Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı

Özet

Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.

Özet

İletim Elektron Mikroskobu (TEM), proteinleri lokalize etmek ve macromoleküler kompleksleri çok yüksek çözünürlükte görselleştirmek için hücre altyapısını incelemek için olağanüstü bir araçtır. Bununla birlikte, doğa devletine olabildiğince yakın olabilmek için, mükemmel örnek muhafaza edilmesi gerekiyor. Örneğin, aldehitlerle konvansiyonel elektron mikroskopisi (EM) fiksasyonu, iyi bir ultrastrüktürel koruma sağlamaz. Sabitleştiricilerin yavaş nüfuz etmesi hücrenin yeniden düzenlenmesini ve çeşitli hücre bileşenlerini kaybetmesini sağlar. Bu nedenle, klasik EM fiksasyonu yapıların anlık statikleşmesini ve korunmasını ve antijenikliğine izin vermez. Hücre içi olayları incelemek için en iyi seçim, hücreleri kendi doğal hallerinde tutan dondurma-ikame sabitleme yönteminin ardından kriyofizasyonu kullanmaktır. Hücresel altyapı bütünlüğünü koruyan yüksek basınçlı dondurma / dondurma ikamesi, en sık kullanılan yöntemdir, ancak maliyeti gerektirirekipmanı ettik. Burada, süspansiyon hücre kültürleri için dondurularak ikamesi ile devam kullanımlı kolay ve düşük maliyetli dondurarak sabitleme yöntemi sunulmuştur.

Giriş

Örnek hazırlama herhangi elektron mikroskopisi çalışmanın başarısı için kritik öneme sahiptir. Geleneksel EM sabitleme transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ¹ için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntem oldu. İlk olarak, aldehit ve ozmiyum tetroksit kimyasal olarak oda sıcaklığında malzeme sabitlemek için kullanılır. Daha sonra, malzeme, organik çözücüler ile dehidre infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. Bu yöntem, hücre içine fiksatif nüfuz hızına bağlıdır. Sonuç olarak, hücre içerikleri eserler ve ekstraksiyon, genellikle ² görülmektedir.

Cryofixation açık hücresel yapıların ³ korunması için daha iyi bir alternatif, onları etkilemeden onlara tutuyor. Ince bir reçine bölümlerde TEM görüntüleri ⁴ yüksek kalitede cryofixation / dondurma ikame yöntem kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin amacı vitrifiye bi elde etmektirBuz kristallerinin oluşumu ya da hücrelerin ultrastrüktürel zarar vermemek için yeterince küçük içeren buz kristalleri olmadan ological örnekleri. Yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve aynı zamanda (PF) dondurma dalma denir ultra hızlı cryofixation, numune cryofix için iki yöntem bulunmaktadır. HPF anlık hücrede molekülleri immobilize eden ve geleneksel EM tespit neden olduğu zarar görmesini engeller. Donma makineleri ve otomatik ikame cihazlarının çeşitli tipleri ⁵ geliştirilmiştir. Dondurma makinesi ve malzemeler (sıvı azot, vb taşıyıcılar, numune) pahalıdır, ancak yüksek kaliteli bir elektron mikrograflannı ^{6, 7} üretmek için izin verir. PF 1950'lerin başında kullanılan ve basit ve PF prosedürü sırasında bu şirketin ⁸ ucuz, hazırlanan numune, buz kristallerinin en az 3 mil 5 için boyutu elde etmek için hızla dondurulur olarak literatürde tarif edilen bir tekniktir. Bu amaçla, örnekörneğin, etan, propan, ya da etan-propan karışımı gibi bir sıvı cryojen daldırıldı. 1950 yılından bu yana, PF iyileştirmeler kullanıcıların daha fazla sayıda bu teknik kullanılabilir hale getirmek için yapılmıştır. PF yaygın (görüntü küçük nesneleri için kullanılır ise yüksek basınç dondurma, şu anda daha kalın 50 ⁵ um (disk şeklindeki numuneler için 200 um bir kalınlığa kadar) Numunelerin büyük bir çeşitlilik dondurmak için tek uygun bir şekilde <100 nm ), şekilsiz bir buz ^9'un ince bir film içerisinde süspanse makromoleküler kompleksler gibi. Büyük örnekler, örneğin, ökaryotik hücreler için, PF cryofixed, ancak bu tür kılcal boru veya sandviç sistemleri ^{8, 10, 11} ya da numune tutucu, gerektirir.

Burada, hızlı, kolay kullanımlı ve çeşitli süspansiyon hücre kültürleri için kullanılabilir düşük maliyetli dalma donma / dondurularak ikame teknolojisi sunulmuştur.

Protokol

Formvar Izgara Film hazırlanması 1.

NOT: Kişisel koruyucu ekipman (eldiven, laboratuvar önlüğü, gözlük) kullanılarak davlumbaz altında kloroform manipülasyon gerçekleştirin. 400 göz elektron mikroskopisi bakır ızgaralar kullanın. Diğer grid türleri (diğer örgü boyutları, altın, nikel ızgaraları) ile, dondurma işleminin kalitesi kötüdür.

1. kloroform içinde% 0.3 formvar 100 mL'lik bir çözelti hazırlayın. o ajitasyon olmadan gecede çözülmeye bırakın.
2. 400 mesh elektron microscopycopper ızgaraları (çap 3.05 mm) bir cam şişede (yüksekliği 3 cm ve çapı 2 cm) aseton içeren (inç kare başına delik sayısı) koyun. elin dairesel bir hareketi ile bir cam şişe karıştırın. Plastik bir transfer pipet yardımıyla aseton çıkarın. Çözücü, 5 dakika için buharlaşmasına izin verin. bir filtre kağıdı üzerine onları dökülerek ızgaraları transferi ve bunları 5 dakika boyunca kurumaya bırakılır.
3. Kaygan / parlak kadar tüysüz bir bez ile silerek bir 76 x 26 ^mm2 bir cam slayt parlatmak.
4. Bir kristalleştirici (çap 15 cm, yükseklik: 7 cm kapasitesi 1200 mL) almak ve damıtılmış su ile ağzına kadar doldurun. tozu gidermek için iki kez yüzeyi üzerinde bir cam çubuk geçirerek su yüzeyini temizleyin.
5. iki parmak arasındaki cam slayt tutun ve birkaç saniye formvar çözeltide daldırın. o dik 5 dakika boyunca baş aşağı beher altında kurumaya tutun.
6. Şerit, kuru bir olduğunda, filmin sınırları slayt yerinden oynamasına tanımlamak için keskin bir tıraş bıçağı ile bir cam slayt kenarlarını skoru.
7. Derin bir nefes alın ve üzerine ve biraz opak filmi işlemek ve görünürlüğünü artırmak için filmin altında su buharı bir katman almak için slayt üzerine ağır nefes verin.
   1. Hemen yaklaşık 30 ° 'lik bir açı ile sürgünün alt dokunarak kristalleştirici su yüzeyi üzerine filmin yüzer. slayt filmin serbest olsun ve kristalleştirici su yüzeyi üzerine soyulabilir. Yavaşça ile filmi çekipcımbız, gerekirse.
8. Yavaşça ızgaraları uygun kalınlıkta (yaklaşık 10 nm) ve kırışıklık olmadan vardır bölgelerde su yüzeyinde yüzen film üzerine yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirin.
9. Bunlar kristalleştirici su yüzeyinde yüzecek Joseph kağıt ızgaraları kaplayarak filmi al.
   1. tek elle Yusuf kağıdı tutarak, filmin bir ucuna Yusuf kağıdın bir ucunu dokunun. Joseph kağıt tamamen ıslak kadar bekleyin. takılıp ızgaraları ile Yusuf kağıdı çıkarın.
10. son kurutma ve oda sıcaklığında kullanılmadan önce depolama için kapalı bir Petri tabağına 24 saat ızgaraları yerleştirin.

Donma-ikame Orta 2. Hazırlık

Not: Osmiyum tetroksit (OsO ₄₎ ve uranil asetat tehlikeli kimyasal maddelerdir. Bir laboratuvar önlüğü ve eldiven gibi uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) giyerek çeker ocakta bunları işleyin. follkullanım için güvenlik önleminin (OsO ₄₎ ve uranil asetat ow. OSO ₄ sızmasını önlemek için O-halkası cryovials kullanın.

1. ultrastrüktürel çalışmalar
   1. Bir cam şişeye cam OsO ₄ ampul koyun.
   2. şişeyi sallayarak ampulü kırın.
   3. % 4 nihai konsantrasyon elde etmek üzere aseton uygun bir hacim,% 100'e ekleyin.
   4. Karıştırın ve 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları akıtın.
2. Protein ile immün
   1. bir cam şişeye uranil asetat 0.05 g yerleştirin.
   2. % 100 aseton, 50 ml ilave edilir.
   3. Manyetik bir karıştırıcı ile çözelti ilave edin. Çözelti berraklaştığında, bir 0.2 mikron filtre kullanılarak filtre.
   4. 1.8 mL cryovials içine 1.5 ml alikotları koyun.
      Not: dalma dondurma işleminden önce dondurularak ikame ortamı içeren cryovials hazırlayın ve -84 ° C'de derin dondurucuda muhafaza edin. atmak cam şişeyi ters çevirinTehlikeli atık OsO ₄ ampul.

Hücrelerin 3. hazırlanması

NOT: Bu adım yönteminin başarısı için kritik öneme sahiptir. tüm hücre türlerinde, hücrelerin belirtilen sayıda elde etmek için hücreleri büyür. Belirtilen zaman ve hızda belirtilen tüp içinde santrifüje.

1. aşağıdaki gibi farklı hücre tipleri ile ilgili topakların uygun bir kıvam elde etmek için, hücreleri büyütmek:
   1. Saccharomyces cerevisiae ve Schizosaccharomyces pombe için, en az ya da tam sıvı ortam 5 ml maya inoküle. 28 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültür, 600 nm'de _(OD600) 'deki optik yoğunluk ölçülür. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD ₆₀₀ maya hücrelerinin seyreltin. 1 x 10 ⁹ maya hücreleri ⁷ elde etmek üzere, döndürme, 28 ° C'de inkübe hücreleri devam edin.
   2. Leishmania kamçıda için, yaşlılık% 7.5 FCS (inek fetus serumu) ile 5 ml AM ortamında culate parazitleri. 24 ° C'de döner (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD ₆₀₀ ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD ₆₀₀ parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 ⁸ parazit hücreleri ¹² elde etmek üzere, döndürme, 24 ° C'de hücreler inkübe devam edin.
   3. Trypanosoma brucei için,% 10 FCS ve 30 | ig / ml higromisin ile SDM-79 ortamı, 5 mL parazitleri inoküle. 27 ° C, döndürme (180 rpm) ile gece boyunca inkübe edilir. Gece boyunca kültüre göre OD ₆₀₀ ölçün. 50 ml taze seçici ortam içinde 0.2'lik bir _OD600'e parazit hücreleri seyreltin. 5 x 10 ⁸ parazit hücreleri ¹³ elde etmek üzere, döndürme, 27 ° C'de hücreler inkübe devam edin.
   4. Escherichia coli, 100 ug / ml ampisilin ile DYT ortamı 5 ml bakteri inoküle. (Dönen, 37 ° C'de gece boyunca 180 inküberpm). Gece boyunca kültüre göre OD ₆₀₀ ölçün. 0.2 50 ml taze seçici ortam içinde, bir OD ₆₀₀ bakteri hücreleri seyreltin. 5 x 10 ¹⁰ bakteri hücreleri ¹⁴ elde etmek üzere, döndürme, 37 ° C'de inkübe hücreleri devam edin.
      Not: bir gece boyunca inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit büyüme fazında olabilir. deney yoluyla belirlenen şekilde çok yavaş büyüyen hücre suşları, bir gece, veya bir hücre, daha fazla sayıda aşılanması daha inkübasyon kat daha gerektirebilir.
2. Tüm hücre tipleri için 1.500 x g'de 3 dakika boyunca 50 ml'lik bir polipropilen tüpü ve santrifüj hücreleri ihtiva eden kültür ortamı aktarın.
3. Süpernatantı ve ilgili hücre kültürü ortamı, 1 ml tüm hücre tipleri pelletini.
4. Santrifüj 3,900 x g, 1 dakika boyunca bir mikrosantrifüj tüpü içinde, tüm hücre tipleri. Tamamen süpernatant kaldırmak.
5. hücreleri buz üzerinde tutun.

4. Propan Sıvılaşma

Not: dikkatle sıvı azot tutun. cryogloves ve googles dahil olmak üzere kişisel koruyucu ekipman kullanın. Propan potansiyel olarak patlayıcı, yani iyi havalandırılmış bir odada veya davlumbaz altında sıvılaşma gerçekleştirin. Hiçbir açık alevler izin verilir.

1. bir polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 150 mL koyun. dondurmadan önce sıvı azot içinde bir pirinç fincan (yükseklik 3.6 cm, çap 2 cm, kalınlığı 1.5 mm) yerleştirin. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin.
2. kabarcıklar pirinç kâse soğuk olduğundan emin olmak için geçene kadar bekleyin.
3. pirinç kabı duvarı ile temas halinde propan silindire bağlı hortumu koyun.
4. Yavaşça propan silindir valfini açmak.
   NOT: Bu adımda, propan pirinç fincan sıvılaşır.
5. propan silindir valfinin kapatılmasına ve, hızla gaz hortumu kaldırarak sıvılaşma durdurun.
6. Sıvı ni polistiren kabınıpirinç fincan üstten 5 mm'ye kadar Trogen. Sıvı azot pirinç fincan nüfuz etmesine izin vermeyin.

Örnek 5. Dalma Donma

1. polistiren tepsisine sıvı azot, yaklaşık 200 mL koyun. sıvı nitrojen içinde koyarak çok az pirinç bardak (yükseklik 1.5 cm çapında 2.5 cm; 1 mm kalınlık) dondurun. bir süspansiyon hücre örneği için bir fincan koyun. numuneleri karıştırmak için dikkatli olun. Bu amaçla, vb kap 2, içinde, kap 1 'de örnek 2 örnek 1 koydu.
2. sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun.
3. 3.5 'de elde edilen pelet bir çift kenar kesme iğne dalma.
4. cımbız kullanarak, bölüm 1'de hazırlanan formvar ile kaplanmış bir 400 ağ gözü, bakır mikroskopi ızgara alır.
5. diseksiyon iğnesi kullanılarak, ızgara üzerinde 3.5 'de elde edilen pelet bir damla yerleştirin. Farklı damla boyutları (örneğin 2, 5 ve 10 mcL) deneyin.
6. Çok hızlı bir şekilde sıvı propan genine cımbız tarafından tutulan kılavuz dalmabölümünde 4 puan ve birkaç saniye süre ile dairesel bir hareket ile kılavuz karıştırın.
7. Hızla bölüm 5.1'de dondurulmuş küçük pirinç kabına cımbız ile dondurulmuş ızgara aktarın.
   NOT: Her numune için, en az 3 ızgara oluşturmak. Her zaman bir bakır ızgara yapmadan önce cımbız dondurun.

6. dondur-ikame

Not: Osmiyum tetroksit potansiyel olarak uçucu, yani buhar kartuşları olan bir hava temizleyici solunum cihazı kullanın. Dalma dondurma önce sıvı nitrojen içerisinde fiksatif Donma da bir çözeltidir.

1. ince yapısı çalışmaları için, bölüm 2.1'de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. immüno çalışmaları için, bölüm 2.2'de hazırlanan dondurma-ikame ortamı içeren 1.8 mL dondurarak saklamaya uygun vialler tüpler açın. cryovials kapağını yerleştirin.
2. sıvı nitrojen içinde kendi uç saplayarak cımbız dondurun.
3. Hızla kapağı çıkarın ve dondurulmuş ızgaraları i aktarmakcımbız kullanarak cryovials nto.
4. geri cryovials başlığını takın.
5. Her numunenin her grid için tekrar edin.
6. Numuneler dondurularak ikame ortamında sağlamak için el bir dairesel hareket ile cryovials tüm kapaklar kapatın ve karıştırın.
7. Dondurarak ikame işlemi sırasında -84 ° C dondurucu içinde 3 gün boyunca hava geçirmez bir kutuya cryovials yerleştirin.

7. Örnek Isınma

1. İnce çalışmaları
   1. bir polistiren tepsisine cryovials Taşıma bir -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için). 1 saat boyunca -30 ° C'de derin dondurucuda yerleştirin.
   2. 2 saat boyunca -15 ° C dondurucuda cryovials yerleştirin. Oda sıcaklığında 30 dakika süre ile, daha sonra 2 saat boyunca 4 ° C 'de numuneler ve.
   3. Plastik bir transfer pipet yardımıyla donma ikame orta çıkarın. % 100 aseton yaklaşık 500 mcL ekleyin.
   4. 1.8 mi dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırınhızla dairesel el hareketi ile cam bir şişe içinde ızgaraları (yüksekliği 3 cm, çap 2 cm) ihtiva eden aseton (1.5 mL) dökün.
   5. tüm ızgaraları aktardıktan emin olmak için,% 100 aseton, 1 ml ile aynı cryovial durulayın. elin dairesel bir hareketi ile cryovial ilave edin ve cam şişe içinde dondurarak saklamaya uygun vialler içeriğini dökün.
   6. 10 dakika% 100 aseton 3 kez 3 mL her bir cam şişe durulayın.
   7. Referans ¹⁵ de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. aseton (% 25,% 50 ve% 75), epoksi reçinesi artan konsantrasyonları ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 epoksi reçinesi ile örnek yerleştirin.
2. çalışmaları immunolabeling
   1. bir polistiren tepsisine 1.8 mL cryovials Taşıma -30 ° C dondurucu (ani sıcaklık artışı önlemek için).
   2. Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca cryovials yerleştirin.
   3. -30 ° 'de Cı dondurucu, elin dairesel bir hareketi ile dondurarak saklamaya uygun vialler karıştırın ve hızlı bir polipropilen şişe (yükseklik 5 cm ve çapı 1.5 cm), dondurularak ikame ortamı dökün.
   4. Taze dondurularak ikame orta 2 ml dondurma ikame ortamı değiştirin.
   5. Bir -30 ° C dondurucu içinde 2 saat boyunca polipropilen şişe yerleştirin.
   6. % 100 aseton ve 2 mL% 100 2 mL etanol ile 1 saat boyunca üç kez 1 saat boyunca polipropilen şişe yıkayın.
   7. Referans ¹⁵ de tarif edildiği gibi gömme ve dahil prosedürleri takip edin. Akrilik reçinenin artan konsantrasyonlarının (% 25,% 50, ve aseton içinde% 75) ile örnek emprenye ve jelatin kapsüller içinde% 100 akrilik reçine ile örnek yerleştirin.

Numunelerin 8. Görselleştirme

1. gömme sonra, bir ultramikrotom ile numune 80 mil ultra-ince bölümler yapmak. 1 dakika için oda sıcaklığında% 2 kurşun sitrat ile bölümleri Kontrasteşek = "xref"> 15.
2. Bölümler ¹⁵ gözlemlemek için 80 kV veya 120 kV elektron mikroskobu kullanarak.

Sonuçlar

Bu makalede, ultrastrüktürel (Şekil 1 ve Şekil 2) ve immunolabeling (Şekil 3) çalışmaları için, kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir dalma dondurma yöntemi sunulmuştur. Biz dondurularak değişikliği işlemleri için ve ısınma prosedürü yerine özel bir sistem kullanarak 24 saat 6'dan az saat sürer o özel ekipmanlara sahip olmak gerekli olmadığını göstermektedir. <...

Tartışmalar

TEM organeller, hücreler ve dokuların ultrastrüktürel gözlem için güçlü bir yöntemdir. Cryofixation / dondurularak ikame anda hem ince yapısı ve protein antijenisite korunması için en iyi yöntemdir. Kimyasal fiksatifler nüfuz ve ultrastrüktürün ² tam istikrarlı önce yapısal yeniden düzenlemeleri sağlayan çok yavaş bir şekilde hareket ederler. Tersine, cryofixation / dondurularak ikamesi anında hücresel yapılar ⁴ dengeler. Bununla birlikte, cry...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11