Погружение Замораживание: Инструмент для ультраструктурных и иммунолокализации исследований в суспензии клеток в просвечивающей электронной микроскопии

Резюме

Эта рукопись описывает простой в использовании и недорогой метод cryofixation для визуализации клеток суспензии с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Аннотация

Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является экстраординарным инструментом для изучения ультраструктуры клеток, для того, чтобы локализовать белки и визуализации макромолекулярных комплексов с очень высоким разрешением. Однако, чтобы получить как можно ближе к родному государству, требуется совершенное сохранение образца. Обычная электронная микроскопия (ЭМ) фиксация с альдегидами, например, не обеспечивает хорошую сохранность ультраструктурной. Медленное проникновение фиксаторов вызывает реорганизацию клеток и потерю различных клеточных компонентов. Таким образом, обычные ЭМ фиксация не позволяет мгновенной стабилизации и сохранения структур и антигенности. Лучший выбор для изучения внутриклеточных событий является использование cryofixation с последующим методом фиксации сублимационной замещения, который держит клетки в нативном состоянии. Замораживание под высоким давлением / вымораживание замещение, которое сохраняет целостность клеточных ультраструктур, является наиболее часто используемым методом, но требует expensiве оборудования. Здесь, простой в использовании и недорогой способ фиксации замораживание с последующим вымораживанием замещения для суспензии культур клеток представлена.

Введение

Подготовка образцов имеет решающее значение для успеха любого электронной микроскопии исследования. Обычные фиксации ЭМ был основным методом для фиксации ткани или клеток для просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) ^1. Во-первых, альдегиды и четырехокись осмия используют химически фиксировать материал при комнатной температуре. Затем материал обезвоживает с помощью органических растворителей, инфильтрации и заливал в эпоксидной смоле. Этот метод зависит от скорости проникновения фиксаторов в клетку. Следовательно, артефакты и добыча клеточного содержимого, как правило , наблюдаются ^2.

Cryofixation явно лучшая альтернатива для сохранения клеточных структур ^3, сохраняя их нетронутыми. Высокое качество изображений ПЭХ ⁴ в тонких срезах смол может быть получено с использованием методы замещения cryofixation / замерзания. Цель этого метода состоит в получении остеклованного битодические образцы без образования кристаллов льда или содержащих кристаллы льда, достаточно маленьких, чтобы не повредить ультраструктуры клеток. Замораживание высокого давления (ФВЧ) и сверхбыстрый cryofixation, который также называют врезанием замораживанием (PF), два метода cryofix образцов. ФВЧ удерживающую молекулы в клетке мгновенно и позволяет избежать повреждений, вызванных обычной фиксации EM. Несколько типов морозильных машин и устройств автоматического замещения были разработаны ^5. Замораживание машины и расходные материалы (жидкий азот, образец носители и т.д.) являются дорогостоящими, но они позволяют производить высококачественные электронные микрофотографии ^{6, 7.} ПФ представляет собой метод , который был использован в начале 1950 - х годов и описан в литературе , как простые и дешевые ⁸ .Во процедуру PF, приготовленный образец замораживали при быстром темпе , чтобы получить кристаллы льда размером менее 3 до 5 нм. С этой целью, образецпогрузился в жидкий криогенный, таких как этан, пропан, этан или пропан-смеси. С 1950-х годов, улучшения PF было сделано, чтобы сделать этот метод доступным для большего числа пользователей. Замораживание под высоким давлением , в настоящее время является единственным реальным способом заморозить большое разнообразие образцов толщины более 50 мкм (до толщины 200 мкм для дискообразных образцов) ^5, в то время как ПФ широко используется для изображений малых объектов (<100 нм ), такой как макромолекулярные комплексы , взвешенных в виде тонкой пленки аморфного льда ^9. Более крупные образцы, например , эукариотических клетках, может быть cryofixed ОФ, но требует держатели для образцов, таких как капиллярное медных трубок или систем сэндвич - ^{8, 10, 11.}

Здесь, быстрый, простой в использовании и низкой стоимости погружной технологии замораживания / сублимационной замены используемой для различных культур клеток суспензии представлена.

протокол

1. Получение пленки формвар сетки

Примечание: Выполнение манипуляций хлороформ под вытяжкой с использованием средств индивидуальной защиты (перчатки, лабораторный халат, очки). С помощью 400 меш электронной микроскопии медные сетки. С другими типами сетки (другие размеры сетки, золото и никель сетках), качество замораживания хуже.

1. Готовят раствор 100 мл 0,3% формвар в хлороформе. Позвольте ему раствориться в течение ночи без перемешивания.
2. Поместите 400 меш (число отверстий на квадратный дюйм) электронно-microscopycopper сетки (диаметр 3,05 мм) в стеклянный флакон (высота 3 см и диаметром 2 см), содержащей ацетон. Перемешать стеклянный пузырек с круговым движением руки. Удалите ацетон с пластиковой пипеткой передачи. Разрешить испарение растворителя в течение 5 мин. Передача сетки путем заливки их на фильтровальную бумагу и дать им высохнуть в течение 5 мин.
3. Польский стеклянный слайд 76 х 26 мм ^2, протерев его безворсовой тканью до блестящей / скользкой.
4. Возьмет кристаллизатор (диаметр 15 см, высоту: 7 см и емкость 1200 мл) и заполнить его до краев дистиллированной воды. Очистить поверхность воды путем пропускания бар стекла по поверхности в два раза, чтобы удалить пыль.
5. Держа предметное стекло между двумя пальцами и окуните его в формвар раствора в течение нескольких секунд. Держите его в вертикальном положении, чтобы высушить под мензурку перевернутой в течение 5 мин.
6. Когда пленка сухая, оценка краев стекла с острым лезвием бритвы, чтобы определить пределы пленки, чтобы быть вытеснены из слайда.
7. Сделайте глубокий вдох и выдох в значительной степени на слайд , чтобы получить слой паров воды на и под пленкой , чтобы вынести пленку немного непрозрачные и повысить его видимость.
   1. Сразу всплывает пленку на поверхность кристаллизатора воды, прикоснувшись к нижней части ползуна с углом около 30 °. Пусть выпуск пленки с горкой и очистить его на поверхность кристаллизатора воды. Аккуратно вытяните пленку с спинцет, если это необходимо.
8. Осторожно положите сетки лицевой стороной вниз на пленке, плавающей на поверхности воды в областях, которые имеют соответствующую толщину (около 10 нм) и без морщин.
9. Возьмите пленку покрытия сетки с Джозефом бумагой , как они плавают на поверхности кристаллизатора воды.
   1. Держа Джозеф бумагу с одной стороны, нажмите один конец Джозефа бумаги к одному концу фильма. Подождите, пока Джозеф бумага полностью мокрой. Удалите Джозеф бумагу с сетками, застрявших на.
10. Поместите сетки в течение 24 ч в закрытой чашке Петри для окончательной сушки и хранения до использования при комнатной температуре.

2. Получение Замораживание-заместительной среды

Примечание: осмий осмий (OsO ₄₎ и уранил ацетат являются опасными химическими веществами. Обращайтесь с ними в вытяжном шкафу при ношении средств индивидуальной защиты (СИЗ), в том числе лабораторный халат и перчатки. FollOW предупреждения безопасности при обращении (OSO ₄₎ и уранил ацетат. С помощью уплотнительных колец криопробирки , чтобы избежать утечки OsO _4.

1. ультраструктурные исследования
   1. Поместите стекла OSO ₄ ампулы в стеклянной колбе.
   2. Перерыв ампулу, встряхивая колбу.
   3. Добавьте соответствующий объем ацетона 100%, чтобы получить конечную концентрацию 4%.
   4. Перемешать и обойтись 1,5 мл аликвоты в 1,8 мл криопробирки.
2. Белок иммуномечение
   1. Поместите 0,05 г ацетата уранила в стеклянной колбе.
   2. Добавьте 50 мл 100% ацетона.
   3. Раствор перемешивают с помощью магнитной мешалки. Когда раствор становится прозрачным, фильтровать через фильтр 0,2 мкм.
   4. Разлить 1,5 мл аликвоты 1,8 мл во криопробирок.
      Примечание: Подготовьте криопробирки, содержащие вымораживание заместительной среду перед процессом замораживания погружения и держать их в -84 ° C морозильника. Обратить стеклянную колбу выбрасывайтеOsO ₄ ампулы в опасных отходах.

3. Подготовка клеток

Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для успеха этого метода. Для всех типов клеток, роста клеток, чтобы получить указанное количество клеток. Центрифуга в указанной трубе в определенное время и скорость.

1. Для того, чтобы получить соответствующую консистенцию гранул из различных типов клеток, роста клеток следующим образом:
   1. Для Saccharomyces CEREVISIAE и Schizosaccharomyces pombe, инокуляции дрожжей в 5 мл минимальной или полной жидкой среде. Инкубируют в течение ночи при 28 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD ₆₀₀₎ ночной культуры. Развести дрожжевые клетки на OD ₆₀₀ 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 28 ° С, вращение, чтобы получить 1 × 10 ⁹ клеток дрожжей ^7.
   2. Для Leishmania жгутика, иноculate паразиты в 5 мл среды с AM 7,5% FCS (фетальной сыворотки теленка). Инкубируют в течение ночи при 24 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность ₆₀₀ ночной культуры. Развести клетки паразита к OD ₆₀₀ 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 24 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 ⁸ клеток паразита ^12.
   3. Для Trypanosoma brucei, инокуляции паразитов в 5 мл СОЙ-79 среды с добавлением 10% FCS и 30 мкг / мл гигромицином. Инкубируют в течение ночи при 27 ° C, вращая (180 оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность ₆₀₀ ночной культуры. Развести клетки паразита к OD ₆₀₀ 0,2 в 50 мл свежей селективной среде. Продолжали инкубировать клетки при 27 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 ⁸ клеток паразита ^13.
   4. Для кишечной палочки, инокуляции бактерий в 5 мл среды DYT с 100 мкг / мл ампициллина. Инкубируют в течение ночи при 37 ° C, вращая (180оборотов в минуту). Измерьте оптическую плотность ₆₀₀ ночной культуры. Развести клетки бактерий к OD ₆₀₀ 0,2 в 50 мл свежей селективной среды. Продолжали инкубировать клетки при 37 ° С, вращение, чтобы получить 5 × 10 ¹⁰ бактериальных клеток ^14.
      Примечание: После инкубации в течение ночи, клетки в культуре может быть либо логарифмической или стационарной фазе роста. Очень медленно растущие клеточные штаммы могут потребовать времени инкубации более чем на одну ночь, или прививки большего числа клеток, как определено эмпирически.
2. Для всех типов клеток, передавать культуральную среду, содержащую клетки в 50 мл полипропиленовую пробирку и центрифугируют в течение 3 мин при 1500 х г.
3. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок всех типов клеток в 1 мл соответствующей среды для культивирования клеток.
4. Центрифуга всех типов клеток в микроцентрифужных трубках в течение 1 мин при 3,900 г х. Полностью удалить супернатант.
5. Держите клетки на льду.

4. Сжижение Пропан

Примечание: Ручка жидкого азота с осторожностью. Используйте средства индивидуальной защиты, включая cryogloves и Googles. Пропан является потенциально взрывоопасным, поэтому выполнить разжижение в хорошо проветриваемом помещении или под вытяжкой. Нет открытого огня не допускается.

1. Поместите около 150 мл жидкого азота в полистирола лоток. Поместите медную чашку (высота 3,6 см, диаметр 2 см и толщиной 1,5 мм) в жидком азоте, чтобы заморозить его. Не позволяйте жидкий азот проникает в медную чашку.
2. Подождите, пока пузырьки не спадают, чтобы быть уверенным, что латунный чашка заморожен.
3. Поместите шланг, соединенный с пропаном цилиндра в контакте с латунной стенкой чашки.
4. Осторожно открыть вентиль баллона пропана.
   Примечание: На этом этапе, пропан сжижается в медной чашке.
5. Остановить сжижение, закрыв вентиль баллона пропана и быстрое удаление газового шланга.
6. Заполните полистирола лоток с жидким NiTrogen до 5 мм от верхней части латунной чашки. Не позволяйте жидкий азот проникает в латунную чашку.

5. Погружение Замораживание образца

1. Поместите около 200 мл жидкого азота в полистирола лоток. Замораживание маленькие медные чашки (диаметр высота 1,5 см на 2,5 см и толщиной 1 мм), поместив их в жидком азоте. Положите одну чашку для одной пробы суспензии клеток. Будьте осторожны, чтобы не перепутать образцы. С этой целью, поставить образец 1 в чашке 1, образец 2 в чашке 2, и т.д..
2. Замораживание пинцета, погружая их кончик в жидком азоте.
3. Окунитесь двойным край рассекает иглу в осадке, полученной в 3.5.
4. С помощью пинцета, возьмите меди микроскопии сетки 400 меша с покрытием формваром, полученным в разделе 1.
5. Использование рассекает иглы, поместите каплю осадки, полученную в 3,5 на сетке. Попробуйте разные размеры капель (например , 2, 5 и 10 мкл).
6. Очень быстро погрузить сетку, проводимый пинцет в ген жидкого пропанарейтинг в разделе 4 и движение сетки с круговым движением в течение нескольких секунд.
7. Быстро передавайте замороженную сетку с помощью пинцета с маленькой латунной чашкой замороженной в разделе 5.1.
   Примечание: Для каждого образца, составит не менее 3-х элементов. Всегда замораживать пинцет, прежде чем принимать медную сетку.

6. Замораживание-замещение

Примечание: осмий осмий является потенциально нестабильным, поэтому используйте респиратор очистки воздуха с картриджами пара. Замораживание закрепителя в жидком азоте до погружения замораживания также является решением.

1. Для исследования ультраструктуры, открыть 1,8 мл пробирки, содержащей криопробирку вымораживания замещения среды, полученную в разделе 2.1. Для исследований иммунолокализации, открыть 1,8 мл пробирки, содержащей криопробирку вымораживания замещения среды, полученную в разделе 2.2. Поместите крышку на криопробирках.
2. Замораживание пинцета, погружая их кончик в жидком азоте.
3. Быстро снять крышку и передачи замороженных Сетки IНТО в криопробирки с помощью пинцета.
4. Наденьте крышку на криопробирках.
5. Повторите эту операцию для каждой сетки каждого образца.
6. Закройте все колпачки и перемешать криопробирки с круговым движением руки, чтобы обеспечить образцы в сублимационной заместительной среде.
7. Поместите криопробирки в герметичном ящике в течение 3 дней в морозильной камере C -84 ° во время процесса замораживания-замещения.

7. Пример Warming

1. исследования ультраструктуры
   1. Несите криопробирки в полистирола лоток (чтобы избежать внезапного повышения температуры) до C морозильнике -30 °. Поместите их в -30 ° C морозильнике в течение 1 ч.
   2. Поместите криопробирки в морозильной камере C -15 ° С в течение 2 ч. Поместите образцы при температуре 4 ° С в течение 2 ч и затем в течение 30 мин при комнатной температуре.
   3. Удалить замену сублимационной среду с пластиковой пипеткой передачи. Добавить приблизительно 500 мкл 100% ацетона.
   4. Перемешивайте 1,8 мл криопробиркус круговым движением руки и быстро залить ацетон (1,5 мл), содержащий сетку в стеклянную пробирку (высота 3 см и диаметром 2 см).
   5. Ополосните же криопробирку с 1 мл 100% ацетона, чтобы быть уверенным, что передал все сетки. Перемешать криопробирку с круговым движением руки и вылить содержимое из криопробирки в стеклянном флакон.
   6. Промыть каждый флакон стекла с 3 мл 100% ацетона в 3 раза в течение 10 мин.
   7. Выполните процедуры вложения и включения , как описано в ссылке ^15. Пропитать образец с увеличением концентрации эпоксидной смолы в ацетоне (25%, 50% и 75%) и вставлять образец с 100% эпоксидной смолой в желатиновых капсулах.
2. иммунноокрашивания исследования
   1. Провести в 1,8 мл криопробирки в полистирола лоток (чтобы избежать внезапного повышения температуры) до -30 ° C морозильнике.
   2. Поместите криопробирки в течение 2 ч в морозильной камере C -30 °.
   3. Через -30 ° С морозильной камерой, перемешать криопробирку с круговым движением руки и быстро влить замену сублимационной среды в полипропиленовую пробирку (высота 5 см и диаметром 1,5 см).
   4. Заменить замену сублимационной среду с 2 мл свежего вымораживания замещения среды.
   5. Поместите флакон полипропилена в течение 2 ч в морозильной камере C -30 °.
   6. Ополосните флакон полипропилена в течение 1 ч с 2 мл 100% ацетона и три раза в течение 1 ч с 2 мл 100% -ного этанола.
   7. Выполните процедуры вложения и включения , как описано в ссылке ^15. Пропитать образец с возрастающими концентрациями акриловой смолы (25%, 50% и 75% в ацетоне), и вставлять образец с 100% акриловой смолой в желатиновых капсулах.

8. Визуализация образцов

1. После того, как вложение, составят 80 нм ультра-тонких срезов образцов с ультрамикротомом. Контраст секций с 2% цитратом свинца при комнатной температуре в течение 1 минзадница = "Xref"> 15.
2. Используйте 80 кВ или 120 кВ электронный микроскоп для наблюдения секции ^15.

Результаты

В этой статье, простой в использовании и недорогой метод погружения замораживания ультраструктурных (фиг.1 и фиг.2) и иммунноокрашивания (рисунок 3) исследований представлена. Показано, что не нужно иметь специальное обо?...

Обсуждение

ТЭМ является мощным методом для ультраструктурного наблюдения органелл, клеток и тканей. Криофиксация / замещение замораживания в настоящее время является лучшим методом для сохранения как ультраструктуры, так и белковой антигенности. Химические фиксаторы проникают и действуют очен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11