Methyl-bindende DNA-Capture-Sequenzierung für Patientengewebe

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir ein Protokoll zu untersuchen, genomweite DNA-Methylierung in großem Maßstab klinischen Patienten-Screening-Studien unter Verwendung des Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq oder MBD-seq) Technologie und die anschließende bioinformatische Analyse-Pipeline.

Zusammenfassung

Methylierungs ist eines der wesentlichen epigenetische Modifikationen an der DNA, die für die genaue Regulierung von Genen verantwortlich ist, die für eine stabile Entwicklung und Differenzierung von verschiedenen Gewebetypen. Dysregulation dieses Verfahrens ist oft das Kennzeichen von verschiedenen Krankheiten wie Krebs. Hier haben wir eine der jüngsten Sequenzierungstechniken skizzieren, Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), verwendet Methylierung in für große Patientenkohorten verschiedenen normalen und Krankheit Gewebe zu quantifizieren. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll dieser Affinitätsanreicherung Ansatz zusammen mit einer Bioinformatik Pipeline optimale Quantifizierung zu erreichen. Diese Technik ist verwendet worden Hunderte von Patienten in verschiedenen Krebsarten als Teil der 1000 Methyloms Projekt (Cancer Methylome System) zu sequenzieren.

Einleitung

Epigenetischen Regulation der Gene durch DNA - Methylierung ist eine der wesentlichen Mechanismen erforderlich , um die Zellschicksal durch stabile Differenzierung verschiedener Gewebearten in dem Körper ¹ zu bestimmen. Dysregulation dieses Verfahrens wurde ² verschiedenen Krankheiten einschließlich Krebs zu verursachen bekannt.

Dieses Verfahren umfasst im Wesentlichen die Zugabe von Methylgruppen auf dem Cytosin - Rest in der CpG Dinukleotide DNA ^3. Es gibt verschiedene Techniken , die derzeit diesen Mechanismus zu untersuchen, die jeweils ihre eigenen Vorteile, wie ^2-8 in vielen Studien beschrieben. Hier werden wir eine dieser Techniken diskutieren namens Methyl-Bindung DNA Capture-Sequenzierung (MBDCap-seq), wo wir eine Affinität Anreicherungsmethode verwenden, um methylierte Bereiche der DNA zu identifizieren. Diese Technik baut auf dem methyl-Bindungsfähigkeit des MBD2-Proteins für die genomische DNA-Fragmente enthalten, methylierte CpG-Stellen zu bereichern. Wir verwenden eine kommerzielle methylierte DNA-Anreicherung Kitfür die Isolierung dieser methylierten Regionen. Unser Labor hat Hunderte von Patientenproben mit dieser Technik gezeigt und hier bieten wir ein umfassendes optimiertes Protokoll, das verwendet werden kann große Patientengruppen zu untersuchen.

Wie sich bei jeder Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation erfordert MBDCap-seq auch einen spezifischen Ansatz der Bioinformatik, um das Niveau der Methylierung in den Proben genau zu quantifizieren. Es wurden in dem Bemühen viele neuere Studien, die Normalisierung und Analyseprozess der Sequenzierungsdaten ^{9, 10} zu optimieren. In diesem Protokoll zeigen wir eine dieser Methoden eine einzigartige Lese Recovery-Ansatz der Umsetzung - LONUT - gefolgt von linearen Normalisierung jeder Probe, um unvoreingenommene Vergleiche über große Anzahl von Patientenproben zu ermöglichen.

Protokoll

Alle Gewebe erhalten nach der Zustimmung des Institutional Review Board Ausschuss und, wenn alle Teilnehmer zugestimmt sowohl der molekularen Analysen und Follow-up-Studien. Die Protokolle werden von der Human Studies Committee an der University of Texas Health Science Center in San Antonio genehmigt.

1. Methyl-bindende DNA-Capture (MBDCap)

1. Probenentnahme und DNA - Isolierung
   1. Sammeln Sie Bulk-Tumor oder normalen Gewebeproben von Patienten Paraffingewebeproben eingebettet.
   2. Verwenden Sie einen handelsüblichen DNA-Mini-Kit an genomische DNA aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben isolieren dem Protokoll des Herstellers nach.
   3. Verwenden Sie eine methylierte DNA Anreicherung Kit mit dem hier beschriebenen Verfahren nach dem Protokoll des Herstellers.
2. Anfängliche Wulst Wasch
   Anmerkung: Die Perlen werden verwendet, um Paare mit MBD-Biotin-Protein, das auf dem Genom DNA Methylierungs erkennt. Perlen sind in der Regel ausgesetztin einer Stammlösung. Verwenden Sie diese Schritte, um diese Flüssigkeit zu waschen.
   1. Resuspendieren der Bestand an Streptavidin - Kügelchen (siehe Materialien Table) durch vorsichtiges Pipettieren nach oben und unten um eine homogene Suspension zu erhalten. Sie nicht die Perlen durch Vortexen mischen.
   2. Für eine ug Input-DNA, ADD10 ul Kügelchen in ein Röhrchen mit 90 & mgr; l 1x Bind / Waschpuffer. Drehen Sie für 1 min. Lassen Sie sich durch Verwirbelung mischen.
   3. Das Röhrchen (en) auf einem Magnetträger für 1 min.
   4. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und entsorgen Sie die Flüssigkeit.
   5. In 250 ul 1x Bind / Waschpuffer in den Perlen und drehen für 1 min.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.2.3 - 1.2.5 zweimal.
3. Die Kopplung des MBD-Biotin - Protein an die Kügelchen
   1. 1,2 ug Input DNA, fügen 7 ul (3,5 ug) des MBD-Biotin-Protein zu jedem Röhrchen.
   2. Hinzuzufügen 93 ul 1x Bind / Waschpuffer mit dem Protein um ein Endvolumen von 100 & mgr; l zu machen.
   3. Mischen Sie die Perlen-ProteinMischung auf einer 1 h bei RT Rotationsmischer.
4. Fragmentierte DNA (Eingang)
   1. Beschallte DNA durch Zugabe von 1,2 & mgr; g genomische Gesamt-DNA in 96 ul TE-Puffer und 24 & mgr; l 5x Bind / Waschpuffer mit einem 120 & mgr; l Lösung herzustellen. Verwenden Sie 30 s Power ON und 30 s Leistung AUS während der Beschallung, 20 bis 25 mal.
   2. Führen Sie 1 ul beschallt DNA-Lösung ein Bioanalyzer System mit einem kommerziellen hoher Empfindlichkeit DNA-Kit mit der Größe der Fragmente zu prüfen, im Bereich von 150 bis sein - 350 bp nach dem Protokoll des Herstellers.
5. Waschen Sie die MBD-Perlen
   1. Das Röhrchen enthält MBD-Perlen auf einem Magnetträger für 1 min.
   2. Entfernen und entsorgen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen zu berühren.
   3. Resuspendieren der Kügelchen mit 250 & mgr; l 1x Bind / Waschpuffer.
   4. Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer bei RT für 5 min.
   5. Wiederholen Sie die Schritte 1.5.1 - 1.5.4 zweimal.
6. Fragmentierte DNA - Capture - Reaktion (1 ug Input - DNA)
   1. Übertragen Sie die DNA / Puffer-Gemisch in das Röhrchen die MBD-Perlen enthält.
   2. Mischen Sie die MBD-beads mit der DNA auf einem Rotationsmischer für 1 h bei RT. Alternativ bei 4 ^o C O / N mischen
7. Entfernen von nicht-eingefangen - DNA aus den Beads
   1. die DNA und MBD-beads, das Reagenzglas auf dem Magnetzahnstange nach dem Mischen für 1 min alle der Wülste an der Innenwand des Rohres zu konzentrieren.
   2. Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-freie Mikrozentrifugenröhrchen als nichtmethylierten DNA. Bewahren Sie diese Probe auf Eis.
   3. In 200 ul 1x Bind / Waschpuffer an die Kügelchen die Perlen zu waschen.
   4. Mischen Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min.
   5. Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min.
   6. Entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette und speichern Sie sie in einem Reaktionsgefäß.
   7. Für die GAP-ture Reaktionen von ≤1 ug Input-DNA, wiederholen Sie die Schritte 1.7.3 - 1.7.6 für 2 weitere Waschfraktionen insgesamt.
8. Einzel Fraktion Elution
   1. Mischen Sie salzarme Puffer mit hohem Salzpuffer (1: 1) Elutionspuffer zu erhalten (1000 mM NaCl).
   2. Resuspendieren der Kügelchen in 200 & mgr; l Elutionspuffer (1000 mM NaCl).
   3. Inkubieren Sie die Perlen auf einem Rotationsmischer 3 min.
   4. Das Röhrchen wird auf dem Magnetträger für 1 min.
   5. Mit dem Rohr an Ort und Stelle auf dem Magnetträger, entfernen Sie die Flüssigkeit mit einer Pipette, ohne die Perlen mit der Pipettenspitze berühren, und speichern Sie sie in einem sauberen DNase-frei 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie diese Probe auf Eis.
   6. Wiederholen Sie die Schritte 1.8.1 - 1.8.4 einmal, die zweite Probe in der gleichen Sammelrohr (wird Gesamtvolumen 400 & mgr; l sein). Bewahren Sie die Sammelprobe auf Eis.
9. Ethanolfällung (DNA Cleanup)
   1. Jedem noncaptured, waschen und Elutionsfraktion from die vorherigen Schritte, fügen 1 ul Glykogen (20 ug / ul, im Bausatz enthalten), 1/10 Probenvolumen von 3 M Natriumacetat, pH 5,2 (zB 40 & mgr; l pro 400 & mgr; l der Probe) und 2 Probenvolumina von 100% Ethanol (zB 800 & mgr; l pro 400 & mgr; l der Probe). Das Gesamtvolumen beträgt 1.241 & mgr; l.
   2. Gut mischen und Inkubation bei -80 ^° C für mindestens 2 h.
   3. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 15 Minuten bei 11.363 × g bei 4 ^o C
   4. verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.
   5. In 500 & mgr; l kaltem 70% Ethanol.
   6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen für 5 Minuten bei 11.363 × g bei 4 ^o C
   7. verwerfen Überstand vorsichtig, ohne das Pellet zu stören.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 1.9.6 - 1.9.7 einmal und entfernen Sie alle verbleibenden Restüberstand.
   9. Der Luft trocknen das Pellet für ~ 5 min. Nicht ganz das Pellet trocknen.
   10. Resuspendieren DNA-Pellet in 37,5 ul DNase-freiem Wasser oder andereentsprechende Volumen des Puffers.
   11. Legen Sie die DNA auf Eis oder lagern Sie die DNA bei -20 ^° C oder darunter bis zur weiteren Verwendung.
   12. Überprüfen Sie, dass die Gesamtmenge an DNA über 20 ng, (zB verwenden fluorimetrischen Quantifizierung System, siehe Materialien Tabelle).

2. Sequenzierung

1. Verwenden Sie die DNA-Fragmente aus MBDCap Verfahren zur Sequenzierung gewonnen. Für jede Probe wurden sequenziert werden insgesamt 20 bis 40 ng DNA wird für Bibliotheks Vorbereitung erforderlich.
2. Für die DNA-seq Bibliothek Vorbereitung eine vollautomatisierte Bibliothek Bausystem verwenden (siehe Werkstoff - Tabelle) und das Standardprotokoll des Herstellers folgen. Wählen Sie DNA-Fragmente mit einer Größe von 200 bis 400 bp für Bibliothek Vorbereitung. Die Automatisierung Bibliothek Vorbereitungssystem ermöglicht die Bibliothek Herstellungsverfahren zu standardisieren und die Unterschiede zwischen den Proben durch manuelle Vorbereitung minimiert wird.
3. Verwenden Adapter primers und 100x Konzentration verdünnen. Davon verwenden 10 & mgr; l für jede Probe.
4. Nach dem Schritt 2.2, nehmen Sie die Reaktion aus, und Quantifizierung der DNA-seq Bibliothek eine fluorometrische Quantifizierungssystem (siehe Materialien Tabelle).
   1. Richten Sie die PCR-Amplifikation Verfahren. Die Wahl der PCR-Master-Mix ist die PCR-Effizienz von GC angereicherten Bereich des Genoms zu verbessern. In einem PCR - Röhrchen werden 15 & mgr; l DNA-seq Bibliothek, 25 & mgr; l PCR - Master - Mix (siehe Werkstoff - Tabelle), 2 Primermix ul PCR (siehe Materialien Tabelle) und 8 & mgr; l H ₂ O
5. Folgen PCR Empfehlung des Herstellers des PCR - Mastermix, Zykluszeiten verändert und die Temperaturen für unterschiedliche Ausgangsmaterialien: 98 ^o C für 45 s, X Zyklen von 98 ^o C für 15 s, 65 ^° C für 30 s, 72 ^° C für 30 s, und dann 72 ^o C für 1 min. Halten bei 4 ^o C
   1. Perform genug Zyklen mit 2 bis am Ende - 10 nM von Bibliotheks-DNA (8 - 10 Zyklen).
6. Clean up PCR - Reaktion mit 1: 1 - Verhältnis von PCR - Reinigungs - Perlen gemäß dem Protokoll des Herstellers (siehe Werkstoff - Tabelle).
7. Eluieren mit 20 - 30 & mgr; l Elutionspuffer.
8. Barcode-jede Probe und Pool 4 Proben zusammen in eine Spur einer Durchflusszelle. Verwenden Sie die Standard - 50 bp einzelnen Lese Protokoll für die Sequenzierung (siehe Materialien Tabelle).

3. Bioinformatik-Analyse

Hinweis: Weitere Verfahren die rohen fastq Dateien aus der Sequenzierung erhaltenen Qualitätskontrolle durchführen und das Mapping der kurze DNA-Sequenzen (liest) auf dem Genom.

1. Verwenden Sie Bowtie kurze Lese Aligner, Genom Mapping-Tool auf jeder Probe fastq Datei zu verbinden das liest auf dem Referenzgenom. Viele Lese-Mapping-Tools zur Verfügung, diesen Schritt auszuführen und auf den individuellen Vorlieben verwendet werden.
   1. Es kann bis zu zwei Fehlpaarungen in der whole liest, während die Zuordnung zu dem Referenzgenom. Bericht bis zu 20 besten Ausrichtungen für jeden zu lesen. Verwenden Sie zum Beispiel Bowtie -V 2 --bester -k 20 --chunkmbs 200 .
2. Verwenden LONUT ⁹ zurückzufordern multiply kartiert liest die Detektion der angereicherten Regionen zu verbessern. Für jede Lese, höchstens eine Ausrichtung würde wiederhergestellt werden, wenn es sich nahe genug an einer der oben genannten Spitzen. Verwenden Sie zum Beispiel: perl lonut.pl -g hg19 -w 250 -p 99 . LONUT werden die folgenden Schritte durchführen.
   1. Split Ausrichtungen in eindeutig liest abgebildet und mehrfach liest abgebildet. Anruf Peak auf der eindeutig abgebildet liest mit Spitzen Anrufer Band ^11. Die Option -w 250 und -p 99 im Beispielbefehl für Gürtel.
   2. Combine eindeutig abgebildet liest mit der wiedergewonnene liest aus LONUT erhalten, und die kombinierten liest im Bett Format wird in die weitere Analyse verwendet werden. Berechnen Sie die Anzahl der combined liest für zukünftige Normalisierung.
3. Bin das liest. Auszug liest in der Region von Interesse Perl-Skript: perl methyPipeline.pl -up dn . Für jedes Bett-Datei im sampleInfoFile aufgeführt, führt das Perl-Skript die folgenden Aufgaben.
   Hinweis: Siehe ergänzende Codierung Datei für das Perl-Skript.
   1. Bin das liest in fixed bin Größe, zB 100 bp, 24 Chromosomen.
   2. Für jedes Gen in refGeneFile angegeben, extrahieren die Behälter um Transkriptionsstartstelle (TSS), bis zur Verlängerung Länge von Option -up und -dn angegeben. Extrahieren Sie beispielsweise die Daten in der Region, die vor- und nachgelagerten 4 kb von TSS ist. Bei Bingröße 100 bp, extrahiert diese Daten haben 81 Bins und das Zentrum bin entspricht der TSS.
   3. Für das Gen auf dem Antisense-Strang, drehen Sie den extrahierten Bereich von links nach rechts, so dass vorgeschalteten Behälter immer sind pladie linke Seite mit dem Perl-Skript ced auf.
   4. Ferner teilen die TSS ± ​​4 kb-Region in drei Teilbereiche: Links, Upstream 4 kb 2 kb stromaufwärts; Mittel, die vor- und nachgelagerten 2 kb; Richtig, Downstream 2 kb bis 4 kb.
   5. Für jede Probe, teilen Sie die Anzahl der in jedem Fach liest durch die Gesamtzahl der kombinierten in 3.3.3 berechnet abgebildet liest. Die Normalisierung wird die Probe spezifische lesen Unterschiede zu beseitigen und erlaubt es dem liest in verschiedenen Proben zu vergleichen.
4. Führen Sie die Bash-Skript (wie in der Skriptdatei angegeben) statistischer Test auf der normalisierten auszuführen liest aus dem linken Bereich erhalten, Differential-Methylierung zwischen normalen und Fallgruppe in den Regionen wie im Flankenbereich beschrieben zu erfassen.
   Hinweis: Siehe die zusätzliche Codierung Datei für die Bash-Skript. Basierend auf den Bereichen, die differenziell methyliert sind, gibt es sieben Kombinationen:
   Ganze Region: Differential-Methylierung während des TSS ± ​​4 kb-Region
   middleLeft: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und linken Bereich
   Middle: Differential-Methylierung in den beiden mittleren und rechten Bereich
   Flank: Differential-Methylierung in linke und rechte Region
   nur Differential-Methylierung in der linken Region: links
   Rechts: Differential-Methylierung in der rechten Region nur
   nur Differential-Methylierung in der mittleren Region: Mittel
5. Verwenden Sie die gleiche Bash-Skript, das Differential-Methylierung in einem Tornado Plot zu visualisieren. Zeichnen Sie die Hyper- und Hypo methylierte Gene auf einer separaten Platte, und in der Reihenfolge der Region Kombination sortieren, wie in 3.4 beschrieben sind.

Ergebnisse

Wir haben MBDCap-seq verwendet , um DNA - Methylierungs Veränderungen in einer großen Anzahl von Patienten , die an verschiedenen Krebsarten einschließlich Brust- ^12, endometrial ^13, der Prostata ¹⁴ und Leberkrebs unter anderem studieren. Hier zeigen wir einige Informationen aus der Studie Brustkrebs vor kurzem ¹² veröffentlicht. In diesem Fall haben wir das gesamte Genom-Sequenzierung Ansatz zu CpG-Inseln zu identifizieren, die in den normalen bezüglich der Tumor in verschiedenen genomischen...

Diskussion

Die MBDCap-seq - Technik ist eine Affinitätsanreicherung Ansatz ³ als kostengünstige Alternative angesehen , wenn Kohorten mit einer großen Anzahl von Patienten ¹⁵ zu untersuchen. Die Pipeline präsentiert hier beschreibt einen umfassenden Ansatz von der Probenbeschaffung bis zur Datenanalyse und Interpretation. Einer der wichtigsten Schritte setzt ein PCR-Amplifikationsverfahren, um die Effizienz der PCR GC angereicherte Regionen in dem Genom zu verbessern, da dies ist, wo die DNA-Methylierung stattfindet. Auch ist...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Methylminer DNA enrichment Kit	Invitrogen	ME10025
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	112-05D
Bioruptor Plus Sonication Device	diagenode	B01020001
3 M sodium acetate, pH 5.2	Sigma	S7899	100 mL
SPRIworks Fragment Library System I	Beckman Coulter	A50100	Fully automated library construction system
Adapter Primers	Bioo Scientific	514104	PCR primer mix
Qubit	Invitrogen	Q32854	Fluorometric Quantitation System
PCR master mix	KAPA scientific	KK2621	PCR master mix
AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	PCR Purification beads
EB Buffer	Qiagen	19086
HiSeq 2000 Sequencing System	Illumina