Valutazione della funzione bioenergetica in cellule endoteliali vascolare cerebrale

Riepilogo

mitocondri delle cellule endoteliali sono fondamentali per mantenere l'integrità del sangue-cervello barriera. Introduciamo un protocollo per misurare la funzione bioenergetico nelle cellule endoteliali vascolari cerebrali.

Abstract

L'integrità del sangue-cervello-barriera (BBB) ​​è fondamentale per prevenire lesioni cerebrali. endoteliale vascolare cerebrale (CVE), le cellule sono uno dei tipi di cellule che compongono il BBB; queste cellule hanno una domanda molto alta energia, che richiede la funzione mitocondriale ottimale. In caso di malattia o lesione, la funzione mitocondriale in queste cellule può essere alterato, causando malattia o l'apertura della BBB. In questo manoscritto, si introduce un metodo per misurare la funzione mitocondriale in cellule CVE utilizzando interi, cellule intatte e un Bioanalyzer. Un test mito stress viene utilizzato per sfidare le cellule che sono state perturbate, fisicamente o chimicamente, e valutare la loro funzione bioenergetica. Inoltre, questo metodo fornisce anche un modo utile per lo screening di nuove terapie che hanno effetti diretti sulla funzione mitocondriale. Abbiamo ottimizzato la densità cellulare necessaria per produrre consumi di ossigeno che consentono il calcolo di una varietà di para mitocondrialemetri, tra cui la produzione di ATP, la respirazione massima, e la capacità di riserva. Mostriamo anche la sensibilità del test, dimostrando che l'introduzione del microRNA, miR-34a, porta ad una diminuzione marcata e rilevabile in attività mitocondriale. Mentre i dati riportati nel presente documento è ottimizzato per la linea cellulare bEnd.3, abbiamo anche ottimizzato il protocollo per le cellule primarie CVE, suggerendo ulteriormente l'utilità in modelli preclinici e clinici.

Introduzione

E 'ampiamente riconosciuto che il sangue-cervello-barriera (BBB) ​​formate da cellule endoteliali vascolari cerebrali (CVE) ha funzioni ben distinte e uniche di primaria importanza per la biologia vascolare. Queste cellule endoteliali utilizzano mitocondri per generare maggior parte della fornitura cellulare di adenosina trifosfato (ATP) come fonte di energia chimica. Oltre a fornire ATP per le cellule CVE, mitocondri regolano vari processi cellulari in cellule endoteliali vascolari, quali cellulari segnalazione ^1-4, apoptosi ^5, e il controllo del ciclo cellulare e la crescita cellulare ^6. Disregolazione funzione bioenergetica mitocondriale nelle cellule CVE possono influenzare la biogenesi mitocondriale, portando ad alterata attività di endotelio vascolare, ed esacerbare le malattie cerebrovascolari e malattie neurodegenerative, per esempio, ictus ^7,8 e malattia di Alzheimer (aD) ^9. Abbiamo dimostrato che gli insulti alle cellule CVE a seguito dell'esposizione ad lipopolysaccharide (LPS) compromettere la funzione mitocondriale nelle cellule CVE e peggiorare ictus esiti ^7. Terz-butil-idrochinone (TBHQ) aumenta la mortalità ictus interferendo con fosforilazione ossidativa delle cellule CVE ^10. Pertanto, il modello quantitativo della funzione bioenergetica nelle cellule CVE non solo piloti una serie di studi meccanismo legati al sistema nervoso centrale (SNC) malattie, ma fornisce anche un importante passo avanti in screening di farmaci di terapie di targeting funzione mitocondriale in biologia vascolare.

mitocondri isolati sono stati utilizzati per misurare la funzione bioenergetica. Abbiamo ⁷ e altri ¹¹ hanno riportato le valutazioni di bioenergetica cellulari in cellule intatte CVE utilizzando un Bioanalyzer flusso extracellulare. L'analizzatore offre il vantaggio di valutazione bioenergetica cellulare endogena. Questo test sensibile e coerente misura il metabolismo mitocondriale di cellule CVE e può essere utilizzato per valutare impairment bioenergetica da stimuli, indagare i meccanismi di vie di segnalazione mitocondriali, e farmaci schermo o trattamenti che influenzano la funzione mitocondriale nelle cellule CVE. Il consumo di ossigeno Rate (OCR) viene registrato dal bioanalizzatore utilizzando un approccio di profilatura farmacologico, combinando l'uso di quattro perturbatori mitocondriali: oligomicina, carbonile cianuro-4 (trifluoromethoxy) fenilidrazone (FCCP), rotenone, e antimicina A. In questo protocollo, abbiamo dettaglio un approccio ottimizzato che consente la misurazione e il calcolo dei parametri funzionali mitocondriali nelle cellule CVE, tra basale respirazione mitocondriale, la produzione di ATP, perdita protonica, la respirazione massima, e capacità respiratoria ricambio, in un singolo test.

Protocollo

NOTA: Lo schema del protocollo è mostrato in Figura 1, compresa una sequenza temporale delle procedure.

1. cultura e passaggio di cellule CVE

1. Cellule di coltura CVE (cellule bEnd.3) in terreno di coltura completo (alti livelli di glucosio Dulbecco Modified mezzo di Eagle, DMEM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina in un T75 cm pallone di coltura tissutale ^2. Crescere a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%.
2. Rimuovere e gettare il mezzo di coltura cellulare. Risciacquare strato di cellule con 0,25% di soluzione di EDTA tripsina-0,03%, e quindi aggiungere 1 - 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA al pallone e mantenere il matraccio a 37 ° C per 3 - 5 min. Osservare le cellule al microscopio invertito finché lo strato di cellule è staccato. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo e aspirare le cellule pipettando delicatamente.
3. Decantare il liquido e le cellule in una provetta da centrifuga da 15 ml e far girare a 700 xg per 5 minuti per rimuovere i detriti cellulari.
4. Eliminare il surnatante dalla provetta. Aggiungere 10 ml di terreno di coltura completo e risospendere il pellet cellulare. Spin le cellule a 700 xg per 5 min.
5. Eliminare il surnatante dalla provetta. Risospendere il pellet cellulare in mezzo di crescita completo ad una concentrazione di 2,0 x 10 ⁵ cellule / ml (determinata per conteggio utilizzando un emocitometro; escludere le cellule morte mediante colorazione Trypan-blue).
   NOTA: le cellule appena scongelati sono sub-coltura per almeno 3 passaggi per esperimenti.

2. Le sementi e il trattamento di cellule su piastre di coltura cellulare

1. cellule seme su una piastra di coltura di cellule del flusso extracellulare 96 pozzetti: 80 ml / pozzetto. Posizionare la piastra di coltura cellulare a 37 ° C in un incubatore CO ₂ 5%. Nota: 16 × 10 ³ cellule per pozzetto raggiungeranno 60 - 80% di confluenza entro 24 ore.
2. Se le cellule sono esposti a una sostanza chimica, aggiungere i trattamenti una volta che le cellule sono attaccati alla piastra inferiore (8 - 24 ore dopo vediding).
   NOTA: Per gli esperimenti di trasfezione, non aggiungere antibiotici nel terreno di coltura completo.

3. Valutazione della mitocondriale Funzione Con il Bioanalyzer

1. Prima dell'inizio del test, idratare una cartuccia extracellulare sensore di flusso con calibrante aggiungendo 150 ml di extracellulare flusso calibrante soluzione alla piastra e incubazione O / N a 37 ° C senza CO _2.
2. Utilizzando la stazione di lavaggio piatto, cambiare il mezzo di coltura cellulare in pH 7,0 extracellulare flusso terreno di coltura. Incubare le cellule a 37 ° C senza CO ₂ per il 30 - 60 min.
3. Preparare le soluzioni di lavoro di 8 micron oligomicina, 4,5 micron FCCP, 10 micron rotenone, e 10 micron antimicina A in DMEM. Carico 25 ml delle soluzioni madre nella cartuccia porte di iniezione: Port A, oligomicina; Port B, FCCP; Port C, rotenone e antimicina A con extracellulare terreno di coltura di flusso. Attuare il protocollo di test, come descritto nella tabella 1.
4. Caricare la cartuccia idratata in bioanalizzatore ed effettuare la calibrazione facendo clic sul pulsante "Start". Dopo la calibrazione, rimuovere la piastra inferiore della cartuccia e caricare la piastra di cella cliccando il prompt "Cartuccia Scaricare". Continuare il dosaggio fino al termine di tutte le misurazioni.
5. Aprire il file di dati e ottenere i valori della tariffa da bioanalizzatore. Esportare i dati in un file foglio di calcolo.

4. Analisi dei dati

NOTA: I calcoli per le analisi dei dati sono formulati di seguito. I valori sono ottenuti dallo strumento bioanalizzatore come OCR presentato in figura 2.

1. Per calcolare la respirazione basale, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misure 10 - 12) dal valore basale (misura 3).
   NOTA: basale respirazione = basale - la respirazione mitocondriale non = tasso ③ - Tariffa ⑩ ⑫ ~.
2. Per calcolare producti ATPon, sottrarre la respirazione ATP-linked (misure 4 - 6) dal valore basale (misura 3).
   NOTA: la produzione di ATP = basale - respirazione ATP-linked = tasso ③ - Tariffa ④ ~ ⑥.
3. Per calcolare la respirazione massima, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misure 10 - 12) dalla respirazione massima (misure 7 - 9).
   NOTA: respirazione massima = massima respirazione - non mitocondriale respirazione = Tasso ⑦ ~ ⑨ - Tariffa ⑩ ⑫ ~.
4. Per calcolare la capacità di riserva, sottrarre il valore basale (misura 3) dalla respirazione massima (misure 7 - 9).
   NOTA: la capacità di riserva = respirazione massima - basale = Tasso ⑦ ~ ⑨ - Tariffa ③.
5. Per calcolare Proton perdita, sottrarre la respirazione non mitocondriale (misura 10 - 12) dalla respirazione ATP-linked (misura 4).
   NOTA: Proton perdita = respirazione ATP-linked - non mitocondril respirazione = Tasso ④ - Tariffa ⑩ ⑫ ~.

Risultati

Per valutare la funzione bioenergetica delle cellule CVE in risposta allo stress ossidativo, abbiamo scelto il microvascolare cerebrale linea di cellule murine endoteli bEnd.3, che visualizza le stesse caratteristiche di barriera comparativi primario microvascolari cerebrali cellule endoteliali ^12. Dato che la cinetica e intensità relativa risposta sono variati tra i vari tipi di cellule, la prima serie di esperimenti sono stati progettati per ottenere livelli misurabili OCR identificando il numero ottimale di cellule bEnd.3 da utilizzare nel saggio per profili metabolici, presenti in Figura 2. in seguito alla valutazione, i dati vengono quantificati e presentati in Figura 3. respirazione basale, la respirazione massima, e capacità respiratoria ricambio mostrato una risposta proporzionale con densità cellulare. Tuttavia, la produzione di ATP è diminuita quando sono stati selezionati 64 × 10 ³ cellule per bene, suggerendo che la coltura cellulare over-confluenti ènon adatto per questo esperimento. Le densità cellulare ottimale verificano dell'8 - 32 × 10 ³ cellule per pozzetto, sulla base della risposta agli interferenti mitocondriali.

Per esperimenti successivi, una densità di semina di 16 × 10 ³ cellule per pozzetto è stato usato per consentire il rilevamento ottimale delle variazioni OCR. Utilizzando 16 × 10 ³ cellule per bene, abbiamo osservato le risposte attese in OCR e dimostrato che il microRNA miR-34a riduce la funzione mitocondriale in cellule CVE (Figura 4). Abbiamo già riferito che miR-34a ridotta fosforilazione ossidativa in queste cellule ^13. Gli esperimenti ripetuti hanno inoltre dimostrato che la respirazione massima e la capacità di riserva sono stati notevolmente diminuito dalla sovraespressione di miR-34a in CVE a 24 ore dopo la trasfezione, anche se la respirazione basale, la produzione di ATP, e perdita protonica non ha avuto cambiamenti significativi (figura 4) . Questi datidimostrare la sensibilità del bioanalizzatore per rilevare i cambiamenti nella funzione mitocondriale in CVE.

Figura 1. Pianificazione strategica per l'esperimento. La timeline per la cella, piatto, e la preparazione della cartuccia è indicato. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 2. Raw Dati rappresentativi della Funzione bioenergetico in cellule CVE con varie densità delle cellule. I tassi di consumo di ossigeno sono stati misurati in cellule CVE con diverse densità di cellule. I dati rappresentano media ± DS (n = 5); OCR: Ossigeno Consumo Tasso; FCCP: carbonile cianuro-4- (trifluoromethoxy) fenilidrazone; Rot / Anti-A: rotenone e antimicina A. ①, ② e ③ indicano la respirazione basale; ④, ⑤ e ⑥ indicare ATP legato respirazione; ⑦, ⑧, e ⑨ indicare massimo la respirazione; ⑩, ⑪ e ⑫ indicare la respirazione non mitocondriale. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 3. Risultati rappresentativi della funzione bioenergetica nelle celle CVE con varie densità delle cellule. Respirazione basale, la produzione di ATP, respirazione massima, e la capacità di riserva sono calcolati a partire dai dati grezzi generati dai bioenergetica saggio funzionale in figura 2 utilizzando le formule indicate nella sezione 4 . I dati rappresentano i media ± SD (n = 5); OCR: ossigeno Consumo Rate. f = "http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54847/54847fig3large.jpg" target = "_ blank"> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Rappresentante dei risultati di riduzione della funzione bioenergetica di miR-34a (A) i dati grezzi di mitocondriale seguente funzione sovraespressione di miR-34a a 24 ore dopo la trasfezione.. (B) la respirazione basale, la produzione di ATP, la respirazione massima, e la capacità di riserva sono calcolate a partire dai dati grezzi generati dai bioenergetica saggio funzionale in figura 4A; i parametri sono calcolati dalle formule di cui al punto 4. La sovraespressione di miR-34a riduce la funzione mitocondriale in cellule CVE a 24 ore dopo la trasfezione. I dati rappresentano media ± DS (n = 5); OCR: ossigeno Consumo Rate. ****, P <0,0001.file / ftp_upload / 54847 / 54847fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1. Lo strumento Run protocollo.

Discussione

Questo protocollo rappresenta un metodo di valutazione del fenotipo bioenergetico in cellule endoteliali vascolari cerebrali. Serve come un test di base per la valutazione dei mitocondri delle cellule endoteliali, ed è ottimale per esperimenti progettati per studiare i meccanismi di stimoli che possono influenzare il percorso di segnalazione mitocondriale nelle cellule CVE. Esso fornisce anche un metodo per testare potenziali terapie per le malattie BBB-rottura-associati.

I passaggi critici all'interno del protocollo

Extracellulari bioanalyzers di flusso hanno la capacità di misurare OCR in tempo reale. In questo saggio, identificando la densità cellulare appropriata è critica. Se la densità cellulare è inferiore a 8 × 10 ³ cellule per pozzetto, basale OCR è troppo bassa per essere analizzati (Figura 2 e Figura 3); se la densità cellulare è al di sopra di 32 × 10 ³ cellule per bene, le cellule non rispondono a oligomicina o FCCP lavornti (Figura 2 e Figura 3). La densità cellulare ottimale per questa linea di cellule nel nostro modello sperimentale è di 16 × 10 ³ cellule per bene, che dimostra i risultati replicabili e la sensibilità agli stimoli ⁷ e trattamenti ^10,14. Se si utilizza un bioanalizzatore 24 pozzetti, nuove titolazioni della densità delle cellule sarebbero necessari per il test.

E 'documentato che CVE hanno un grande volume di mitocondri rispetto ad altre cellule endoteliali o tipi di tessuto ^15,16, suggerendo la necessità di una maggiore produzione di energia e un minor numero di cellule per misurare il metabolismo bioenergetica. Abbiamo testato diversi tipi di cellule endoteliali cerebrali, come primario e immortalate murine cellule endoteliali cerebrovascolari ⁷ e immortalate cellule endoteliali umane cerebrovascolari (dati non pubblicati). Queste cellule necessari simili densità di cellule per raggiungere il accettabili OCR (basale respirazione OCR entro 40-160 pmol / min per96 pozzetti e un 50 - 400 pmol / min per piastre da 24 pozzetti) quando è stata eseguita l'analisi bioenergetica. Kaczara et al. Riportata la misurazione del metabolismo bioenergetico nel umani vena ombelicale cellule endoteliali (HUVEC), che ha utilizzato una più alta densità cellulare ^17.

Il nostro gruppo non ha valutato le cellule dei vasi provenienti da altri organi o tessuti. Teoricamente, il bioanalizzatore potrebbe potenzialmente essere utilizzato su qualsiasi tipo di cellula, ma richiede l'ottimizzazione del saggio per la densità cellulare, mezzo di coltura cellulare, e condizioni di coltura (alcune cellule specifiche possono richiedere piastre rivestite per crescere bene). È necessario che gli esperimenti sono completati per garantire il tasso di OCR è compreso nell'intervallo accettabile. Se l'OCR nelle cellule endoteliali da altri organi è inferiore CVE dal cervello, aumentando la densità cellulare può aiutare a ottenere all'interno di un intervallo OCR accettabile. In alternativa, se le cellule non si utilizza la fosforilazione ossidativa come loro principale fonte di energia, il bioanalizzatore non sarebbe un Optimal test.

Il bioanalizzatore consente l'interruzione sequenziale della catena di trasporto degli elettroni, in base all'ordine in cui vengono applicati i reagenti. Innanzitutto, oligomicina viene applicato, che inibisce mitocondriale Complesso V (ATP sintasi). In secondo luogo, FCCP, un disaccoppiatore elettroni, viene applicato, che porta alla distruzione del gradiente protonico. Infine, rotenone e antimicina A, che inibiscono mitocondriale complessi I e III, rispettivamente, vengono applicate portare ad una totale inibizione del flusso di elettroni. L'ordine di esposizione al farmaco è essenziale perché i farmaci bloccano la reazione a catena di trasporto degli elettroni specifico, e le modifiche sequenziali può essere misurato in modo da riflettere la funzione mitocondriale.

Modifiche e risoluzione dei problemi

Per valutare la risposta agli stimoli mitocondriale nelle cellule CVE, si raccomanda che gli stimoli sono applicati ai celle dopo le cellule sono rispettati fondo piastra di coltura cellulare (vedi timelinedi figura 1; di solito ci vogliono almeno 6 ore). Per ottenere risultati riproducibili da trattamenti, è estremamente importante mantenere la densità cellulare coerente. Se pretrattamenti sono progettati prima della semina delle cellule, la densità delle cellule per ogni pre-trattamento deve essere attentamente valutato, escludendo le cellule morte per la semina. Se trasfezione è incluso nel disegno sperimentale, fare riferimento al protocollo di trasfezione del produttore. Dimostrato in dati presentati in Figura 4, miR-34a è stato trasfettato nelle cellule CVE utilizzando un kit Lipofectamine trasfezione, che richiede medio-antibiotici libere coltura cellulare e un test mito-stress per valutare i cambiamenti nella funzione metabolica con sovraespressione di miR-34a . Le dosi di plasmide possono essere ottimizzate, come precedentemente pubblicato ^13. Un'altra modifica che può essere fatto al protocollo sta cambiando le concentrazioni dei reagenti. Una curva di titolazione di oligomicina, FCCP, e / o rotenone e Antimicina A può essere compleTed.

Inoltre, se questo test viene utilizzato per high throughput analisi di vari farmaci, si suggerisce di includere un saggio parallelo a misurare la vitalità cellulare e proliferazione cellulare, che è stato descritto nelle nostre precedenti pubblicazioni ^7,13. I valori OCR sono significativamente interessate dal numero di cellulare (figure 2 e 3), ei saggi di proliferazione cellulare e la vitalità beneficio della normalizzazione dei dati. Tuttavia, il completamento di questi test sono a discrezione di ogni singolo laboratorio.

LIMITI DELLA TECNICA

Il principale limite di questo protocollo è che abbiamo usato solo una cellula in vitro modello di cultura nello studio. Attualmente, non ci sono vivo modelli disponibili EX o modelli animali che potrebbero risolvere la funzione mitocondriale delle cellule endoteliali. I nuovi modelli dovrebbero essere sviluppati per la valutazione della funzione bioenergetica in vivo e ex vivo in studi futuri.

Un altro limite è l'estensione delle valutazioni barriera seguenti misure bioenergetici. Gli esperimenti non può essere eseguita in quanto, in primo luogo, dopo il completamento delle misurazioni bioenergetiche, la vitalità cellulare è diminuita dopo completa rottura della catena di trasporto degli elettroni; In secondo luogo, le piastre e gli inserti colture cellulari specifici sono tenuti a rilevare i valori bioenergetica e non si adattano inserti per le valutazioni di barriera. Pertanto, non ci sono molti saggi funzionali che possono essere completati dopo il test bioenergetica. Tuttavia, si prevede che i dispositivi speciali possono essere sviluppate per eseguire saggi funzionali prima del test bioenergetica.

Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /

Tecniche precedenti per valutare la funzione mitocondriale reso necessario l'isolamento dei mitocondri dalle cellule ^18. Questo netecnica w utilizzando bioanalizzatore consente la misurazione dell'attività mitocondriale in cellule intatte, che conserva più l'ambiente cellulare che valutare mitocondri isolati.

Le applicazioni future o Indicazioni Dopo aver imparato questa tecnica

Questo protocollo è stato progettato e sviluppato per la linea cellulare bEnd.3, ma è anche compatibile con primaria endoteliali vascolari cerebrali (pCVE), le cellule ⁷ o altre endotelio, e lo abbiamo dimostrato nella nostra precedente pubblicazione utilizzando cellule pCVE ^7. Quando vengono utilizzati altri tipi di endotelio, possono essere richiesti il ​​rivestimento della piastra di coltura e l'impiego di fattori di crescita. Tuttavia, il saggio di titolazione è raccomandato per altri tipi di cellule pure. Questo protocollo offre un metodo generale da adottare nella valutazione delle bioenergetica di cellule CVE, e può essere ulteriormente applicata a studi meccanismo o risposte terapeutiche in questo modo.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
bEnd.3 cell line	ATCC	CRL-2299	25 - 30 passages
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Fetal Bovine Serum	Atlanta Biologicals	S12450	10% final concentration
Penicillin/Steptomycin	Hyclone	SV30010	1×100 stocking
0.25% trypsin, 0.03% EDTA solution	Corning	25-053-CI
Sodium pyruvate	Corning	25-000-CI	1.0 µM final concentration
Glucose	Sigma	CAS 50-99-7	25 mM final concentration
Oligomycin	Sigma	O4876	1.0 µM final concentration
Carbonilcyanide 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920	0.5 µM final concentration
Rotenone	Sigma	R8875	1.0 µM final concentration
Antimycin A	Sigma	CAS 1397-94-0	1.0 µM final concentration
Plate wash station	Seahorse Bioscience
Extracellular flux bioanayzer	Seahorse Bioscience	XFe96
Extracellular flux cell culture plate	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux sensor cartridge	Seahorse Bioscience	102416-100
Extracellular flux calibrant solution	Seahorse Bioscience	100840-000
Extracellular flux assay medium	Seahorse Bioscience	102365-100	PH buffered prior to assay