выделенной области слева направо, так что вверх по течению мусорные ведра всегда PLACED слева со сценарием Perl.
   4. Далее разделить ± 4 кб область TSS в трех субрегионов: слева, вверх по течению 4 кб до 2 кб вверх по течению; Средний, вверх и вниз по течению 2 кб; Право, вниз по течению 2 кб до 4 кб.
   5. Для каждого образца, разделите количество операций чтения в каждом бункере по общему числу комбинированных сопоставляются чтений рассчитывается в 3.3.3. Нормализация устранит конкретного образца чтения различия и позволяет сравнивать читает в разных образцах.
4. Выполните скрипт Баш (как указано в файле сценария) для выполнения статистического теста на нормализованный чтений с использованием левого области, для обнаружения дифференциального метилирования между нормальной и случайной группе в регионах, описанных как в фланкирующего.
   Примечание: Смотрите дополнительный файл кодирования для сценария Баш. Исходя из регионов, которые по-разному метилированные, есть семь комбинаций:
   Весь регион: дифференциал метилирования по всему ± 4 кб области TSS
   MiddleLeft: дифференциальное метилирование как в средней и левой области
   MiddleRight: дифференциальное метилирование как в средней и правой области
   Пашина: дифференциальное метилирование в левой и правой области
   Слева: дифференциальное метилирование в левой области только
   Справа: дифференциальное метилирование в правой области только
   Средний: дифференциальное метилирование в средней области только
5. Используйте тот же самый Баш скрипт для визуализации дифференциального метилирования в смерча участке. Участок гипер и гипо метилированных генов на отдельной панели, и сортировать в порядке комбинации области, как описано в разделе 3.4, соответственно.

Результаты

Мы использовали MBDCap-SEQ для изучения метилирования ДНК изменения в большом количестве пациентов с различными типами рака молочной железы , включая ^{12, 13} , рак эндометрия, простаты ¹⁴ и рака печени среди других. Здесь мы демонстрируем некоторую информацию из исследования рака молочно...

Обсуждение

Методика MBDCap-сл представляет собой подход , обогащение сродства ^3, рассматривается как экономически эффективную альтернативу при исследовании когорты с большим количеством пациентов ^15. Трубопровод, представленный здесь описывает комплексный подход от закупок образца для анализа и и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina