Plunge congélation: un outil pour les études ultrastructurales et immunolocalisation de cellules en suspension dans microscopie électronique à transmission

Résumé

Ce manuscrit décrit une méthode facile à utiliser et cryofixation à faible coût pour la visualisation des cellules en suspension par microscopie électronique à transmission.

Résumé

Microscopie électronique à transmission (MET) est un outil extraordinaire pour étudier ultrastructure cellulaire, afin de localiser des protéines et de visualiser des complexes macromoléculaires à très haute résolution. Toutefois, pour obtenir le plus près possible de l'état natif, parfait état de conservation de l'échantillon est nécessaire. fixation conventionnelle microscopie électronique (EM) avec des aldéhydes, par exemple, ne fournit pas une bonne conservation ultrastructurale. La pénétration lente de fixateurs induit une réorganisation cellulaire et la perte de divers composants cellulaires. Par conséquent, la fixation conventionnelle EM ne permet pas une stabilisation instantanée et la conservation des structures et antigénicité. Le meilleur choix pour examiner les événements intracellulaires est d'utiliser cryofixation suivie de la méthode de fixation gel-substitution qui maintient les cellules dans leur état natif. gel / gel de substitution à haute pression, qui préserve l'intégrité de ultrastructure cellulaire, est la méthode la plus couramment utilisée, mais nécessite expensive équipement. Ici, une méthode facile à utiliser et à la fixation de gel à faible coût, suivi par le gel de substitution des cultures de cellules en suspension est présentée.

Introduction

La préparation des échantillons est essentielle pour le succès de toute étude de microscopie électronique. Fixation classique EM est la principale méthode pour la fixation de tissu ou de cellules pour la microscopie électronique à transmission (TEM) ^1. Tout d'abord, des aldéhydes et du tétroxyde d'osmium sont utilisés pour fixer chimiquement le matériau à la température ambiante. Ensuite, le matériau est déshydraté avec des solvants organiques, infiltrés, et noyé dans une résine époxy. Cette méthode dépend de la vitesse de fixateurs de pénétration dans la cellule. Par conséquent, les artefacts et l' extraction des matières cellulaires sont habituellement observées ^2.

Cryofixation est clairement une meilleure alternative pour la préservation des structures cellulaires ^3, en les gardant intactes. La plus haute qualité d'images TEM ⁴ dans des coupes minces de résine peut être obtenue en utilisant la méthode de substitution cryofixation / gel. Le but de cette technique est d'obtenir vitrifié biéchantillons giques sans formation de cristaux de glace ou contenant des cristaux de glace suffisamment petites pour ne pas endommager l'ultrastructure des cellules. congélation à haute pression (HPF) et cryofixation ultra-rapide, qui est aussi appelé gel plongée (PF), sont deux méthodes pour cryofix échantillons. HPF immobilisant molécules dans la cellule instantanément et évite les dommages causés par la fixation classique EM. Plusieurs types de machines et d' appareils de substitution automatique de congélation ont été mis au point ^5. Les machines de congélation et consommables (azote liquide, porte - échantillons, etc.) sont chers, mais ils permettent de produire des micrographies électroniques de haute qualité ^{6, 7.} PF est une technique qui a été utilisée au début des années 1950 et est décrit dans la littérature aussi simple et pas cher ⁸ .Pendant la procédure PF, l'échantillon préparé est gelé à un rythme rapide pour obtenir des cristaux de glace taille inférieure à 3 à 5 nm. A cet effet, l'échantillon estplongé dans un cryogène liquide, tel que l'éthane, le propane, ou un mélange éthane-propane. Depuis les années 1950, l'amélioration de PF ont été fait pour rendre cette technique à un plus grand nombre d'utilisateurs. Congélation à haute pression est actuellement la seule solution viable pour geler une grande variété d'échantillons plus épais que 50 um (jusqu'à une épaisseur de 200 pm pour des échantillons en forme de disques) ^5, alors que PF est largement utilisé pour l' image des petits objets (<100 nm ), tels que des complexes macromoléculaires en suspension dans un film mince de glace amorphe ^9. Des échantillons plus importants, par exemple des cellules eucaryotes, peuvent être cryofixed par PF, mais nécessite des porte-échantillons, tels que des tubes en cuivre capillaire ou des systèmes sandwich ^{8, 10, 11.}

Ici, un rapide, facile à utiliser et plonger la technologie de congélation / gel de substitution à faible coût utilisable pour diverses cultures de cellules de suspension est présentée.

Protocole

1. Préparation de Formvar Grille Film

REMARQUE: Manipulez de chloroforme sous une hotte en utilisant un équipement de protection individuelle (gants, blouse de laboratoire, lunettes). Utiliser 400 grilles de cuivre de microscopie électronique maillage. Avec d'autres types de réseau (autres tailles de mailles, l'or et les grilles de nickel), la qualité du gel est pire.

1. Préparer une solution de 100 ml de 0,3% dans le chloroforme formvar. Laisser se dissoudre pendant la nuit sans agitation.
2. Mettre 400 mesh (nombre de trous par pouce carré) grilles de microscopycopper d'électrons (diamètre 3,05 mm) dans un flacon en verre (hauteur 3 cm et un diamètre de 2 cm) contenant de l'acétone. On agite le flacon de verre avec un mouvement circulaire de la main. Éliminer l'acétone avec une pipette de transfert en plastique. Laisser évaporer le solvant pendant 5 minutes. Transférer les grilles en les versant sur un papier filtre et les laisser sécher pendant 5 minutes.
3. Polir une lame de verre 76 x 26 mm ² en l' essuyant avec un chiffon non pelucheux jusqu'à brillant / glissant.
4. Prendre un cristallisoir (diamètre 15 cm, hauteur: 7 cm et de capacité 1200 ml) et de le remplir à ras bord avec de l'eau distillée. Nettoyer la surface de l'eau en passant une barre de verre au-dessus de la surface deux fois pour enlever la poussière.
5. Tenez la lame de verre entre deux doigts et le tremper dans la solution formvar pendant quelques secondes. Tenez-le debout sécher sous un bécher à l'envers pendant 5 min.
6. Lorsque le film est sec, marquer les bords de la lame de verre avec une lame de rasoir pour définir les limites du film à être délogés de la diapositive.
7. Prenez une grande respiration et expirez fortement sur la lame pour obtenir une couche de vapeur d'eau et sous le film pour rendre le film légèrement opaque et améliorer sa visibilité.
   1. flotter immédiatement le film sur la surface de l'eau de cristallisation en touchant le fond de la lame avec un angle d'environ 30 °. Laisser la sortie du film de la lame et de le retirer à la surface de l'eau de cristallisation. Tirez doucement sur le film de laPinces, si nécessaire.
8. Collez doucement les grilles vers le bas sur le film flottant sur la surface de l'eau dans les régions qui sont de l'épaisseur appropriée (environ 10 nm) et sans rides.
9. Retirez le film en recouvrant les grilles avec du papier Joseph alors qu'ils flottent sur la surface de l'eau cristalliseuse.
   1. En tenant le papier Joseph d'une main, touchez une extrémité du papier Joseph à une extrémité du film. Attendez que le papier Joseph soit complètement humide. Retirez le papier Joseph avec les grilles collées.
10. Placez les grilles pendant 24 h dans une boîte de Petri couverte pour le séchage final et le stockage avant utilisation à température ambiante.

2. Préparation du milieu de substitution au gel

REMARQUE: Le tétroxyde d'osmium (OsO ₄ ) et l'acétate d'uranyle sont des produits chimiques dangereux. Manipulez-les dans la hotte de fumée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié (EPI) comprenant une blouse de laboratoire et des gants. Follow les consignes de sécurité pour la manipulation (OSO ₄₎ et de l' acétate d'uranyle. Utilisez cryotubes O-ring pour éviter la fuite de OsO _4.

1. Des études ultrastructurales
   1. Mettez le verre OsO ₄ ampoule dans un flacon en verre.
   2. Briser l'ampoule en secouant le flacon.
   3. Ajouter un volume approprié de l'acétone à 100% pour obtenir une concentration finale de 4%.
   4. Remuer et distribuer aliquotes de 1,5 ml dans 1,8 ml cryoampoules.
2. Immunomarquage des protéines
   1. Placer 0,05 g d'acétate d'uranyle dans un flacon en verre.
   2. Ajouter 50 ml d'acétone à 100%.
   3. On agite la solution avec un agitateur magnétique. Lorsque la solution devient limpide, un filtrage en utilisant un filtre de 0,2 um.
   4. 1,5 ml aliquotes Distribuer dans 1,8 ml cryoampoules.
      NOTE: Préparer les cryotubes contenant un milieu de gel de substitution avant le processus de congélation d'eau froide et les garder à -84 ° C congélateur. Inverser le flacon de verre pour jeter leOsO ₄ ampoule dans les déchets dangereux.

3. Préparation des cellules

REMARQUE: Cette étape est essentielle pour le succès de la méthode. Pour tous les types de cellules, cultiver des cellules pour obtenir le nombre indiqué de cellules. Centrifugeuse dans le tube indiqué à l'heure indiquée et la vitesse.

1. Pour obtenir la consistance appropriée des granulés de différents types de cellules, les cellules se développer comme suit:
   1. Pour Saccharomyces cerevisiae et Schizosaccharomyces pombe, inoculer levure dans 5 ml de milieu liquide minimal ou complet. Incuber pendant une nuit à 28 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la densité optique à 600 nm (DO ₆₀₀₎ de la culture d'une nuit. Diluer les cellules de levure à une DO ₆₀₀ de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 28 ° C, en rotation, pour obtenir 1 x 10 ⁹ cellules de levure ^7.
   2. Pour flagelle Leishmania, inoparasites culer dans 5 ml de milieu AM avec 7,5% de FCS (sérum de veau foetal). Incuber pendant une nuit à 24 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la ₆₀₀ OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules parasitaires à une DO ₆₀₀ de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 24 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 ⁸ cellules de parasites ^12.
   3. Pour Trypanosoma brucei, inoculer parasites dans 5 ml de milieu SDM-79 avec 10% de FCS et 30 ug / ml d' hygromycine. Incuber pendant une nuit à 27 ° C, rotation (180 rpm). Mesurer la ₆₀₀ OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules parasitaires à une DO ₆₀₀ de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 27 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 ⁸ cellules de parasites ^13.
   4. Pour Escherichia coli, inoculer les bactéries dans 5 ml de milieu DYT avec 100 ug / ml d' ampicilline. Incuber pendant une nuit à 37 ° C, rotation (180rpm). Mesurer la ₆₀₀ OD de la culture du jour au lendemain. Diluer les cellules bactériennes à une DO ₆₀₀ de 0,2 dans 50 ml de milieu frais sélectif. Continuer à incuber les cellules à 37 ° C, en rotation, pour obtenir 5 x 10 ¹⁰ cellules bactériennes ^14.
      NOTE: Après une nuit d'incubation, des cellules en culture peuvent être en phase de croissance logarithmique ou stationnaire. souches cellulaires croissance très lente peuvent nécessiter des temps d'incubation plus d'une nuit, ou l'inoculation d'un plus grand nombre de cellules, comme déterminé de manière empirique.
2. Pour tous les types de cellules, le transfert du milieu de culture contenant les cellules à 50 ml tube en polypropylene et centrifuger pendant 3 min à 1500 x g.
3. Retirer le surnageant et remettre en suspension le culot de tous les types de cellules dans 1 ml du milieu de culture cellulaire pertinente.
4. Centrifugeuse de tous les types de cellules dans un tube de microcentrifugation pendant 1 min à 3900 x g. supprimer complètement le surnageant.
5. Gardez les cellules sur la glace.

4. Liquéfaction du propane

Remarque: Manipulez l'azote liquide avec soin. Utiliser un équipement de protection individuelle, y compris cryogloves et googles. Le propane est potentiellement explosif, effectuer la liquéfaction dans une pièce bien ventilée ou sous une hotte. Pas de flammes nues sont autorisées.

1. Mettre environ 150 ml d'azote liquide dans un plateau en polystyrène. Placer une tasse en laiton (hauteur 3,6 cm, diamètre 2 cm et d'épaisseur 1,5 mm) dans de l'azote liquide à congeler. Ne laissez pas l'azote liquide pénètre dans la coupe en laiton.
2. Attendez jusqu'à ce que les bulles disparaissent pour être sûr que la coupe en laiton est gelé.
3. Mettre le tuyau relié à la bouteille de propane en contact avec la paroi de la coupelle en laiton.
4. ouvrir doucement le robinet de la bouteille de propane.
   NOTE: A ce stade, le propane liquéfie dans la coupe en laiton.
5. Arrêter la liquéfaction par la fermeture du robinet de la bouteille de propane et de retirer rapidement le tuyau de gaz.
6. Remplissez le bac en polystyrène avec ni liquideTrogène jusqu'à 5 mm du haut de la cuvette en laiton. Ne laissez pas l'azote liquide pénétrer dans une tasse en laiton.

5. Congélation par immersion de l'échantillon

1. Mettez environ 200 ml d'azote liquide dans un bac en polystyrène. Congéler de petites cuvettes en laiton (hauteur 1,5 cm de diamètre 2,5 cm et épaisseur 1 mm) en les mettant dans de l'azote liquide. Mettez une tasse pour un échantillon de cellule de suspension. Veillez à ne pas mélanger les échantillons. À cette fin, mettre l'échantillon 1 dans la tasse 1, l'échantillon 2 en tasse 2, etc.
2. Geler les pinces en plongeant leur pointe dans de l'azote liquide.
3. Plongez une aiguille disséquante à double bord dans la pastille obtenue en 3.5.
4. À l'aide de pincettes, prenez une grille de microscopie de cuivre de 400 mesh recouverte de formvar préparée dans la section 1.
5. À l'aide de l'aiguille de dissection, placer une goutte de pastille obtenue en 3.5 sur la grille. Essayez différentes tailles de gouttes ( p. Ex. 2, 5 et 10 μL).
6. Plongez très rapidement la grille retenue par la pincette dans le gène du propane liquideclassé à l'article 4 et mélanger la grille avec un mouvement circulaire pendant quelques secondes.
7. transférer rapidement la grille gelée avec la pince à épiler à la petite tasse en laiton gelé dans la section 5.1.
   NOTE: Pour chaque échantillon, faire au moins 3 grilles. geler toujours la pince à épiler avant de prendre une grille de cuivre.

6. Gel de substitution

NOTE: Le tétroxyde d'osmium est potentiellement volatile, de sorte que l'utilisation d'un respirateur à adduction d'air avec des cartouches de vapeur. Gel de l'fixatif dans l'azote liquide avant la congélation d'eau froide est également une solution.

1. Pour les études de ultrastructure, ouvrez les 1,8 mL tubes contenant du milieu cryovial gel de substitution préparé dans la section 2.1. Pour les études immunolocalisation, ouvrez les 1,8 mL tubes contenant du milieu cryovial gel de substitution préparé à la section 2.2. Placez le bouchon sur les cryoampoules.
2. Congeler les pinces à épiler en plongeant leur pointe dans l'azote liquide.
3. retirer rapidement le bouchon et transférer les grilles congelés iNTO les cryoampoules utilisant la pince à épiler.
4. Mettre le bouchon sur les cryoampoules.
5. Répéter l'opération pour chaque grille de chaque échantillon.
6. Fermer tous les bouchons et remuer les cryotubes avec un mouvement circulaire de la main pour que les échantillons se trouvent dans le milieu de congélation-substitution.
7. Placer les tubes cryogéniques dans une boîte étanche à l'air pendant 3 jours dans un congélateur -84 ° C au cours du processus de congélation-substitution.

7. Le réchauffement de l'échantillon

1. Études de ultrastructure
   1. Transporter les cryotubes dans un plateau en polystyrène (pour éviter une augmentation soudaine de la température) dans un congélateur -30 ° C. Placez-les dans le congélateur -30 ° C pendant 1 h.
   2. Placer les cryotubes dans un congélateur -15 ° C pendant 2 h. Placer les échantillons à 4 ° C pendant 2 h et ensuite pendant 30 min à température ambiante.
   3. Retirer le moyen de substitution de congélation avec une pipette de transfert en plastique. Ajouter environ 500 pi de 100% d'acétone.
   4. Incorporer 1,8 ml cryovialavec un mouvement circulaire de la main et verser rapidement de l'acétone (1,5 ml) contenant les grilles dans un flacon en verre (hauteur de 3 cm et un diamètre de 2 cm).
   5. Rincer la même cryovial avec 1 ml de 100% d'acétone pour être sûr d'avoir transféré toutes les grilles. On agite le cryotube avec un mouvement circulaire de la main et verser le contenu du cryotube dans un flacon en verre.
   6. Rincer chaque flacon en verre avec 3 ml d'acétone à 100% 3 fois pendant 10 min.
   7. Suivez les procédures d'incorporation et d' inclusion comme décrit en référence ^15. Imprégner l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine époxyde dans de l'acétone (25%, 50% et 75%) et incorporer l'échantillon avec une résine époxy de 100% dans des capsules de gélatine.
2. Des études immunomarquage
   1. Transporter les 1,8 ml cryotubes dans un plateau en polystyrène (pour éviter une augmentation soudaine de la température) à -30 ° C au congélateur.
   2. Placer les tubes cryogéniques pendant 2 h dans un congélateur -30 ° C.
   3. Dans un -30 ° C congélateur, agiter le cryotube avec un mouvement circulaire de la main et verser rapidement le moyen de substitution de gel dans un flacon en polypropylene (hauteur 5 cm et diamètre 1,5 cm).
   4. Remplacer le moyen de substitution de gel avec 2 ml de milieu de congélation-substitution frais.
   5. Placer le flacon de polypropylene pendant 2 h dans un congélateur -30 ° C.
   6. Rincer le flacon de polypropylene pendant 1 h avec 2 ml d'acétone à 100% et trois fois pendant 1 heure avec 2 ml d'éthanol à 100%.
   7. Suivez les procédures d'incorporation et d' inclusion comme décrit en référence ^15. Imprégner l'échantillon avec des concentrations croissantes de résine acrylique (25%, 50% et 75% dans de l'acétone) et incorporer l'échantillon avec de la résine 100% acrylique dans des capsules de gélatine.

8. Visualisation des échantillons

1. Après enrobage, faire 80 nm sections ultra-minces des échantillons avec un ultramicrotome. Contraste sections avec 2% de citrate de plomb à la température ambiante pendant 1 minass = "xref"> 15.
2. Utilisation d' un microscope électronique à 80 kV ou 120 kV pour observer les articles ^15.

Résultats

Dans cet article, un outil facile à utiliser et la méthode de congélation chute à faible coût pour ultrastructurales (figures 1 et figure 2) et immunomarquage (figure 3) les études sont présentées. Nous démontrons qu'il est pas nécessaire d'avoir un équipement spécial pour la procédure de gel de substitution et que la procédure de réchauffement prend moins de 6 h au lieu des 2...

Discussion

TEM est une méthode puissante pour l'observation ultrastructurale des organelles, des cellules et des tissus. Cryofixation / gel de substitution est actuellement la meilleure méthode pour la préservation des deux ultrastructure et de protéines antigénicité. Fixateurs chimiques pénètrent et agissent très lentement , permettant ainsi réarrangements structuraux avant la stabilisation complète de l'ultrastructure ^2. A l' inverse, cryofixation / gel substitution stabilisent inst...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grids	Electron Microscopy Sciences	T400-Cu
Formvar	Electron Microscopy Sciences	15800
Propane N35
Liquid nitrogen
Double edge dissecting needle	Electron Microscopy Sciences	72947
Cryovials	Electron Microscopy Sciences	61802-02
Osmium tetroxide	Electron Microscopy Sciences	19130
Glass vial 8.5 mL	Electron Microscopy Sciences	64252
Uranyl acetate	Electron Microscopy Sciences	48851
Acetone	Sigma	32201
Ethanol 100%	Sigma	32221
Glass slides	VWR international	631-9439
Tweezers
Acrylic resin	Electron Microscopy Sciences	104371
Epoxy resin M	Sigma	10951
Epoxy resin M hardener	Sigma	10953
Dibutyl phtalate	Sigma	80102
Epoxy resin M accelerateur	Sigma	10952
Crystallizer	Fischer scientific	08-762-9
Joseph paper	VWR international	111-5009
Brass cups			do it yourself shop or made by yourself
Saccharomyces cerevisiae
Shizosacharomyces cerevisiae
Trypanosoma brucei
Leishmania amazonensis
Escherichia coli
Airtight box	Fischer scientific	7135-0001
Air purifying respirator	Fischer scientific	3M 7502
Cartridge for respirator	Fischer scientific	3M 6001
Particulate filter	Fischer scientific	3M 5N11