Congelamento Plunge: Uma ferramenta para os estudos ultra-estruturais e de imunolocalização de células em suspensão em Microscopia Eletrônica de Transmissão

Resumo

Este manuscrito descreve um método fácil de usar e criofixação de baixo custo para a visualização de células em suspensão por meio de microscopia electrónica de transmissão.

Resumo

Microscopia Eletrônica de Transmissão (TEM) é uma ferramenta extraordinária para estudar a ultra-estrutura celular, a fim de localizar proteínas e visualizar complexos macromoleculares em resolução muito alta. No entanto, para chegar o mais perto possível do estado nativo, preservação amostra perfeita é necessária. fixação convencional microscopia electrónica (EM) com aldeídos, por exemplo, não proporcionar uma boa preservação ultraestrutural. A penetração lenta de fixadores induz reorganização de células e perda de vários componentes celulares. Portanto, a fixação EM convencional não permite para uma estabilização instantânea e preservação de estruturas e antigenicidade. A melhor escolha para examinar eventos intracelulares é usar criofixação seguido pelo método de fixação de congelamento e de substituição que mantém as células em seu estado nativo. congelamento de alta pressão / congelar-substituição, o qual preserva a integridade da ultra-estrutura celular, é o método mais vulgarmente utilizado, mas requer expensive equipamento. Aqui, um método fácil de usar e congelamento de fixação de baixo custo seguido de congelamento de substituição de culturas de células de suspensão é apresentado.

Introdução

A preparação da amostra é crítico para o sucesso de qualquer estudo de microscopia electrónica. EM convencional de fixação foi o principal método para a fixação de tecidos ou células por microscopia electrónica de transmissão (TEM) ^1. Em primeiro lugar, aldeídos e tetróxido de ósmio são usados ​​para fixar o material quimicamente à temperatura ambiente. Em seguida, o material é desidratado com solventes orgânicos, infiltrados e embebidos em resina epoxi. Este método é dependente da taxa de penetração de fixadores para dentro da célula. Por conseguinte, os artefactos e extracção de conteúdos celulares são geralmente observados ^dois.

Criofixação é claramente a melhor alternativa para a preservação de estruturas celulares ^3, mantendo-as intactas. A mais alta qualidade de imagens de TEM em ⁴ secções finas de resina pode ser obtida utilizando o método de substituição criofixação / congelamento. O objectivo desta técnica é a obtenção de bi vitrificadosamostras ological sem formação de cristais de gelo ou contendo cristais de gelo pequenos o suficiente para não danificar a ultra-estrutura das células. congelamento de alta pressão (HPF) e criofixação ultra-rápida, que também é chamado mergulho congelação (PF), são dois métodos para cryofix amostras. HPF imobiliza moléculas na célula instantaneamente e evita o dano causado por fixação EM convencional. Vários tipos de máquinas de congelamento e dispositivos de substituição automática foram desenvolvidos ^5. As máquinas de congelamento e de consumo (azoto líquido, espécime transportadoras, etc.) são caros, mas eles permitem a produção de micrografias electrónicas de alta qualidade ^{6, 7.} PF é uma técnica que foi usada no início dos anos 1950 e está descrito na literatura como simples e barato ⁸ .Durante o procedimento PF, a amostra preparada é congelado a uma taxa rápida para se obter cristais de gelo com tamanho inferior a 3 a 5 nm. Para este fim, a amostra émergulhado num líquido criogénico, tal como etano, propano, ou uma mistura de etano-propano. Desde 1950, as melhorias de PF ter sido feito para tornar esta técnica disponível para um número maior de usuários. Congelamento de alta pressão é actualmente o único meio viável para congelar uma grande variedade de amostras mais espessa do que 50? M (até uma espessura de 200 um para as amostras em forma de disco) ^5, enquanto que PF é amplamente utilizado para a imagem objectos pequenos (<100 nm ), tal como complexos macromoleculares em suspensão em um filme fino de gelo amorfo ^9. Amostras maiores, por exemplo células eucarióticas, pode ser criofixados por PF, mas requer suportes de amostra, tais como tubos de cobre capilar ou sistemas de sanduíche ^{8, 10, 11.}

Aqui, um rápido, fácil de usar e de baixo custo mergulhar tecnologia / congelamento de substituição de congelamento utilizável para várias culturas de células em suspensão é apresentada.

Protocolo

1. Preparação de Formvar Grade Film

NOTA: Executar manipulação clorofórmio sob uma coifa utilizando equipamento de protecção individual (luvas, bata de laboratório, copos). Use 400 mesh grelhas de cobre de microscopia electrónica. Com outros tipos de grade (outros tamanhos de malha, ouro e grades níquel), a qualidade do congelamento é pior.

1. Prepara-se uma solução de 100 mL de 0,3% formvar em clorofórmio. Permita que ele se dissolver durante a noite sem agitação.
2. Coloque 400 malhas (série de furos por polegada quadrada) grelhas microscopycopper electrões (diâmetro 3,05 mm) em um frasco de vidro (altura de 3 cm e 2 cm de diâmetro) contendo acetona. Agita-se o frasco de vidro com um movimento circular da mão. Remover a acetona, com uma pipeta de transferência de plástico. Permitir que o solvente evapora-se durante 5 min. Transferir as grades ao derramá-las para um papel de filtro e permitir-lhes secar durante 5 min.
3. Polir uma lâmina de vidro 76 x 26 ^mm2 esfregando-o com um pano que não solte fiapos até brilhante / escorregadio.
4. Tomar um cristalizador (diâmetro 15 cm, altura: 7 cm e capacidade de 1200 mL) e preenchê-lo até a borda com água destilada. Limpar a superfície da água por passagem de uma barra de vidro sobre a superfície de duas vezes para remover o pó.
5. Segure a lâmina de vidro entre dois dedos e mergulhá-lo na solução formvar por alguns segundos. Segurá-la na posição vertical para secar sob uma proveta de cabeça para baixo durante 5 min.
6. Quando a película é seca, marcar as extremidades da lâmina de vidro com uma lâmina de barbear afiada para definir os limites da película a ser deslocado a partir do slide.
7. Respire fundo e expire fortemente sobre a lâmina para obter uma camada de vapor de água sobre e sob o filme para tornar o filme um pouco opaco e aumentar a sua visibilidade.
   1. flutuar imediatamente a película sobre a superfície da água do cristalizador por tocar o fundo da lâmina com um ângulo de cerca de 30 °. Deixe o filme de libertação a partir do slide e retire-a sobre a superfície da água cristalizador. Com cuidado, puxe o filme fora com opinças, se necessário.
8. Cuidadosamente, coloque as grelhas de face voltada para baixo sobre a película que flutua na superfície da água nas regiões que são de espessura adequada (cerca de 10 nm) e sem rugas.
9. Escolher-se a película, cobrindo as grelhas com papel Joseph enquanto flutuam sobre a superfície da água cristalizador.
   1. Segurando o papel Joseph com uma mão, toque em uma das extremidades do papel Joseph a uma extremidade do filme. Espere até que o papel Joseph é completamente molhado. Retire o papel Joseph com as grades preso por diante.
10. Coloque as grades durante 24 horas, em uma placa de Petri coberta para a secagem e armazenamento antes da sua utilização, à temperatura ambiente final.

2. Preparação de Meio Freeze-substituição

NOTA: tetróxido de ósmio _(OsO4) e acetato de uranilo são produtos químicos perigosos. Segurá-los no exaustor enquanto vestindo equipamento adequado de protecção individual (EPI), incluindo um jaleco e luvas. Follow os avisos de segurança para a manipulação (OsO ₄₎ e acetato de uranilo. Use criotubos de O-ring, para evitar a fuga de _OsO4.

1. estudos ultra-estruturais
   1. Coloque vidro _OsO4 ampola, num frasco de vidro.
   2. Quebrar a ampola por agitação do balão.
   3. Adicionar um volume apropriado de acetona 100% para obter uma concentração final de 4%.
   4. Agita-se e dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml.
2. imunomarcação de proteínas
   1. Coloque 0,05 g de acetato de uranilo em um frasco de vidro.
   2. Adicionar 50 ml de 100% de acetona.
   3. Agita-se a solução com um agitador magnético. Quando a solução se torna claro, filtrá-lo utilizando um filtro de 0,2? M.
   4. Dispensar 1,5 mL de alíquotas em criotubos de 1,8 ml.
      NOTA: Prepare os criotubos contendo meio de congelamento e de substituição antes de o processo de congelação de imersão e mantê-los em -84 ° C congelador. Inverter o frasco de vidro para jogar fora o_OsO4 ampola na resíduos perigosos.

3. Preparação de células

NOTA: Esta etapa é fundamental para o sucesso do método. Para todos os tipos de células, as células crescem para obter o número indicado de células. Centrífuga no tubo indicado no tempo e velocidade especificada.

1. Para se obter a consistência adequada dos peletes a partir de diferentes tipos de células, crescimento de células como se segue:
   1. Para Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe, inocular levedura em 5 ml de meio líquido mínimo ou completa. Incubar durante a noite a 28 ° C, rotação (180 rpm). Medir a densidade óptica a 600 nm _(OD600) da cultura durante a noite. Dilui-se células de levedura para um _OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 28 ° C, rotação, para se obter 1 x 10 ⁹ culas de levedura ^7.
   2. Para Leishmania flagelo, inoculate parasitas em meio 5 mL de AM com 7,5% de FCS (soro fetal de vitelo). Incubar durante a noite a 24 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD ₆₀₀ da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma _OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 24 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 ⁸ culas parasita ^12.
   3. Para Trypanosoma brucei, inocular parasitas em 5 ml de meio SDM-79 com 10% de FCS e 30? G / ml de higromicina. Incubar durante a noite a 27 ° C, rotação (180 rpm). Medir a OD ₆₀₀ da cultura durante a noite. Dilui-se as células de parasitas para uma _OD600 de 0,2 em 50 mL de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 27 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 ⁸ culas parasita ^13.
   4. Para a Escherichia coli, as bactérias em inocular 5 ml de meio DYT com 100 ug / mL de ampicilina. Incubar durante a noite a 37 ° C, rotação (180rpm). Medir a OD ₆₀₀ da cultura durante a noite. Dilui-se células de bactérias a uma _OD600 de 0,2 em 50 ml de meio selectivo fresco. Continuar-se a incubar as células a 37 ° C, rotação, para se obter 5 X 10 ¹⁰ culas ¹⁴ bacterianas.
      NOTA: A seguir à incubação durante a noite, as culas em cultura podem ser em qualquer fase de crescimento logarítmica ou estacionária. De crescimento muito lento estirpes celulares podem exigir tempos de incubação mais longo do que uma noite, ou a inoculação de um maior número de células, como determinado empiricamente.
2. Para todos os tipos de células, a transferência do meio de cultura contendo as células para 50 ml de tubo de polipropileno e centrifuga-se durante 3 min a 1500 x g.
3. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de todos os tipos de células em 1 ml de meio de cultura celular relevante.
4. Centrifugar todos os tipos de células em um tubo de microcentrífuga durante 1 min a 3900 x g. Completamente remover o sobrenadante.
5. Manter as células no gelo.

4. Liquefacção de gás GLP

Nota: Pega de azoto líquido com cuidado. Use equipamento de protecção individual, incluindo cryogloves e googles. O propano é potencialmente explosivo, de modo realizar a liquefacção em um espaço bem ventilado ou sob um exaustor de fumos. Não há chamas são permitidos.

1. Colocar aproximadamente 150 ml de azoto líquido num tabuleiro de poliestireno. Colocar um copo de bronze (altura 3,6 cm, diâmetro de 2 cm e uma espessura de 1,5 mm) em azoto líquido para congelar. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze.
2. Espere até que as bolhas desaparecem ter certeza de que a taça de bronze está congelado.
3. Coloque a mangueira ligada ao cilindro de gás em contacto com a parede da taça de latão.
4. Suavemente abrir a válvula de cilindro de gás propano.
   NOTA: Nesta etapa, o propano liquefaz no copo de bronze.
5. Pare a liquefacção fechando a válvula de cilindro de gás propano e rapidamente removendo a mangueira de gás.
6. Encher o tabuleiro de poliestireno com líquido nitrogen até 5 mm do topo da taça de latão. Não deixe que o nitrogênio líquido penetrar no copo de bronze.

5. Imersão de congelação da amostra

1. Colocar aproximadamente 200 ml de azoto líquido no tabuleiro de poliestireno. Congelar pequenos copos de latão (altura de 1,5 cm de diâmetro de 2,5 cm e espessura de 1 mm), colocando-os em azoto líquido. Colocar um copo para uma amostra de células em suspensão. Tenha cuidado para não misturar as amostras. Para este fim, colocar uma amostra no copo 1, a amostra 2, em forma de taça 2, etc.
2. Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido.
3. Mergulhar uma agulha de dupla extremidade de dissecção no sedimento obtido em 3.5.
4. Usando pinças, tomar uma malha de grade 400 microscopia de cobre revestida com Formvar preparada na secção 1.
5. Usando a agulha de dissecação, colocar uma gota do sedimento obtido em 3.5 em grelha. Tente diferentes tamanhos de gotas (por exemplo, 2, 5 e 10? L).
6. Muito rapidamente mergulhar a grade realizada pelas pinças em propano líquido geneavaliado na seção 4 e agitar a grade com movimento circular por alguns segundos.
7. Rapidamente transferir a grade congelada com a pinça para o pequeno copo de bronze congelado na secção 5.1.
   NOTA: Para cada amostra, fazer pelo menos 3 grades. Sempre congelar as pinças antes de tomar uma grade de cobre.

6. Freeze-substituição

NOTA: tetróxido de ósmio é potencialmente volátil, portanto, use um respirador purificador de ar com cartuchos de vapor. Congelamento do fixador em azoto líquido antes de mergulhar de congelação é também uma solução.

1. Para os estudos de ultra-estrutura, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.1. Para os estudos de imunolocalização, abrir os tubos de 1,8 ml criotubo contendo meio de congelamento-substituição preparada na secção 2.2. Coloque a tampa sobre os criotubos.
2. Congelar as pinças, mergulhando a sua ponta em azoto líquido.
3. Rapidamente remover a tampa e transferir as grades congeladas into as cryovials usando a pinça.
4. Coloque a tampa de volta nas cryovials.
5. Repita a operação para cada grade de cada amostra.
6. Fechar todas as tampas e agitar os criotubos com um movimento circular da mão para assegurar que as amostras são no meio de congelamento-substituição.
7. Colocar os frascos criogénicos numa caixa estanque ao ar, durante 3 dias em um congelador -84 ° C durante o processo de congelação-substituição.

Aquecimento 7. Amostra

1. estudos ultra-estrutura
   1. Transportar os criotubos em uma bandeja de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para um congelador de -30 ° C. Colocá-los no congelador -30 ° C durante 1 h.
   2. Coloque as criotubos em um congelador a -15 ° C durante 2 h. Colocar as amostras a 4 ° C durante 2 h e, em seguida, durante 30 minutos à temperatura ambiente.
   3. Remover o meio de substituição de congelação com uma pipeta de transferência de plástico. Adicionar aproximadamente 500 mL de 100% de acetona.
   4. Agita-se a 1,8 ml criotubocom um movimento circular da mão e rapidamente despeje a acetona (1,5 ml) contendo as grades em um frasco de vidro (altura de 3 cm e um diâmetro de 2 cm).
   5. Lavar o mesmo criotubo com 1 ml de 100% de acetona para ter a certeza de ter transferido todas as grades. Agita-se a criotubo com um movimento circular da mão e derramar o conteúdo do criotubo para um frasco de vidro.
   6. Lavar cada frasco de vidro com 3 mL de 100% de acetona 3 vezes durante 10 min.
   7. Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência ^15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina epoxi em acetona (25%, 50%, e 75%) e incorporar a amostra com resina epóxi de 100% em cápsulas de gelatina.
2. immunolabeling estudos
   1. Transportar os 1,8 criotubos ml num tabuleiro de poliestireno (para evitar um aumento repentino da temperatura) para a -30 ° C congelador.
   2. Colocar os frascos criogénicos de 2 h, num congelador de -30 ° C.
   3. Em -30 ° C congelador, agita-se o frasco de congelação com um movimento circular da mão e verter rapidamente o meio substituição congelamento num frasco de polipropileno (5 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro).
   4. Substituir o meio de congelamento substituição com 2 ml de meio de congelação-substituição fresco.
   5. Colocar o frasco de polipropileno durante 2 horas num congelador de -30 ° C.
   6. Lavar o frasco de polipropileno durante 1 hora com 2 ml de 100% de acetona e três vezes durante 1 h com 2 mL de etanol a 100%.
   7. Seguir os procedimentos de incorporação e de inclusão como descrito na referência ^15. Impregnar a amostra com concentrações crescentes de resina acrílica (25%, 50%, e 75% em acetona) e incorporar a amostra com uma resina acrílica de 100% em cápsulas de gelatina.

8. A visualização das Amostras

1. Após a incorporação, fazer 80 nm secções ultra-finas das amostras com um ultramicrotomo. Contrastar as secções com citrato de chumbo a 2% à temperatura ambiente durante 1 minAss = "xref"> 15.
2. Use um microscópio eletrônico de 80 kV ou 120 kV para observar as seções ¹⁵ .

Resultados

Neste artigo, um método de congelação fácil de usar e de imersão de baixo custo para ultra-estruturais (Figuras 1 e Figura 2) e estudos de imunomarcação (Figura 3) é apresentada. Nós demonstramos que não é necessário ter um equipamento especial para o processo de congelamento e de substituição e que o procedimento de aquecimento leva menos de 6 h, em vez das 24 h usando um sistema dedi...

Discussão

TEM é um método poderoso para a observação ultraestrutural de organelos, células e tecidos. Criofixação / congelamento-substituição é actualmente o melhor método para a preservação de ambos ultraestrutura e proteína antigenicidade. Fixadores químicos penetrar e actuar, desse modo permitindo que muito lentamente rearranjos estruturais antes da estabilização completa da ultra-estrutura ^2. Por outro lado, a criofixação / congelamento-substituição estabiliza instantaneamente estr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11