Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

Özet

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Özet

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.

The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

Giriş

Hidrojeller, doğal ya da sentetik, ve ayırt edici bir üç boyutlu bir yapı ile karakterize olan, hidrofilik, çapraz-bağlanmış polimerler, ile oluşturulan üç boyutlu ağlardır. Bu cihazlar, ilaç dağıtım, doku mühendisliği, gen taşıyıcıları ve akıllı sensörler ^1,2 biyomedikal alanlarında giderek daha caziptir. Gerçekten de, yüksek su içeriği, aynı zamanda bunların reolojik ve mekanik özellikleri onları yumuşak doku mikroçevrelerde taklit eden ve suda çözünür sitokin ya da büyüme faktörü verilmesi için onları etkili araçlar yapmak için uygun bir aday yapar. En umut verici bir kullanım hücreleri ve biyoaktif bileşikler taşıyan bir enjektabl biyomateryal gibidir. In vitro ve in vivo deneyler ^3,4 de görüldüğü gibi Hidrojeller, tutma ve hassas fizyolojik ilgili bir şekilde kök hücre düzenleyici sinyallerini sağlayan hücre hayatta kalma ve kontrol kök hücre kaderine iyileştirebilir. Bu lider avantajı olasılıktırvücudun her yerinde göç ve hedef gol ⁵ kaybetme, dolaşım torrent içine alan ve extravasates bırakır hücrelerin miktarını en aza indirerek, (in situ) aşılama bölgesi içinde enjekte hücreleri korumak için. Üç boyutlu hidrojel ağların stabilite polimer zincirleri ⁶ arasındaki kovalent bağ ya da bir arada tutma kuvvetlerinden oluşan olan çapraz-bağlama yerleri, kaynaklanmaktadır.

Bu çerçevede, ortogonal seçici kimya polimer zincirleri uygulanan hidrojel performanslarını ⁷ geliştirmek mümkün çok yönlü bir araçtır. Gerçekten de, uygun bir kimyasal grup ile polimerlerin modifikasyonu hücre canlılığı ve doku oluşumu kullanımlarını artırmak için, uygun kimyasal, fiziksel ve mekanik özellikleri sağlamak için yardımcı olabilir. Aynı şekilde, teknikler arasında RGD peptidin kullanımı hücre yapışması ve hayatta kalma mümkün kılmaktadır, jel matris, hücreler ya da büyüme faktörleri yükleyin. RGD oluşan bir tripeptidegereğidir arginin, glisin ve aspartik asit, en etkili ve çoğu zaman, birden fazla hücre yapışma reseptörüne yönelik kabiliyetini ve hücre ankraj, davranış ve hayatta kalma ^8,9 ilgili biyolojik etkisi tripeptid kullanılabilir. Bu çalışmada, RGD işlevselleştirilmiş hidrojellerin sentezi dostça bir hücre mikro için yeterli biyokimyasal karakterize ağları bir amacı ile incelenmiştir.

Hidrojel sentezinde mikrodalga radyasyonunun kullanımı yan reaksiyonların en aza indirmek ve konvansiyonel termal proseslerin ¹⁰ ile karşılaştırıldığında daha kısa bir süre içinde daha yüksek reaksiyon verimleri ve oranları elde etmek için basit bir prosedür sunmaktadır. Bu yöntem, polimer etkileşimleri ve reaksiyon sisteminde ¹¹ bir organik çözücü olmaması nedeniyle saflaştırma adımları ve verimi, steril hidrojeller gerektirmez. Bu nedenle, hiçbir mod çünkü polimerik ağ bağlantılı RGD yüksek oranlarda sağlarifications jel oluşumunda rol oynayan bir polimer kimyasal gruplara gerekmektedir. Karboksil grupları, PAA ve karbomer ve hidroksil grupları, PEG ile ilgili ve agaroz, bir polikondensasyon reaksiyonu yoluyla hidrojel üç boyutlu bir yapıya yol açar. Bahsedilen polimerler, omurilik hasarı tamir tedavileri ¹² hidrojellerin sentezi için kullanılır. Bu cihazlar, bir önceki bildirilen yüksek biyo-uyumluluk gibi birçok canlı dokular kişilerce tiksotropik doğada benzer mekanik ve fiziksel özellikleri gösteren, ^13,14 çalışır. Ayrıca, enjeksiyon bölgesinde yerinde lokalize kalır.

Bu çalışmada, PAA karboksil grupları bir alkin grubu ile (Şekil 1) değiştirilir ve RGD azit bileşiği yapı _{(CH2) n} ile hazırlanan bir kimyasal bileşik ile tripeptid terminal grubu _-NH2 reaktivitesini istismar sentezlenir - N ₃ ( Şekil 2). Daha sonra, tadil edilmiş PAA CuAAC Click reaksiyonu ^15-17 (Şekil 3) ile RGD azid türevi ile reaksiyona girer. bakır (I) 'in bir katalizörün kullanımı, reaksiyon hızı ve regio selektivite her iki büyük değer gelişmelere yol açmaktadır. CuAAC Reaksiyon organik sentezlerde yaygın olarak, polimer bilimi kullanılır. Bu fonksiyonel gruplar, yüksek verim ve yüksek tolerans birleştirir ve organik çözücülerin kullanımı ile etkilenmez. Yüksek seçicilik, hızlı reaksiyon süresi ve basit bir saflaştırma işlemi istenen kısımları ¹⁸ aşılama yıldız polimerler, blok kopolimerleri veya zincirlerin alınmasını sağlar. Bu tıklama stratejisi mümkün nihai biyokimyasal uygulamaya göre fizikokimyasal özellikleri özelleştirmek için polimerizasyon sonra polimerlerin değiştirmek için yapar. CuAAC deneysel koşullar kolayca (bakır oksidasyon minimal oluşabilir oysa reaksiyon, su duyarsızdır) tekrarlanabilir ve doğa vardıroluşan triazol ürünün stabilitesini sağlar. Bakır metali kullanımı nedeniyle hücrelerine karşı potansiyel toksik etkisi ve biyolojik mikro olarak, kritik bir nokta olarak kabul edilebilir, fakat diyaliz katalitik kalıntıları tamamen çıkarılmasına olanak sağlayan bir saflaştırma yöntemi olarak kullanılır. Son olarak, PAA RGD hücre ya da ilaç taşıyıcılar olarak bu sistemlerin potansiyel özelliğe kontrol etmek için, incelenmiştir hidrojel sentezi (Şekil 4) ve elde edilen ağların fizikokimyasal özellikleri kullanılır modifiye.

Şekil 1: PAA alkin sentezi modifiye alkin grubuyla PAA işlevsellik şemasıdır;. "n" karboksil grubu propargilamin ile reaksiyona ile monomerler gösterir. görüntülemek için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Şekil 2:.. RGD-azid sentezi RGD-Azid türevi sentezi bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: reaksiyonu tıklayın Şema RGD-azid türevi ve alkin-PAA arasındaki tıklama reaksiyonun.. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Hidrojel syntnüklerde. RGD işlevselleştirilmiş hidrojel sentezi prosedür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Not: Alınan olarak kimyasallar kullanılmaktadır. Linear RGD satın alınan, ancak standart Fmoc katı faz peptit sentezi ^16,19 ile hazırlanabilir. Çözücüler, analitik sınıftadır. Diyaliz kesme eşittir 3,500 Da _W M zarın kullanımını gerektirir. Sentezlenen ¹ 400 MHz spektrometre kullanılarak kloroform kaydedilmiş 'H NMR spektrumu _(CDCI3) ya da çözücü madde olarak döteryum oksit (D ₂ O) ile karakterize edilir, ve kimyasal kaymalar, milyon başına kısımlar olarak δ değerler olarak rapor edilmiştir. Ayrıca, hidrojeller KBr ufak topak tekniği kullanılarak FT-IR analizi tabi tutulur ve fiziksel karakterizasyonu, 37 ° C'de ters test tüpü kullanılarak değerlendirildi jelasyon çalışmaları içerir edilir.

4-Azidobutanoyl 1. sentezi Klorür 1

1. 10 mL diklorometan ve 0.5 mi dimetilformamid içinde 4-azidobutanoic asit (3.90 mmol), 500 mg eritin.
2. 0 ° C'da, çözelti soğutulurBir buz banyosu kullanılarak.
3. karıştırılırken, reaksiyon sistemine damla damla ilave yavaş 5 ml diklorometan ile oksalil klorür (5.85 mmol) 505 ul ilave edin ve.
4. Bir buz banyosu kullanılarak, 0 ° C'de 1 saat sonra, oda sıcaklığına dönmesi.
5. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın.
6. _CDCI3 ¹⁶ örnek eritilmesi, ^1H-NMR spektroskopisi ile elde edilen ürünü karakterize eden.

Türev RGD azid 2 2. sentezi

1. 1 M NaOH ile 1 ml RGD 50 mg (0.145 mmol) çözündürülür.
2. 2 ml tetrahidrofuran içinde 1 (0.16 mmol) 24 mg eritin.
3. Bir buz banyosu kullanılarak, 0 ° C 'de çözelti 1 damla damla RGD bir çözüm tüm ekleyin.
4. Oda sıcaklığına dönmesi ve gece boyunca karıştırın.
5. 1 M HCI 1 ml ilave edilir.
6. Bir döner buharlaştırıcı kullanılarak indirgenmiş basınç altında çözücüyü çıkarın.
7. OBT karakterizeained ¹ 'H-NMR spektroskopisi ile ürün D ₂ O ¹⁶ örnek eritilmesi.

3. PAA Alkin Modifikasyonu 3

1. damıtılmış su, 15 ml PAA çözeltisi (2.8 mmol) ağ / ağ% 35, 200 mg eritin.
2. propargilamin hidroklorür (0.20 mmol), 15.4 mg ekleyin.
3. 1 h / h asetonitril: 1 14 ml 1-hidroksibenzotriazol hidrat 42.8 mg (HOBt, 0.28 mmol) çözülür, 50 ° C'de ısıtılarak damıtılmış su çözeltisi.
4. oda sıcaklığında PAA çözeltisine HOBt çözümünün tüm ekleyin.
5. Reaksiyon karışımına etildimetilamino-propilkarbodiimid 53.6 mg (EDC, 0.28 mmol) eklenir.
6. 5.5 pH ayarlamak ve gece boyunca oda sıcaklığında reaksiyon sistemi karışmaya 1 M HCI kullanarak.
7. çözüm dialyze. damıtılmış su, 2 L sodyum klorür 11.2 g çözülür ve sonra HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ekleyin. 3.5 kDa kesme _W M olan bir zar kullanılarak çözelti dialyze.
8. perfoÜç gün boyunca rm diyaliz. HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ihtiva eden taze hazırlanmış damıtılmış su, 2 L günlük diyaliz solüsyonunu değiştirin.
9. -80 ° C de nihai çözelti saklayın. üreticinin protokollerine göre bir liyofilizer içinde liyofilize edin.
10. D ₂ O ¹⁶ örnek eritilmesi, ^1H-NMR spektroskopisi ile işlevselleştirilmiş polimer karakterize.

PAA-RGD 4. sentezi Polimer 4

1. PAA 78 mg damıtılmış su, 10 ml alkin 3 (1.083 mmol) modifiye içinde çözülür.
2. 5 ml tetrahidrofuran içinde RGD azid 2 türevi (0,0722 mmol), 25 mg eritin.
3. polimerik çözüm RGD çözümün bütün ekleyin.
4. bakır iyodür (0.0116 mmol) ve sodyum askorbat 2.2 mg (0,0111 mmol), 2.2 mg ekleyin.
5. karıştırılarak 60 ° C de bir gece boyunca elde edilen karışım, geri akış.
6. 25 ° C'ye soğutun.
7. Dialyzçözelti e. damıtılmış su, 2 L sodyum klorür 11.2 g çözülür ve sonra HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ekleyin. 3.5 kDa kesme _W M olan bir zar kullanılarak çözelti dialyze.
8. Üç gün boyunca diyalize gerçekleştirin. HCI ağ / ağ% 37, 0.2 ml ihtiva eden taze hazırlanmış damıtılmış su, 2 L günlük diyaliz solüsyonunu değiştirin.
9. -80 ° C de nihai çözelti saklayın. üreticinin protokollerine göre bir liyofilizer içinde liyofilize edin.
10. D ₂ O ¹⁶ örnek eritilmesi, ^1H-NMR spektroskopisi ile elde edilen ürünü karakterize eden.

5. RGD fonksiyonalize Hidrojel sentezi

1. PBS hazırlayın. damıtılmış su, 50 ml PBS tuzu 645 mg çözülür.
2. Oda sıcaklığında, karbomer, 40 mg ve PBS (aşama 5.1) 9 ml işlevselleştirilmiş PAA 4, 10 mg Karışım, tamamen çözülünceye (30 dakika kadar).
3. çözeltiye PEG 400 mg ekleyin ve 45 dakika boyunca karıştırmaya devam edin.
4. karıştırmaya durdurun ve sistem 30 dakika boyunca yerleşmek için izin verir.
5. 7.4 pH ayarlamak için 1 N NaOH kullanarak.
6. Elde edilen karışım, 5 ml için, agaroz tozu 25 mg ekleyin.
7. genellikle 30 saniye ile 1 dakika arasında bir süre boyunca, kaynayana kadar 500 W mikrodalga radyasyon ile sistemin ışın tedavisi ve elektromanyetik olarak 80 ° C'ye kadar ısıtın.
8. sıcaklığı 50 ° C'ye düşene kadar oda sıcaklığında maruz beklettikten sonra 1 bir çözelti elde etmek üzere, PBS (aşama 5.1) 5 mL: 1 hacim oranında.
9. 1.1 sm bir çapı olan 12 çukurlu levha ihtiva eden çelik silindirler hazırlayın.
10. çözelti 500 ul alikotları alın ve her bir çelik silindirlere koyun.
11. Sistemin tam jelleşme kadar 45 dakika boyunca geri kalanı bırakın.
12. hidrojeller elde etmek için bir paslanmaz çelik silindir forseps kullanılarak çıkarın.

Terapötik Aracı 6. Yükleme (İlaç veya Hücreler)

1. st tekrarlayın5.1-5.7 eps.
2. 1 hacim oranı: (daha önce sol durumunda) karışımı, 37 ° C'ye ulaştığı zaman, 1 son bir sistem elde etmek için, istenen ilaç çözeltisi ya da hücre kültürü içeren çözeltinin 5 ml.
3. Tekrarlayın fiziksel jel içinde sıkışan biocompounds ile polimerik ağlar elde 5.9-5.12 adımları.

7. Hidrojel Karakterizasyonu

1. FT-IR Analizi
   1. Jel oluşumunun ardından 24 saat süre ile damıtılmış su içinde 2.5 ml sentezlenmiş hidrojellerin bir bekletin.
   2. Hidrojel batık sulu ortamları çıkarın ve donma-kuru sıvı _N2 ile.
   3. KBr ufak topak tekniğine göre hidrojel örnek Laminat.
      1. bir akik havanda içine KBr dolu bir spatula ekleyin. hidrojel örneği küçük bir miktar alın ve KBr tozu ile karıştırın (KBr miktarı, ya da spatula ucu karşılamak için yeterli yaklaşık% 0.1-2).
      2. Toz ince ve homojen olana kadar mikserden.
      3. IR pelet oluşturmak için KBr pelet kiti kullanın. Manuel bir laboratuar presi kullanılarak toz basın: 10 ton basınç kapasitesi 3 dakika boyunca, sonra 5 ton eşit ve basınç kapasitesi 3 dakika daha karıştırıldı.
      4. görünüş olarak homojen ve şeffaf nihai pelet elde etmek için baskı bırakın. IR numune tutucu içine pelet yerleştirin ve spektrum ¹⁶ çalıştırın.
2. jelleşme Çalışmaları
   1. PBS 900 ul 2 ml mikrosantrifüj tüpü doldurmak ve 37 ° C'ye kadar dengeye getirin.
   2. hidrojel oluşturan ve 37 ° C'de inkübe hazırlanan polimer çözeltisinin 100 ul ekle.
   3. tüp ters çevirin ve jel, 1, 2, 5, 10 ve 20 dakikada akarsa dikkate alınmalıdır. Jel jelleşme süresi olarak akmayan zaman kaydedilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

N, karboksil grupları amin ile reaksiyona monomerler etiketler, Şekil 1 'de gösterdi PAA alkin türevi etkili bir poliakrilik asit ve propargilamin sentezlenir. Ürünün kimliği ^1H-NMR spektroskopisi ile doğrulanmıştır. 5 üçlü bağ ile modifiye PAA ^1H-NMR spektrumunu göstermektedir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

The PAA post-polymerization modification with alkyne moieties and the RGD functionalization with the azide group guarantee the formation of a stable bond between the polymer and the peptide. Indeed, triazole serves as a rigid linking unit among the carbon atoms, attached to the 1,4 positions of the 1,2,3-triazole ring and it cannot be cleaved hydrolytically or otherwise. In addition, triazole is extremely difficult to oxidize and reduce, unlike other cyclic structures such as benzenoids and related aromatic heterocycles<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(acrylic acid) solution average Mw ~100,000, 35 wt% in H2O	Sigma Aldrich	523925	CAS 9003-01-4
Poly(ethylene glycol) 2,000	Sigma Aldrich	84797	CAS 25322-68-3
Carbomeer 974P	Fagron	1387083
Agarose	Invitrogen Corp.	16500-500	UltraPure Agarose
RGD peptide	abcam	ab142698
4-azidobutanoic acid	Aurum Pharmatech	Z-2421	CAS 54447-68-6
Oxalyl chloride	Sigma Aldrich	O8801	CAS 79-37-8
Propargylamine hydrochloride 95%	Sigma Aldrich	P50919	CAS 15430-52-1
Copper(I) iodide	Sigma Aldrich	3140	CAS 7681-65-4
Sodium ascorbate	Sigma Aldrich	Y0000039	CAS 134-03-2
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P4417
Dialysis Membrane	Spectrum Laboratories, Inc.	132725	Spectra/Por 3 Dialysis Membrane  Standard RC Tubing MWCO: 3.5 kD