Serebral Vasküler Endotelyal Hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun Değerlendirilmesi

Özet

Endotel hücre mitokondri, kan-beyin bariyeri bütünlüğünü korumak açısından kritik önem taşımaktadır. Bu serebral vasküler endotel hücrelerinde bioenergetic fonksiyonu ölçmek için bir protokolü getirmektedir.

Özet

Kan-beyin bariyer (KBB) bütünlüğü beyin hasarını önlemek için kritik öneme sahiptir. Serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri BBB oluşturan hücre tiplerinden biri olan; Bu hücreler optimum mitokondriyal fonksiyonunu gerektiren çok yüksek-enerji talebinin var. hastalık veya kaza durumunda, bu hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu hastalık veya BBB açılması ile sonuçlanır, değişmiş olabilir. Bu yazıda, bütün, sağlam hücreleri ve bir Bioanalyzer kullanarak CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için bir yöntem tanıtmak. Bir mito-stres tahlil ya fiziksel ya da kimyasal, bozulmuş olan hücreler meydan ve onların biyoenerjitik fonksiyonlarını değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca, bu yöntem aynı zamanda mitokondriyal fonksiyon üzerinde doğrudan etkiye sahip yeni tedavi ajanlarının ekrana kullanışlı bir yol sağlar. Mitokondriyal para çeşitli hesaplanmasına imkan oksijen tüketim oranları elde etmek için gerekli olan hücre yoğunluğuna optimizeATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite de dahil olmak üzere metre. Ayrıca mıkroRNA, miR-34a giriş, mitokondriyal aktivite belirgin bir ve saptanabilir bir azalmaya sebep olduğunu göstererek tahlilin hassasiyetini göstermektedir. Bu çalışmada gösterilen veriler bEnd.3 hücre hattı için optimize edilmiş olsa da, biz de daha ileri preklinik ve klinik modellerde programı düşündüren, birincil CVE hücreleri için protokol optimize ettik.

Giriş

Yaygın serebral vasküler endotelyal (CVE) hücreleri tarafından oluşturulan kan-beyin bariyeri (KBB) vasküler biyoloji için her şeyden çok farklı ve benzersiz işlevlere sahiptir olduğu kabul edilmektedir. Bu endotel hücreleri, kimyasal enerji kaynağı olarak adenosin trifosfat hücre kaynağı (ATP) en oluşturmak için mitokondri kullanımı. CVE hücreleri için ATP sağlamanın yanı sıra, mitokondri ^1-4 sinyal hücresel vasküler endotel hücreleri, çeşitli hücresel işlemleri, apoptoz ⁵ ve hücre döngüsü kontrol edilmesi ve hücre büyümesini ^6. CVE hücrelerde mitokondriyal biyoenerjik fonksiyonunun bozulması düzenleyen bozulmuş vasküler endotel aktivitesine yol açan, mitokondriyal biogenezi etkiler ve serebrovasküler hastalıklar ve nörodejeneratif bozukluklar, örneğin, felç ^7,8 ve Alzheimer hastalığı (AD) ⁹ şiddetlendirebilir. Bu CVE hücrelere hakaretler lipopolysac maruz kaldıktan sonra göstermiştirsakarit (LPS) CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu bozabilir ve inme ⁷ sonuçlarını kötüleştirebilir. Bütilhidrokuinon (TBHQ) CVE hücrelerinde ¹⁰ oksidatif fosforilasyon ile müdahale ederek inme mortaliteyi artırmaktadır. Bu nedenle, CVE hücreleri sadece pilot merkezi sinir sistemi için bir mekanizma ile ilgili bir dizi çalışma (CNS) hastalıkları biyoenerjik fonksiyonunun niceliksel model, aynı zamanda, vasküler biyoloji mitokondriyal fonksiyonu hedefleme terapötik ilaç taramasında bir buluş sağlar.

İzole mitokondri biyoenerjitik fonksiyonu ölçmek için kullanılmıştır. Biz ⁷ ve diğerleri ¹¹ ekstraselüler akı Bioanalyzer kullanarak sağlam CVE hücrelerinde hücresel Biyoenerjetiğin değerlendirmelerini bildirdi. analizör endojen hücresel biyoenerjetik değerlendirme avantajı sağlar. Bu, hassas ve tutarlı deney CVE hücrelerin mitokondrial metabolizmanın büyüklüğüne ve Şti bioenergetic bozukluğu değerlendirmek için kullanılabilirMuli, CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonunu etkileyen mitokondriyal sinyal yollarının mekanizmalarını ve ekran ilaçlar ya da tedaviler araştırmak. Bu protokolde, rotenone ve antimycin A. oligomycin, karbonil siyanür-4 (triflorometoksi) fenilhidrazonun (FCCP): Oksijen Tüketim Hızı (OCR) dört mitokondriyal bozucuların kullanımını birleştirerek bir farmakolojik profil yaklaşımı kullanılarak Bioanalyzer tarafından kaydedilir biz detay tek bir deneyde, ölçme ve bazal mitokondriyal solunum, ATP üretimi, proton sızıntısı, maksimal solunum ve yedek solunum kapasitesi dahil olmak üzere CVE hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonel parametrelerin hesaplanması için izin veren bir optimize edilmiş bir yaklaşım.

Protokol

Not: protokol şeması prosedürleri, bir zaman çizgisi de dahil olmak üzere, Şekil 1 'de gösterilmiştir.

CVE 1. Hücre Kültürü ve Pasaj

1. Tam büyüme ortamı içinde kültür CVE hücreleri (bEnd.3 hücreleri) (yüksek glukoz Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı, DMEM) T75 ^cm2'lik doku kültür şişesi içinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiştir. % 5 _CO2 inkübatörde 37 ° C'de büyütülmüştür.
2. Çıkarın ve hücre kültür ortamı atılır. % 0.25 tripsin-% 0.03 EDTA çözeltisi ile hücre tabakasını durulayın, ve daha sonra 1 ekleyin - şişeye Tripsin-EDTA solüsyonu 2 mL, 3 37 ° C 'de balon devam - 5 dak. Hücre tabakası ayrılmış kadar bir ters mikroskop altında hücre dikkate alınmalıdır. tam büyüme ortamı 10 ml ekleyin ve hafifçe pipetleme hücreleri aspire.
3. 5 dakika, selüler artığın ayrılması için 700 x g'de 15 ml santrifüj tüpüne ve spin içerisine sıvı ve hücre süzün.
4. santrifüj tüpten atın. tam büyüme ortamında 10 ml ekleyin ve hücre topağı yeniden askıya. 5 dakika boyunca 700 xg'de hücreleri dönerler.
5. santrifüj tüpten atın. Yeniden askıya 2.0 x 10 ⁵ hücre / ml bir konsantrasyonda tam büyüme ortamında hücre pelletini (hemasitometre kullanarak saymak suretiyle belirlendi, tripan-mavisi boyama ile ölü hücreleri hariç).
   Not: Taze çözülmüş hücreler deneyler için en az 3 geçişleri için alt kültürlenir.

Hücre Kültürü Tabaklar 2. Tohum ve tedavi Hücreler

1. 96 oyuklu bir hücre dışı akı hücre kültürü plakasının Tohum hücreleri: de 80 uL /. % 5 _CO2 inkübatöründe 37 ° C'de hücre kültürü plakası yerleştirin. Not: kuyu başına 16 × 10 ³ hücreleri 60 ulaşacak - 24 saat içinde% 80 confluency.
2. hücreler, bir kimyasala maruz kaldığı takdirde, hücreler plaka tabanına takılmaktadırlar, sonra, tedaviler ekleyin (8-24 saat izleyenlereding).
   Not: Transfeksiyon deneyleri için, tam büyüme ortamında antibiyotik ilave değildir.

Bioanalyzer kullanarak Mitokondriyal Fonksiyon 3. Değerlendirme

1. Deneyin başlamasından önce, plakaya hücre dışı akı kalibrant çözeltisi 150 uL ilave edilmesi ve _CO2 olmadan 37 ° C 'de O / N inkübe edilerek kalibratörü ile hücre dışı bir akış sensörü kartuşu hidrat.
2. plaka yıkayıcı istasyonunu kullanarak, pH 7.0 dışı akı deney ortamı içine hücre kültür ortamı değiştirin. 60 dakika - 30 CO ₂ olmadan 37 ° C'de inkübe hücreleri.
3. 8 mcM oligomycin, 4.5 uM FCCP, 10 uM rotenone ve DMEM 10 uM antimisin çalışma çözümleri hazırlayın. Yük 25 uL kartuş enjeksiyon portlarına stok çözümleri: Port A, oligomycin; Liman B, FCCP; Liman C, hücre dışı akı deney ortamı ile rotenone ve antimisin. Tablo 1 'de tarif edildiği gibi analiz protokolü uygulamak.
4. Bioanalyzer içine sulandırılmış kartuşu yükleyin ve "Başlat" düğmesine tıklayarak kalibrasyonu yapın. Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, kartuş alt plaka kaldırmak ve "Unload Kartuşu" istemini tıklayarak hücre plaka yükleyin. Tüm ölçümlerin sonuna kadar tahlil devam edin.
5. veri dosyasını açın ve Bioanalyzer gelen oran değerlerini elde. Bir tablo dosyasına veri verir.

4. Veri Analizi

NOT: Veri analizler için hesaplamalar aşağıda formüle edilmiştir. OCR Şekil 2'de gösterildiği gibi değerler Bioanalyzer alet elde edilir.

1. Bazal değerden (ölçüm 3) - Bazal solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın.
   NOT: Bazal solunum = Bazal - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ③ - Oranı ⑩ ~ ⑫.
2. ATP verimlilik hesaplamak içinbazal değerden (ölçüm 3) - on ATP bağlı solunum (6 ölçümleri 4) çıkarın.
   NOT: ATP üretimi = Bazal - ATP bağlı solunum = Oranı ③ - Oranı ④ ~ ⑥.
3. Maksimum solunum dan (ölçümler 7-9) - Maksimum solunum hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçümleri 10) çıkarın.
   NOT: Maksimal solunum = Maksimum solunum - olmayan mitokondriyal solunum = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ⑩ ~ ⑫.
4. Yedek kapasitesini hesaplamak için, maksimum solunum bazal değer (ölçüm 3) (- 9 ölçümler 7) çıkarın.
   NOT: Yedek kapasite = Maksimum solunum - Bazal = Oranı ⑦ ~ ⑨ - Oranı ③.
5. ATP bağlı solunum (ölçüm 4) den - Proton sızıntı hesaplamak için, olmayan mitokondriyal solunum (12 ölçüm 10) çıkarın.
   NOT: Proton kaçak = ATP bağlı solunum - olmayan mitokondril solunum = Oranı ④ - Oranı ⑩ ~ ⑫.

Sonuçlar

Oksidatif strese yanıt olarak CVE hücrelerinin bioenergetic fonksiyonunu değerlendirmek için, biz primer beyin mikrovasküler endotel hücreleri ¹² ile aynı karşılaştırmalı bariyer özellikleri gösteren fare beyin mikrovasküler endotelin hücre çizgisi bEnd.3 seçti. kinetik ve yanıtın nispi yoğunluk çeşitli hücre tipleri arasında farklılık olduğu göz önüne alındığında, deney birinci seriye ait metabolik profil deneyinde kullanılacak bEnd.3 hücrelerinin uygun tanımlanmasıyla ölçülebilir OCR seviyelerini elde etmek için dizayn edilmiştir, gösterilen değerlendirmenin ardından Şekil 2. veri miktarı ve Şekil 3'te. Bazal solunum, maksimal solunum sunulan ve yedek solunum kapasitesi hücre yoğunluğu ile orantılı tepki gösterdi edilir. Bununla birlikte, ATP üretimi aşırı birleşik hücre kültürü olduğunu düşündüren oyuk başına 64 x 10 ³ hücreleri seçildi düşerkenBu deney için uygun değildir. Mitokondriyal bozucuların yanıt göre oyuk başına ³ ila 10 x 32 hücreler, - Optimal hücre yoğunlukları 8 arasında gerçekleşir.

Takip eden deneyler için, oyuk başına 16 x 10 ³ hücre tohum yoğunluğu OCR değişikliklerin uygun tespiti için izin vermek için kullanılmıştır. Oyuk başına 16 x 10 ³ hücreleri kullanılarak, OCR beklenen yanıtları gözlendi ve mikroRNA miR-34A CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu (Şekil 4) azalttığını göstermiştir. Biz daha önce miR-34a bu hücrelerin ¹³ oksidatif fosforilasyon azalttığını bildirdi. Tekrarlanan deneyler de maksimal solunum ve yedek kapasite önemli ölçüde anlamlı bir değişiklik olsa bile bazal solunum, ATP üretimi ve proton sızıntısı olsa, 24 saat sonrası transfeksiyon de CVEs içinde miR-34a aşın azalarak olduğunu gösterdi (Şekil 4) . Bu veriler,CVEs mitokondriyal fonksiyon değişiklikleri tespit etmek için Bioanalyzer hassasiyetini göstermektedir.

Hücre, plaka için. Denemeye zaman çizelgesi 1. Stratejik Planlama Şekil ve kartuş hazırlık gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil çeşitli hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde Bioenerjetik Fonksiyonun 2. Örnek ham veriler. Oksijen tüketimi oranları farklı hücre yoğunlukları olan CVE hücrelerinde ölçüldü. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı; FCCP: karbonil siyanit-4- (trifluorometoksi) fenilhidrazon; Rot / Anti-A: rotenone ve antimycin A. ①, ② ve ③ bazal solunum gösterir; ④, ⑤ ve ⑥ ATP solunum bağlantılı olduğunu gösterir; ⑦, ⑧ ve ⑨ fazla solunum gösterir; ⑩, ⑪ ve ⑫ olmayan mitokondriyal solunum gösteriyor. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Çeşitli Hücre Yoğunlukları ile CVE Hücreleri Bioenerjetik Fonksiyon Şekil 3. Temsilcisi Sonuçlar. Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Biyoenerjetiğin tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanan Şekil formülleri kullanarak 2 fonksiyonel tahlil Bölüm 4'te belirtilen . Veri ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı. f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: miR-34a tarafından Azalmış Bioenerjetik Fonksiyonun Temsilcisi Sonuçlar (A) Mitokondriyal Fonksiyon Ham veri 24 saat sonrası transfeksiyon de miR-34a aşın şu.. (B) Bazal solunum, ATP üretimi, maksimal solunum ve yedek kapasite Bioenerji Şekil 4A fonksiyonel tahlil tarafından oluşturulan ham verilerden hesaplanır; parametreleri miR-34a Bölüm 4 aşırı ifadesinin belirtilen formüller hesaplanmıştır 24 saat sonra, transfeksiyon olan CVE hücrelerde mitokondriyal fonksiyonu azaltır. Veriler ortalama ± SD temsil (n = 5); OCR: Oksijen Tüketim Hızı. ****, P <0.0001.dosyaları / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tablo 1. Enstrüman çalıştırın Protokolü.

Tartışmalar

Bu protokol, serebral vasküler endotel hücrelerinde biyoenerjik fenotipinin değerlendirilmesi için bir yöntemi temsil eder. Bu endotel hücre mitokondriyal değerlendirme için temel bir tahlil olarak hizmet eder ve bu CVE hücrelerde mitokondriyal sinyal yolağı etkileyebilir uyaranlara mekanizmalarının incelenmesi amacıyla tasarlanan deneylerde için en uygunudur. Ayrıca, BBB bozulması ile ilişkili hastalıklar için potansiyel terapötik test etmek için bir yöntem sağlar.

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Hücre dışı akı bioanalyzers gerçek zamanlı olarak OCR ölçme yeteneğine sahiptir. Bu tahlilde, uygun hücre yoğunluğu tespit önemlidir. Hücre yoğunluğu oyuk başına 8 x 10 ³ hücre altında ise, taban OCR (Şekil 2 ve Şekil 3) analiz edilecek olan çok düşük olduğu; Hücre yoğunluğu oyuk başına 32 x 10 ³ hücre üzerinde ise, hücreler oligomycin ya FCCP işlemesi yanıt yokNTS (Şekil 2 ve Şekil 3). Bizim deneysel modelinde bu hücre hattı için en uygun hücre yoğunluğu ⁷ ve tedavileri ^10,14 uyaranlara tekrarlanabilir sonuçlar ve hassasiyet gösteren kuyu başına 16 × 10 ³ hücredir. 24 oyuklu Bioanalyzer kullanılırsa, hücre yoğunluğu, yeni titrasyonları tahlili için gerekli olacaktır.

CVEs diğer endotel hücreleri ya da doku tipleri ^15,16 ile karşılaştırıldığında mitokondri büyük bir hacme sahip olduğunu daha fazla enerji üretimi ve biyoenerjetik metabolizmayı ölçmek için daha az hücre ihtiyacını öne belgelenmiştir. Biz primer beyin endotel hücreleri çeşitli test ve fare serebrovasküler endotel hücrelerini ⁷ ölümsüzleştirdi ve insan serebrovasküler endotel hücrelerini (yayınlanmamış veri) ölümsüzleştirilmiş var. 160 pmol / dak - Bu hücreler 40 içinde olarak kabul edilebilir bir OCR (bazal solunum OCR ulaşmak için benzer bir hücre yoğunlukları gerekli96 oyuklu plakalar, ve 50-24 oyuklu plakalar 400 pmol / dakika) biyoenerji deney yapıldı. Kaczara ve ark., Daha yüksek bir hücre yoğunluğuna ¹⁷ kullanılan insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC), içinde bioenergetic metabolizma ölçüm bildirmiştir.

Grubumuz, diğer doku veya organlardan damar hücrelerini değerlendirmek vermedi. Teorik olarak, Bioanalyzer potansiyel olarak herhangi bir hücre tipi kullanılabilir ancak, hücre yoğunluğu, hücre kültür ortamı ve kültür koşulları (bazı özel hücrelerin de büyüme plakaları kaplanmış gerektirebilir) için tahlil optimize etmeyi gerektirir. Deneyler OCR oranını kabul edilebilir aralık içinde olduğundan emin olmak için tamamlanmış olması gereklidir. diğer organlarda endotel hücrelerinde OCR hücre yoğunluğu artan, beyinlerinden CVEs daha düşük ise, kabul edilebilir bir OCR aralığında almak için yardımcı olabilir. Hücreler enerji ana kaynağı olarak oksidatif fosforilasyon kullanmıyorsanız Alternatif olarak, Bioanalyzer bir optima olmazl deneyi.

Bioanalyzer reaktifler uygulandığı sırasına göre, elektron taşıma zinciri sıralı bozulması için izin verir. İlk olarak, oligomycin mitokondriyal kompleks V (ATP sintaz) inhibe eden, uygulanır. İkinci olarak, FCCP, bir elektron uncoupler proton gradyanı bozulmasına yol açar, uygulanır. Son olarak, mitokondriyal Kompleksi I ve III inhibe rotenon ve antimisin, sırasıyla elektron akışının toplam inhibisyonuna yol uygulanır. ilaca maruz kalma sırası ilaçların spesifik elektron taşıma zincir reaksiyonu engellemek için gereklidir ve ardışık değişiklikler mitokondriyal fonksiyon yansıtacak şekilde ölçülebilir.

Değişiklikler ve Sorun Giderme

CVE hücrelerinde uyaranlara mitokondriyal yanıtı değerlendirmek için, hücrelerin hücre kültürü plakası altına yapıştırılır sonra uyaranlar (zaman çizelgesi bkz hücrelere uygulanır tavsiye edilirŞekil 1 'de gösterilen; Genellikle) en az 6 saat sürer. tedaviler ile tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için, tutarlı hücre yoğunluğunu tutmak için son derece önemlidir. ön işlemler hücre tohumlama önce tasarlanmış, her ön-tedavisi için hücre yoğunluğu dikkatle tohumlama için ölü hücreleri hariç, ölçülmelidir. transfeksiyon deney tasarımı dahil edilirse, üreticinin transfeksiyon protokolü bakın. Şekil 4'de sunulan veriler göstermiştir miR-34A miR-34a aşırı ekspresyonu ile metabolik fonksiyonu değişiklikleri değerlendirmek için antibiyotik içermeyen hücre kültür ortamı ve Mito-stres testi gerektiren bir lipofektamin transfeksiyon kiti kullanılarak CVE hücrelerine transfekte edilmiştir . Daha önce ¹³ yayınlanan plazmid dozları da, optimize edilebilir. protokole yapılabilir bir diğer değişiklik reaktifler konsantrasyonları değişiyor. oligomycin, FCCP ve / veya rotenone ve antimisin bir titrasyon eğrisi komple olabilirTed.

Yüksek performans için kullanılan bu deney, çeşitli ilaçların analiz Buna ek olarak, hücre canlılığı ve önceki yayınlarda ^7,13 tanımlanmıştır hücre çoğalmasını ölçmek için bir paralel tahlil içerir önerilmektedir. OCR değerleri anlamlı hücre sayısı (Şekil 2 ve 3) etkilenen ve hücre çoğalması ve canlılığı deneyleri veri normalleşme fayda vardır. Ancak, bu testlerin tamamlanması her laboratuvar takdirine kalmıştır.

Tekniğin Sınırlamalar

Bu protokolün en önemli kısıtlılığı, biz sadece çalışmada in vitro hücre kültürü modeli kullanılmış olmasıdır. Şu anda, endotel hücre mitokondrial fonksiyon hitap edebilir hiçbir kullanılabilir ex vivo modeller ya da hayvan modelleri vardır. Yeni modeller in vivo biyoenerjetik fonksiyonunun değerlendirilmesi için geliştirilmiş olması bekleniyor ve ex vivo gelecekteki çalışmalarda.

Başka bir sınırlama biyoenerjetiğin tedbirler aşağıdaki bariyer değerlendirmelerinin uzantısıdır. İlk olarak, biyoenerjitik ölçümler tamamlandıktan sonra, hücre canlılığı, elektron taşıma zincirinin tam parçalanmadan sonra azalır, çünkü deneyler gerçekleştirilemez; İkinci, özel hücre kültürü plakaları ve ekler biyoenerjetik değerlerini tespit etmek için gerekli olan ve bariyer değerlendirmeler için ekler uymaz. Bu nedenle, biyoenerji tahlil sonra tamamlanabilir pek çok işlevsel tahliller değildir. Bununla birlikte, özel cihazlar biyoenerji deneyi öncesinde fonksiyonel tahliller yapmak için geliştirilebilir beklenmektedir.

Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi

Mitokondriyal fonksiyonu değerlendirmek için önceki teknikler hücrelerden ¹⁸ den mitokondri izolasyonu gerektirmiştir. bu neBioanalyzer kullanılarak W tekniği izole mitokondri değerlendirilmesi daha selüler ortamın fazla muhafaza sağlam hücrelerde mitokondriyal aktivite ölçümü sağlar.

Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Bu protokol, tasarlanmış ve bEnd.3 hücre hattı için geliştirilmiş, ancak aynı zamanda primer serebral vasküler endotelyal (pCVE) hücreleri ⁷ ya da endotel ile uyumlu olduğunu ve pCVE hücreleri ⁷ kullanarak önceki yayında bu göstermiştir edilir. endotel diğer türleri kullanıldığında, kültür plakasının kaplama ve büyüme faktörleri kullanımı gerekebilir. Bununla birlikte, titrasyon testi gibi diğer hücre tipleri için tavsiye edilir. Bu protokol, CVE hücre Biyoenerjetiğin değerlendirilmesinde kabul edilmesi genel bir yöntem sunmaktadır ve bu daha da mekanizma çalışmaları da bu şekilde tedavi yanıtları tatbik edilebilir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
bEnd.3 cell line	ATCC	CRL-2299	25 - 30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S12450	10% final concentration
Penicillin/Steptomycin	Hyclone	SV30010	1×100 stocking
0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution	Corning	25-053-CI
Sodium pyruvate	Corning	25-000-CI	1.0 µM final concentration
Glucose	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM final concentration
Oligomycin	Sigma	O4876	1.0 µM final concentration
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920	0.5 µM final concentration
Rotenone	Sigma	R8875	1.0 µM final concentration
Antimycin A	Sigma	CAS 1397-94-0	1.0 µM final concentration
Plate wash station	Seahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer	Seahorse Bioscience	XFe96
Extracellular flux cell culture plate	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux sensor cartridge	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux calibrant solution	Seahorse Bioscience	100840-000
Extracellular flux assay medium	Seahorse Bioscience	102365-100	PH buffered prior to assay